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LabonaChip
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nuestro finalNombre

Microbomba reciprocante microfabricada para administración

intracoclear de fármacos con almacenamiento integrado de
fármacos/líquidos y dosificación controlada electrónicamente

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Vishal Tandón,a,b∗Woo Seok Kang,a∗Tremaan A. Robbins,bAbigail J. Spencer,bErnest S.
Kim,bMichael J. McKenna,aSharon G. Kujawa,aJason ardiente,bErin EL Pararas,b
Mark J. Mescher,bWilliam F. Sewell,ay Jeffrey T. Borensteinb

La inaccesibilidad anatómica y farmacológica del oído interno es un desafío importante en el tratamiento farmacológico de
los trastornos auditivos. Esto también hace que la caracterización farmacocinética de nuevos fármacos con administración
sistémica sea un desafío, porque la eficacia va unida a la eficiencia con la que un fármaco puede alcanzar su objetivo. La
administración directa de fármacos a los líquidos cocleares evita las barreras farmacocinéticas y ayuda a minimizar la
toxicidad sistémica, pero las barreras anatómicas dificultan la administración de múltiples dosis sin un sistema de
administración automatizado. Un sistema de este tipo puede ser necesario para tratamientos de regeneración de células
ciliadas, que probablemente requerirán la administración programada de varios medicamentos. Para abordar estos desafíos,
hemos desarrollado una microbomba para control, administración automatizada de medicamentos en el oído interno con el
objetivo final de producir un sistema de administración implantable/portátil a largo plazo. La bomba actual está diseñada
para usarse con un soporte de cabeza para conejillos de indias en experimentos preclínicos de caracterización de fármacos.
En este sistema, hemos abordado varios desafíos de microfluidos, incluido el mantenimiento de una administración
controlada a velocidades de flujo bajas y seguras y la administración de medicamentos sin aumentar el volumen de líquido en
la cóclea. Al integrar un depósito de fármaco y todos los componentes fluídicos en la estructura de microfluidos de la bomba,
hemos hecho que el sistema de administración de fármaco sea robusto en comparación con sistemas anteriores que
utilizaban componentes separados conectados por tubos. En este estudio, caracterizamos las capacidades únicas de infusión,
extracción y dosificación bajo demanda de la bomba en modelos de laboratorio y animales con cobayas. Para los
experimentos con animales, Utilizamos DNQX, un antagonista del receptor de glutamato, como indicador fisiológico de la
administración del fármaco. DNQX suprime los potenciales de acción compuestos (CAP), por lo que pudimos inferir la
distribución y extensión del DNQX a lo largo del tiempo midiendo los cambios en los CAP en respuesta a estímulos en varias
frecuencias características.

1. Introducción
Uno de los principales obstáculos en el desarrollo de tratamientos farmacológicos
para los trastornos auditivos es que el oído interno es relativamente inaccesible.
aDepartamento de Otología y Laringología, Massachusetts Eye and Ear Infirmary y
Harvard Medical School, 243 Charles Street, Boston, MA 02139, EE. UU. Correo electrónico:
William_Sewell@meei.harvard.edu
bDirección de Ingeniería de Materiales y Microfabricación, Draper, 555 Technology Square,
Cambridge, MA 02139, correo electrónico: jborenstein@draper.com .
∗Vishal Tandon y Woo Seok Kang son coautores de este trabajo.
accesible, tanto farmacológica como anatómicamente. La presencia de la
barrera hematococlear limita el acceso a la cóclea de muchos fármacos
administrados sistémicamente.1–3Esta barrera se puede superar
administrando medicamentos directamente a los fluidos cocleares, un
proceso que también permite la aplicación segura de agentes que podrían
tener efectos secundarios sistémicos perjudiciales.4,5Sin embargo, la
inaccesibilidad anatómica de la cóclea dificulta la administración física de
múltiples dosis sin el uso de un sistema de administración automatizado.
Una alternativa a la administración intracoclear es administrar el

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fármaco en el oído medio y en la membrana de la ventana redonda (RWM),3,6

lo que puede ayudar a minimizar la toxicidad sistémica e intensificar la
eficacia terapéutica. Este método de administración, sin embargo, depende
de que los fármacos se difundan pasivamente hacia el oído interno a través
del RWM, y la cinética de este proceso de transporte es compleja.7
relativamente lento y puede ser impredecible. Como resultado, se sospecha la eficacia

potencial de la administración de RWM para moléculas grandes y complejas o fármacos

inestables. Por lo tanto, muchos candidatos a fármacos prometedores pueden ser

incompatibles con la administración de RWM, incluidas las proteínas del factor de

crecimiento,8-11ARNip y moléculas similares,12,13y vectores para terapia génica,14

estableciendo además la necesidad de un acceso directo al oído interno a través de un

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

sistema de administración intracoclear automatizado.

Un sistema de administración automatizado de este tipo requiere un

control fluido estricto debido al pequeño volumen de líquido (perilinfa) que
llena la cóclea y la alta sensibilidad del órgano auditivo al desplazamiento
mecánico. La perilinfa, un líquido extracelular similar en composición al
líquido cefalorraquídeo, baña las estructuras celulares de la cóclea y es el
lugar lógico para la administración de fármacos en la mayoría de los objetivos
cocleares. El oído interno humano contiene entre 150 y 200 µL de perilinfa,
15,16de los cuales sólo 50µResido en la rampa timpánica.15,17Los estudios en
animales indican que el daño coclear puede estar asociado con una
administración intraoclear prolongada a velocidades de flujo elevadas.18,19
Además de un control preciso de los volúmenes y tasas de flujo de
administración, un sistema automatizado para la administración intracoclear debe
ser lo suficientemente pequeño y liviano para implantarse cerca de la cóclea (el
hueso mastoideo es una ubicación ideal;20una solución con una porción
implantable y una porción portátil es aceptable) y lo suficientemente robusta como
para mantener una administración constante de volúmenes precisos de líquido en
el rango de submicrolitros durante períodos de tiempo que van desde días hasta
meses. Para aplicaciones de regeneración de células ciliadas, también será
importante que el sistema sea configurable para la administración de una serie
cronometrada de múltiples agentes,21regulado por un sistema de control
electrónico portátil, preferiblemente uno que permita la activación/desactivación
remota y cambios de dosificación en tiempo real.
Actualmente no existen dispositivos disponibles comercialmente capaces de
cumplir estos requisitos. Las bombas osmóticas son un ejemplo de microbomba
que se ha utilizado comúnmente para experimentos preclínicos que involucran la
administración de fármacos a través de una cocleostomía.22Sin embargo, las
bombas osmóticas no se pueden desactivar una vez que ha comenzado la infusión,
tienen cargas útiles limitadas y carecen de un control de flujo preciso. El
microcatéter de ventana redonda combinado con una microbomba Panomat se
utilizó clínicamente para administrar el fármaco por vía intratimpánica durante 4
semanas con resultados mixtos.23pero el sistema es demasiado grande para una
prestación a largo plazo y es susceptible a las deficiencias de la prestación de RWM.
Otras bombas comerciales de administración de medicamentos, incluida Medtronic
Synchromed (una bomba activa) e Isomed (una bomba pasiva), son demasiado
grandes para la implantación mastoidea. Las microbombas comerciales generales,
como la Bartels Mikrotechnik MP6, se pueden ensamblar con otros componentes
fluídicos en una entrega funcional.
Figura 1Fotografía de nuestra microbomba alternativa que comprende
microfluidos, una placa de circuito impreso (PCB) y 5 actuadores
electromagnéticos con accesorios asociados.
cada sistema.24Sin embargo, a medida que aumenta el número de componentes y
conexiones fluídicas entre ellos, dichos sistemas se vuelven menos robustos. La
administración de múltiples agentes requeriría al menos una bomba por
medicamento, por lo que los sistemas ensamblados con bombas comerciales
pueden volverse demasiado grandes.
Aquí describimos el rendimiento de una microbomba con capacidad de
administración automatizada de fármacos al oído interno. Diseñamos, fabricamos y
caracterizamos una microbomba alternativa que incorpora todos los elementos
microfluídicos esenciales en una estructura única e integrada (Figura 1). Como en
nuestros sistemas anteriores,24–26La bomba está diseñada para usarse en una
estructura montada en la cabeza para experimentos de administración de
fármacos a largo plazo en modelos animales de cobayas con el objetivo final de
hacerla implantable en la cavidad mastoidea humana. La microbomba se fabricó
laminando varias capas de polímero mecanizadas para formar estructuras de
microfluidos tridimensionales y luego montando actuadores electromagnéticos en
miniatura en los fluidos para controlar la válvula y la acción de bombeo. La
microbomba tiene un depósito de fármaco totalmente integrado al que se accede
mediante válvulas activas, lo que permite la dosificación del fármaco controlada
electrónicamente y la administración recíproca, lo que la hace adecuada para su
uso en experimentos preclínicos de caracterización de fármacos. La integración de
todos los componentes fluídicos reduce el tamaño y el peso del sistema con el
objetivo de producir un dispositivo implantable. y ayuda a hacerlo robusto para una
entrega constante durante largos períodos. En la Figura 2 se muestra un resumen
de las microbombas que, según se informa en la literatura, se han utilizado para la
administración de medicamentos en el oído interno, junto con las capacidades
agregadas con las nuevas generaciones de bombas.
Al diseñar este sistema, también abordamos varios desafíos de
microfluidos. En primer lugar, para mantener el volumen infundido al
mínimo, empleamos un esquema de entrega recíproca,18,21,24,25,27donde
se infunde fármaco concentrado en la rampa timpánica, se deja tiempo

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Bombas osmóticas der garantizar que se alcanzaran estos objetivos y que la bomba fuera
funcional para administrar el fármaco a un modelo animal. Sin embargo,
20
como la tecnología de bombeo subyacente que impulsa este sistema de

Volumen (µl)
infundido
Alzet 2ML1, 2ML2 y 2ML4
administración de medicamentos es versátil, una exploración completa del
• Pequeño, infusión a caudales bajos
• Sólo infusión continua
0
potencial de esta tecnología está más allá del alcance de este trabajo. Aquí,
• Control de flujo limitado
0 2
• No se puede detener una vez iniciado Tiempo (h) caracterizamos la microbomba midiendo los caudales de infusión y
• Cargas útiles limitadas

Microbombas de infusión extracción en la mesa de trabajo en función de la resistencia hidrodinámica

• Se requieren depósitos de medicamentos externos
agregada a la salida. En el banco, cargamos el depósito de fármaco con
• Se puede controlar el inicio/detención de la infusión
• Posibilidad de entrega pulsada
20 solución de fluoresceína y medimos la salida de fluorescencia de la bomba
Volumen (µl)
después de activar electrónicamente la dosificación del fármaco para
infundido

demostrar el control de la dosis.

30 milímetros

Tandon, et. Alabama. Bartels Mikrotechnik

MP6

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

BMM Microdesarrollo. 2015

• Electromagnético • Piezoeléctrico 0 También demostramos la administración recíproca en el oído interno y la

actuadores conductores
0 2
• Bidireccional • Unidireccional Tiempo (h)
dosificación controlada electrónicamente en el conejillo de indias, utilizando la
bombeo bombeo
1calleSistemas de entrega alternativos de generación bomba para infundir el fármaco a través de una cocleostomía realizada en la espira
basal. Para ello, cargamos el depósito del fármaco con un antagonista del receptor
de glutamato, DNQX, que interrumpe la transmisión sináptica entre las células
1
Volumen (µl)
infundido

ciliadas y el nervio auditivo, lo que produce una atenuación de los potenciales de

Kim, et. Alabama. Chip de laboratorio. 2014

• Entrega de volumen neto cero

0 acción compuestos (CAP) generados en respuesta a estímulos auditivos. Como
• Se requiere un depósito de medicamento externo

• La retirada se produce inmediatamente después de la infusión.

control de los efectos no específicos, monitoreamos las respuestas de las células
• Utiliza componentes 0 200
Tiempo (s)
comerciales y personalizados ciliadas (las emisiones otoacústicas del producto de distorsión (DPOAE), que no son
Este estudio - 2Dakota del NorteSistema de entrega alternativo de generación
alteradas por DNQX. Tanto los CAP como los DPOAE pueden obtenerse de regiones
específicas a lo largo del∼16 mm de longitud de la cóclea, lo que nos permite
10
controlar la distribución del fármaco durante las infusiones.
Volumen (µl)
infundido

• Entrega de volumen neto cero

• Reserva de medicamentos integrada

• Se pueden realizar varios pasos de infusión.

0 El desarrollo de un dispositivo para automatizar la administración intracoclear
ser programado antes del retiro
• Se puede ajustar el tiempo de espera 0 2 de agentes podría tener un gran impacto en el tratamiento de la pérdida auditiva.
Tiempo (h)
entre la infusión y la retirada

Aproximadamente 360 millones de personas en todo el mundo sufren pérdida

auditiva incapacitante, según estimó la organización mundial de la salud en 2012.28
Figura 2Comparación de tipos de bombas que incluyen diferentes generaciones de nuestros
sistemas de administración de medicamentos en el oído interno. A la derecha se muestran La forma más común de pérdida auditiva es la pérdida auditiva neurosensorial
representaciones de perfiles de infusión típicos. Para la bomba osmótica, la línea discontinua (SNHL), en la que el daño a las células sensoriales (ciliadas) o al nervio auditivo
indica la posible disminución del caudal con el tiempo. Por el primero altera la transducción o transmisión del sonido. Si bien los implantes cocleares han
En un sistema de administración alternativa de nueva generación, la escala de tiempo que se
logrado restaurar la capacidad auditiva de algunos pacientes con HNS grave,29
muestra es mucho más corta (del orden de minutos en lugar de horas) porque la extracción de
Avances recientes en la biología molecular de la audición.30–32son prometedores
líquido en ese sistema debe seguir inmediatamente a la infusión, por lo que la escala de tiempo
relevante es la de las carreras de bomba individuales. para los tratamientos farmacológicos para la SNHL. Se han identificado objetivos
farmacológicos y posibles compuestos terapéuticos para la regeneración de las
células ciliadas y las terminales nerviosas auditivas, así como para la protección
contra el daño causado por el ruido, los fármacos ototóxicos (como el cisplatino y
para difundirse, y luego el líquido infundido, ahora con una concentración de
los aminoglucósidos) y los efectos adversos de la radioterapia.
fármaco más baja, se retira, lo que conduce a una entrega neta con un aumento
neto de volumen de líquido nulo en la cóclea. En segundo lugar, utilizamos hy-
Resistencia drodinámica y cumplimiento para reducir el instantáneo.
2 métodos
tasas de flujo generadas durante el parto para reducir la posibilidad de
daño mecánico al oído interno asociado con el flujo. Finalmente, 2.1 Descripción general del sistema

minimizamos el volumen muerto en el sistema, particularmente en la Muchas microbombas comerciales basadas en membrana/diafragma utilizan
salida de la bomba, lo que ayudó a reducir la cantidad de bombeo válvulas de retención para lograr la rectificación del flujo y, por lo tanto, están
necesario para lograr la entrega. Esto es fundamental para la entrega limitadas al flujo unidireccional entre 2 puertos, es decir, flujo desde un
recíproca y también será importante para futuros sistemas diseñados depósito de fluido conectado a la entrada de la bomba hasta una tubería
para la entrega de múltiples agentes. conectada en la salida (p. ej., el Bartels Mikrotechnik MP6). Se pueden fabricar
Elegimos parámetros objetivo para la administración de fármacos en el oído interno (p. ej. sistemas más complejos combinando varias de estas bombas, pero sólo con
tasas de flujo, volúmenes de infusión y tiempos) basados en nuestro conexiones fluídicas adicionales (puntos potenciales de falla), mayor tamaño
trabajo previo en esta área. Caracterizamos nuestra microbomba en or- del sistema y mayor volumen muerto.

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ume. Nuestro diseño de microbomba emplea actuadores electromagnéticos en
miniatura, controlados electrónicamente y con direcciones individuales para
controlar la apertura/cierre de la válvula y el desplazamiento del diafragma de la
bomba. El funcionamiento por fases del actuador de la bomba con dos actuadores
de válvula cualesquiera da como resultado un bombeo neto de fluido de una
válvula a la otra. Este método de bombeo admite el flujo bidireccional entre los dos
puertos, así como la posibilidad de diseños de microfluidos para bombear entre un
número arbitrario de cámaras y puertos de bomba integrados, limitados
únicamente por restricciones de tamaño, peso y consumo de energía para una
aplicación determinada.
Hemos diseñado y fabricado una microbomba para la
administración de medicamentos en el oído interno que tiene 4
puertos seleccionables (Figura 3). Estos puertos están conectados a:
(i) un condensador fluídico grande utilizado para el almacenamiento
de fluidos, C; (ii) una salida que conecta con el objetivo de
administración del fármaco, O; (iii) la salida de un depósito de
fármaco integrado, R1; (iv) la entrada al depósito de fármaco
integrado, R2. Cada puerto está conectado de forma fluida a una
cámara de bomba central y cada uno está direccionado
individualmente con una válvula. Las válvulas normalmente están
cerradas, lo que significa que no se utiliza energía cuando están
cerradas y se debe suministrar energía a sus actuadores
electromagnéticos asociados para abrirlas o mantenerlas abiertas.
Para minimizar el consumo de energía para futuros experimentos
en los que la bomba funcionará con una batería,
La secuencia de eventos para la administración recíproca de medicamentos (Figura
4) es el siguiente: (i) se ejecuta un circuito interno de actualización de fármaco, transfiriendo el fármaco desde el
depósito de fármaco (puertos R1 y R2) a la línea principal de infusión y extracción (entre los puertos O y C); (ii) se infunde
fármaco en la cóclea (puertos O y C) y se drena algo de líquido del condensador de almacenamiento de líquido; (iii) los
dos primeros pasos pueden repetirse varias veces para dosis adicionales; (iv) después de que se ha permitido que el
fármaco se difunda durante algún tiempo, se extrae de la cóclea un volumen de líquido (puertos O y C) que es igual al
volumen infundido en los pasos (i) a (iii), rellenando el líquido condensador de almacenamiento. Este proceso da como
resultado una entrega neta de fármaco con un volumen de líquido neto cero añadido a la cóclea. El volumen muerto de
salida y la resistencia de salida son parámetros de diseño críticos en este esquema de entrega (están relacionados entre
sí). El volumen muerto de salida (los volúmenes sumados de los espacios de líquido entre la válvula de salida y la cóclea,
incluido cualquier tubo conectado a la bomba) debe minimizarse para limitar la cantidad de energía utilizada para
transportar el líquido desde la salida de la bomba hasta el cóclea. En un esquema de entrega recíproca, este volumen
muerto deberá eliminarse después de cada ciclo de retiro. La resistencia de salida reduce los caudales generados por la
bomba. Se puede agregar resistencia a la salida de la bomba para reducir los caudales por seguridad, pero esto también
agrega volumen muerto y puede reducir potencialmente la eficiencia energética. En un esquema de entrega recíproca,
este volumen muerto deberá eliminarse después de cada ciclo de retiro. La resistencia de salida reduce los caudales
generados por la bomba. Se puede agregar resistencia a la salida de la bomba para reducir los caudales por seguridad,
pero esto también agrega volumen muerto y puede reducir potencialmente la eficiencia energética. En un esquema de
entrega recíproca, este volumen muerto deberá eliminarse después de cada ciclo de retiro. La resistencia de salida
reduce los caudales generados por la bomba. Se puede agregar resistencia a la salida de la bomba para reducir los
caudales por seguridad, pero esto también agrega volumen muerto y puede reducir potencialmente la eficiencia
energética.
Los condensadores de fluidos adyacentes a cada válvula de la bomba mejoran la
eficiencia energética, ayudan a regular los caudales máximos y proporcionan
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almacenamiento de fluidos. Debido a las grandes constantes de tiempo asociadas
con la expulsión de fluido de la cámara de la bomba a través de canales de
microfluidos con gran resistencia, en algunas circunstancias sería necesario
mantener abiertas las válvulas durante varios segundos para que la cámara de la
bomba tuviera tiempo de drenarse/llenarse por completo. Sin embargo, los
condensadores entre la cámara de la bomba y los canales de microfluidos de alta
resistencia permiten una transferencia rápida de fluido dentro y fuera de la cámara
de la bomba seguida de un flujo de fluido pasivo asociado con el equilibrio de
presión de los condensadores. Esto minimiza la cantidad de tiempo que las válvulas
deben mantenerse abiertas (del orden de decenas de milisegundos) y, por lo tanto,
reduce el consumo de energía. Además, el condensador en la salida atenúa las
Manuscrito aceptado de laboratorio en chip
ráfagas de caudal generadas por los golpes de la bomba, reduciendo los caudales
máximos grandes a niveles más seguros.
Los condensadores de fluidos de la microbomba (incluida la cámara de la
bomba) son cámaras cilíndricas cuyos techos son delgados (25,4 µm),
membrana flexible de poliimida. El diámetro es la dimensión de diseño crítica
en estas cámaras que determina la capacitancia.33La cámara de la bomba
tiene un diámetro de 3,5 mm, el condensador de almacenamiento de fluidos
tiene un diámetro de 14 mm y todos los condensadores restantes (la salida y
ambos condensadores del depósito) tienen diámetros de 4 mm. La misma
membrana se desvía para bloquear el flujo en cada una de las válvulas. Las
cámaras de válvulas tienen un diámetro de 3,1 mm. El canal serpentino que
comprende el depósito de fármaco tiene una sección transversal cuadrada de
ancho 762µm y una longitud de 410 mm para un volumen total de 238µL.
Todos los demás microcanales de la bomba tienen un ancho de 400µm y una
altura de 254µmetro.
2.2 Materiales y Reactivos
Se obtuvieron láminas de polieterimida (PEI) de diversos espesores,
incluidos 0,254 mm, 1,5875 mm y 3,175 mm, de Mc-Master Carr
(Robbinsville, Nueva Jersey). Hojas de poliimida (76-µmetros y 25- µm de
espesor) se adquirieron en Fralock (Valencia, CA). Compramos láminas
de Viton de 0,25 mm de AAA-Acme Rubber Company (Tempe, AZ).
Películas adhesivas R/flex 1000 (12,7µm de espesor) se obtuvieron de
Rogers Corporation (Chandler, AZ). La placa de prototipos utilizada para
la fabricación de PCB (de doble cara, revestida de cobre y de 1,5875 mm
de espesor) se adquirió de Digi-Key (Thief River Falls, MN).
Se adquirió un tubo hipodérmico de acero inoxidable tipo 316 de tamaños
22-Ga (0,711 mm OD/0,406 mm ID) y 28-Ga (0,356 mm OD/0,178 mm ID) de
Vita Needle (Needham, MA). Dos tamaños de tubos de poliéter éter cetona
(PEEK) (360µm DE/150 µm ID y 360µm DE/100µm ID) se adquirieron en IDEX
Health & Science (Oak Harbor, WA). El tubo Tygon (0,76 mm de diámetro
exterior/0,25 mm de diámetro interior) para su uso en la fabricación de
cánulas se adquirió en Amazon (Seattle, WA). Se adquirieron tubos Tygon de
2,08 mm de diámetro exterior/0,25 mm de diámetro interior y de 1,524 mm
de diámetro exterior/0,508 mm de diámetro interior de Cole Parmer (Vernon
Hills, IL). Tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) para uso en la caracterización
de dispositivos (3,17 mm de diámetro exterior/1,57 mm de diámetro interior)
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Línea de infusión-retirada

Cóclea

Almacenamiento de fluidos

Condensador

Salida Bomba Condensador

Salida Cámara (P)
Válvula (O) Válvula (C) Droga
Salida Condensador
perilinfa
Depósito de drogas
Reservorio Reservorio
Válvula (R1) Válvula (R2)
(i) Circuito de actualización de fármacos
Depósito de drogas
Almacenamiento de fluidos
Entrada de cebado
Condensador
Cebado
Entrada
Reservorio Reservorio
Condensador Condensador

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Vista superior
(iii) Los pasos (i) y (ii)
(ii) Infundir
se pueden repetir
varias veces

(iv) Retirarse

Droga
Reservorio

Vista inferior

Fig. 3Fotografías superior e inferior retroiluminadas de la parte de microfluidos de

nuestra microbomba. Se laminaron varias capas de polímero para formar Figura 4Esquema que muestra el flujo del proceso para un ciclo de administración de fármacos,
.
estructuras de microfluidos tridimensionales. Las ubicaciones del actuador se incluidos los pasos de actualización, infusión y retirada del fármaco. Todas las válvulas están
identifican por O, P, C, R1 y R2. normalmente cerradas y se abren cuando se suministra energía. Los actuadores/válvulas que
están activos y suministraron energía en algún momento durante un paso en particular están
resaltados en rojo. Para mayor claridad, se muestra una versión simplificada del depósito de
fármaco.

se compró a Waters (Milford, MA). Tubos de PTFE para uso

en la fabricación de cánulas (201µm DE/101µm ID) se adquirió de 2.3 Fabricación de bombas

Zeus Inc. (Branchburg, Nueva Jersey). El fabricante grabó el tubo Fabricamos la parte de microfluidos de nuestra microbomba mecanizando

para facilitar la unión a los adhesivos. Fabricamos una cánula para características en láminas de polímero y luego laminándolas, como se

su inserción en la cocleostomía a partir de los tubos de PEEK, Tygon describió en nuestro trabajo anterior.26,33Las características de cada capa

y PTFE como se describe en nuestro trabajo anterior.26
El antagonista del receptor de glutamato, 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-
diona (DNQX), se adquirió de Fisher Scientific (Waltham, MA). Todos los
demás productos químicos y reactivos se compraron a
Sigma Aldrich (San Luis, MO). La solución de fluoresceína se preparó
disolviendo fluoresceína en agua desionizada a una concentración
de 0,1 mg/ml. Se preparó una solución de perilinfa artificial (AP)
combinando los siguientes reactivos, en mM: NaCl, 120; KCl, 3,5;
CaCl2, 1,5; glucosa, 5,5; HEPES, 20. El AP se tituló con NaOH para
ajustar su pH a 7,5 (Na total+concentración de 130 mM).27La
solución de DNQX comprendía DNQX disuelto en AP a una
concentración de 300µMETRO.
(Figura 5) se diseñaron utilizando el software SolidWorks y se convirtieron
para su uso con equipos de mecanizado utilizando scripts MATLAB escritos
internamente. Se utilizaron varios materiales diferentes en la construcción de
la estructura microfluídica (Tabla 1), incluidos: PEI para estructuras rígidas,
poliimida para membranas flexibles y Viton para cumplimiento/sellado fluido.
Las capas 1 y 9 se mecanizaron utilizando una mesa fresadora Quickcircuit
7000 XY (T-Tech, Norcross, GA), y las capas 2 a 7 se cortaron con un láser UV
LPKF ProtoLaser U3 (LPKF Laser & Electronics, Garbsen, Alemania). La
cubierta (capa 10) fue fabricada por el taller mecánico de Draper.
Las capas fluídicas 1 a 6 se laminaron juntas a alta temperatura y
presión (175◦C, aumentado a 5◦C/min y luego se mantuvo durante 1
hora; 2000 kPa de presión efectiva) utilizando adhesivo R/flex 1000.

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tabla 1Listado de las capas que componen nuestra microbomba, incluyendo

materiales y espesores. Las capas están numeradas comenzando desde la parte
10. Cubrir
inferior de la pila y los números corresponden a los que se muestran en la Figura 5.

Resortes del actuador

Núcleos del actuador # Descripción Material Espesor Mecanizado

1 Depósito de drogas PEI 1,5875 milímetros Convencional
9. Accesorio del actuador 2 Retorno de válvula PEI 254µmetro Láser ultravioleta

3 Base del asiento de válvula PEI 254µmetro Láser ultravioleta

Arandelas/Botones
4 Asientos de válvula vitón 254µmetro Láser ultravioleta

8. PCB del actuador 5 Punto muerto poliimida 76µmetro Láser ultravioleta

6 Membrana poliimida 25µmetro Láser ultravioleta

7 Capa compatible vitón 254µmetro Láser ultravioleta

8 PCB del actuador Prototablero 1,5875 milímetros Convencional

7. Capa compatible 9 Acrílico Convencional

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Accesorio del actuador 1.016 milímetros
10 Cubrir PEI 3,175 milímetros Convencional

6. membrana

La placa de circuito impreso (PCB) del actuador, capa 8, se enruta desde

5. Enfrentamiento
4. Asientos de válvula
3. Base del asiento de la válvula
2. Retorno de la válvula
1. Depósito de drogas
figura 5Esquema que muestra un despiece de las capas y estructuras que
componen nuestra microbomba. Las capas numeradas (1 a 6) se laminaron juntas
para formar la porción de microfluidos de la bomba que se muestra en la Figura 3.
Los microfluidos y las capas restantes se sujetaron con pernos (Figura 1). Las
descripciones detalladas de los materiales se muestran en la Tabla 1.
ing películas intercaladas entre las capas. La laminación se realizó en 3
etapas. Las primeras capas 1 a 3 se laminaron juntas. A continuación, la parte
inferior de la capa 4 se trató con plasma de oxígeno (PX-250 Plasma
Chamber, March Instruments, Concord, MA) durante 1 min a una potencia de
150 mW y una presión de 280 mTorr en una atmósfera de oxigenargón con
30% de O.2. Luego, la capa 4 se laminó en las capas 1 a 3. Durante la limpieza
y laminación con plasma, la capa de Viton se fijó en una abrazadera anular
mecanizada a medida para mantenerla plana. La cara superior de la capa 4
(ahora laminada con las otras capas) también se trató con plasma de oxígeno.
Finalmente, se laminaron las capas 5 y 6 al resto de la pila. Durante la
laminación final, la capa 6 (la de 25-µm membrana de poliimida) se mantuvo
bajo tensión con una deformación del 1,5%. Después de la laminación, se
insertaron tramos de 0,75 cm de tubo de acero inoxidable de calibre 22 en la
entrada de cebado del depósito de fármaco y en la entrada de cebado. Se
insertó en la salida un tubo de acero inoxidable de calibre 28 de 0,75 cm de
longitud. Luego se aplicó epoxi a todos los tubos de acero inoxidable y se
dejó curar.
una placa de prototipos revestida de cobre utilizando el enrutador
Quickcircuit 7000. Se soldó un conector de fuerza de inserción cero de 10
pines y paso de 0,5 mm (Samtec ZF5S, Samtec, New Albany, IN) a la PCB y se
usó para conectar la PCB a un controlador personalizado a través de un
conector plano Samtech FJH de 0,5 mm. cable flexible. Se utilizó un script Lab
View escrito internamente para ejecutar el controlador a través de un
dispositivo de E/S digital NI USB-6501 (National Instruments, Austin, TX). Para
los experimentos descritos aquí, el controlador era grande
(aproximadamente 10 cm x 20 cm x 5 cm) y se alimentaba desde un
tomacorriente de pared, pero el circuito de control se puede miniaturizar y
alimentar con batería. Los electroimanes anulares se mecanizaron a medida
en casa como se describió anteriormente.26Los cables de los imanes se
soldaron a la PCB del actuador.
2.4 Operación de la bomba
En la bomba completamente ensamblada, los electroimanes se
mantienen en su lugar mediante el dispositivo actuador acrílico (capa 9)
y se montan en la superficie del lado de la membrana de la estructura
microfluídica laminada con una capa de Viton compatible en el medio
(capa 7). La estructura completa se asegura mediante pernos insertados
desde la parte inferior de la pila fluídica laminada y roscados en la
cubierta (capa 10) situada en la parte superior de la bomba. Cuando los
electroimanes están apagados, los resortes mantienen los cabezales de
los actuadores (botones de policarbonato insertados en los centros de
las arandelas) presionados contra las capas fluídicas, desviando la
membrana de poliimida hacia los asientos de la válvula de Viton, lo que
da como resultado un sello fluídico (válvulas cerradas). Se abre una
válvula aplicando un pico de voltaje de 12 V al electroimán
correspondiente durante 2 ms,
El ciclo del actuador ubicado encima de la cámara de la bomba da como
resultado el desplazamiento del fluido, y el ciclo de dos válvulas cualesquiera en
una secuencia particular junto con la cámara de la bomba da como resultado un
flujo neto a través del dispositivo. En general, una válvula actúa como válvula de
admisión y otra válvula actúa como válvula de expulsión. Al comienzo de la carrera
de la bomba, la válvula de admisión se abre y luego el actuador de la bomba

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Tabla 2Resumen de diferentes tipos de carreras de bombas. Para cada tipo, la secuencia de disparo del actuador se muestra de izquierda a derecha. Los actuadores que están en estado
encendido están sombreados en verde. Las válvulas normalmente están cerradas y se abren cuando se suministra energía a sus actuadores asociados (es decir, las válvulas sombreadas
en verde a continuación están abiertas). Los tiempos enumerados en cada secuencia indican la cantidad de tiempo que los actuadores indicados se mantienen en estado encendido (a 2 V).
Cuando un actuador cambia de apagado a encendido, un pico de voltaje de 2 ms y 12 V precede a la retención. La ruta del flujo se indica con flechas rojas junto con el tipo de trazo. Para
mayor claridad, se muestra una representación simplificada del depósito de fármaco.

Tipo de trazo Secuencia del actuador

Se abre la válvula de admisión Consumo Cierra el Vale de Admisión Se abre la válvula de expulsión Expulsión Espere el equilibrio

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Infundir C (6 ms) CP (20 ms) P (6 ms) PO (6 ms) O (20 ms) Inactivo (5 s)

Retirar O (6 ms) OP (20 ms) P (6 ms) PC (6 ms) C (20 ms) Inactivo (5 s)

Actualización de drogas R1 (6 ms) R1-P (20 ms) P (6 ms) P-R2 (6 ms) R2 (20 ms) Inactivo (5 s)

se alimenta, lo que hace que el fluido sea aspirado hacia la cámara de la bomba
desde un condensador fluídico adyacente. A continuación, se cierra la válvula de
admisión. Luego se abre la válvula de expulsión, seguido de la desactivación del
actuador de la bomba, lo que hace que el fluido sea empujado fuera de la cámara
de la bomba hacia un condensador de fluido diferente. Finalmente, se cierra la
válvula de expulsión. Dependiendo de qué válvulas se elijan como válvulas de
admisión y expulsión, la bomba puede producir tres tipos diferentes de carreras de
bomba (Tabla 2): infusión (el líquido se bombea fuera de la bomba), extracción (el
líquido se bombea desde una fuente externa al bomba) y actualización del fármaco
(el líquido se bombea en un circuito dentro de la bomba, lo que da como resultado
la transferencia del fármaco fuera del depósito y hacia la línea principal de infusión
y extracción). Un ciclo completo de carrera de bomba para cualquiera de estos tipos
de carrera disipa aproximadamente entre 0,15 y 0,2 J.
Tubo de PTFE. Se utilizaron trozos cortos de tubo Tygon de DI de 0,25 mm
para realizar las conexiones entre la salida, el tubo de PEEK y el tubo de PTFE.
Se accionaron 40 golpes de bomba (infusión o extracción), lo que dio como
resultado que se bombeara agua dentro o fuera del tubo de PTFE. Se midió la
distancia recorrida por el menisco aire-agua y se utilizó para inferir el
volumen total bombeado. Luego, el volumen total se dividió por 40 para
obtener el volumen sistólico.
Medimos los caudales instantáneos generados en la salida de la
bomba utilizando un medidor de flujo de líquido Sensirion SLI-0430
(Sensirion, Stäfa, Suiza). Para todas las mediciones de caudal
instantáneo, 9 cm de 100-µSe conectaron tubos m ID PEEK a la
salida de la bomba y el sensor de flujo se conectó al PEEK, con
piezas de tubo ID Tygon de 0,25 mm como conectores. Los datos se
tomaron del sensor de flujo cada 6 ms.

2.5 Caracterización del rendimiento de la bomba

Para los esquemas de carrera de la bomba de infusión y extracción que se
muestran en la Tabla 2, caracterizamos el rendimiento de la bomba midiendo el
volumen transferido por carrera de la bomba, el volumen sistólico. Para estas
mediciones, la bomba se cebó con agua desionizada y la entrada de cebado de la
bomba se conectó a un depósito de agua mediante un tubo Tygon de 0,508 mm de
diámetro interior. La entrada de cebado del depósito de fármacos.
estaba bloqueado y la salida estaba conectada a un trozo de 1,57-
Tubo de PTFE de mm de diámetro interno, con una resistencia fluídica (que
consta de una longitud elegida de 100-µm tubo ID PEEK) entre la salida y el
2.6 Verificación de la dosificación controlada electrónicamente
Caracterizamos las capacidades de dosificación controladas electrónicamente de la
bomba (es decir, la carrera de la bomba de actualización del medicamento)
cargando el depósito de medicamento en la bomba con solución de fluoresceína y
luego midiendo la salida de fluorescencia de la bomba. Para estos experimentos, la
entrada de cebado se conectó a una toma de agua externa.
depósito mediante tubería Tygon. Para cebar el depósito de fármaco,
Quitamos los resortes de los actuadores O, P y R2. Como resultado, sólo se
cerraron las válvulas R1 y C. Luego se utilizó solución de fluoresceína.

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bombeado manualmente usando una jeringa en la entrada de cebado del t=0 50 minutos 70 minutos 74,2 minutos 124,2 minutos

depósito de medicamento hasta que se pueda ver goteando desde la salida

(al menos 0,5 ml). Luego se bloqueó la entrada de cebado del depósito de
fármaco reemplazando el tubo Tygon conectado por un trozo corto de tubo
Infundir Esperar Retirar Infundir ~10µl Detener la bomba
que había sido bloqueado en un extremo con epoxi. Luego se volvió a montar
~10µREGAZO 20 minutos ~10µl DNQX
la bomba con resortes sólo en las posiciones R1 y R2. Luego se lavó agua • 2 golpes de infusión • 50 sucesivos • 2 ciclos de • Observar
manualmente desde la entrada de cebado hasta la salida hasta que se cada 5 minutos retirar golpes 1 golpe de actualización (5 Recuperación
(5 segundos cada uno) segundos cada uno) y 1 infusión
eliminó toda la solución de fluoresceína de la línea de extracción de infusión
acariciar cada 5
• ~ 0,5µlitros por • ~ 0,2µlitros por
(la ruta de flujo que se muestra para la carrera de infusión en la Tabla 2). Una mín. (10 s por
ataque ataque
ciclo)
longitud de 9 cm de 100-µLuego se conectó el tubo m ID PEEK a la salida
• 20 infusiones
mediante un tubo ID Tygon de 0,25 mm y también se lavó con agua. Luego se
• 4,2 minutos en total
• ~ 0,5µl
golpes/50
infundido por ciclo

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

volvió a montar la bomba con resortes en todas las posiciones del actuador. total mínimo
• 20 ciclos/50
Luego se conectó la entrada de cebado a un depósito de agua externo. total mínimo

Figura 6Gráfico que describe el flujo de experimentos de administración de fármacos en

Se cargaron cada uno de sesenta pocillos de una placa opaca estándar de
96 pocillos (placa sólida negra de 96 pocillos Costar, Corning Life Sciences,
Tewksbury, MA) con 100µL de agua desionizada. 10-µLas alícuotas
dispensadas por la bomba (que comprenden 20 golpes de infusión cada una)
se recogieron en pocillos sucesivos. Para la primera alícuota y cada sexta
alícuota posterior (es decir, 1, 7, 13, etc.), se accionaron las pulsaciones de la
bomba de actualización de fármaco antes de las pulsaciones de la bomba de
infusión. Se probaron tres casos de dosificación diferentes en los que el
volumen infundido y, por tanto, el número de pulsaciones de infusión se
mantuvieron constantes, pero se varió el número de pulsaciones de
actualización del fármaco; una pulsación de actualización de fármaco por
cada pulsación de infusión (20 pulsaciones de actualización en total), una
pulsación de actualización de fármaco por cada dos pulsaciones de infusión
(10 pulsaciones de actualización en total) y una pulsación de actualización de
fármaco por cada tres pulsaciones de infusión (7 pulsaciones de actualización
en total y 21 pulsaciones de infusión en total para sólo en este caso). Luego
se midió la fluorescencia en los pocillos usando un lector de placas
(SpectraMax M2, Molecular Devices, Sunnyvale,
2.7 Procedimientos quirúrgicos y pruebas de audición
Todos los procedimientos quirúrgicos utilizados en este estudio fueron aprobados
por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Massachusetts Eye
and Ear Infirmary. Cuatro conejillos de indias machos, albinos, cada uno de los
, g.re obtenido
cuales pesa aproximadamente 350 de Charles River Lab-
oratories, Inc. (Los Hartley tren Wilmington,
; MA). los conejillos de indias
se anestesiaron usando a combinación de pentobarbital sódico, etc.
metro
(Nembutal; 25 mg/kg, i pormivía intraperitoneal), fentanilo (0,2
Nueva Jersey
mg/kg, por vía intramuscular) y haloperidol (10 mg/kg, por vía intramuscular).
Se administró lidocaína con epinefrina por vía subcutánea en el sitio de la
incisión como anestésico tópico. Medias dosis de cada fármaco.
se dieron al principio. En ese momento también se administró por vía subcutánea
una dosis de 0,04 mg/kg de atropina para reducir la secreción en las vías
respiratorias. Se administraron medias dosis adicionales de cada anestésico
aproximadamente cada hora para mantener la profundidad adecuada de la
anestesia durante la administración del fármaco y las pruebas de audición.
Usando un abordaje dorsal, un pequeño agujero (∼5 mm de diámetro-
conejillos de indias. Se enumera el momento aproximado de cada fase experimental. En un
experimento real, hubo retrasos adicionales en el tiempo de preparación.
ter) en la bulla, luego se creó una cocleostomía aproximadamente 0,5
mm distal a la membrana de la ventana redonda. La cánula proveniente
de la microbomba se insertó en la cocleostomía, se enroscó en la cóclea
3 mm apicalmente y se pegó a la bulla con un pegamento de
cianoacrilato común. Para mediciones de potencial de acción
compuesto, se utiliza un electrodo de alambre de plata aislado con
perfluoroalcoxi-alcano (203µm sin recubrimiento de diámetro, AM
Systems, Carlsborg, WA) se insertó cerca del nicho de la ventana
redonda y se pegó a la bulla.
Los procedimientos para medir las emisiones otoacústicas de
productos de distorsión (DPOAE) y los potenciales de acción compuestos
(CAP) se han descrito en nuestro trabajo anterior.26Los DPOAE se
midieron antes y después del procedimiento de cocleostomía (en las
frecuencias características: 32, 24, 16, 12, 8, 5,6, 4 y 2,78 kHz) para
monitorear cualquier daño que pudiera haber ocurrido como resultado
de la cirugía.
2.8 Administración aguda de fármacos en cobayas
Para experimentos de administración aguda de fármacos en conejillos de indias, primero
preparamos el fármaco res ervoir en th La bomba con solución DNQX utiliza
siguiendo el mismo procedimiento reutilizado para Cuando se bloqueó la entrada de
2.6. A continuación, el medicamentodepósito pri fluoresceína descrita en la sección ming,
r 100-µm ID PEEK tu bing y th se conectaron 9 cm de cánula e a la
salida de la bomba, y el resto de la bomba junto con el tubo de salida se
cebaron con AP. Una vez que la línea principal de infusión y extracción y
el tubo de salida se hayan lavado lo suficiente con AP para
Para eliminar la solución DNQX, se bloqueó la entrada de cebado.
Luego se insertó la cánula en una cocleostomía realizada en la región de la
cóclea entre 24 y 32 kHz y se enroscó apicalmente 3 mm, terminando en la
región de 12 a 16 kHz. Luego realizamos pruebas de audición DPOAE y CAP
para que sirvieran como mediciones de referencia antes del inicio de la
infusión de AP/fármaco. La bomba estaba

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luego se activa, iniciando la entrega de fluidos a la cóclea en la secuencia

descrita en la Figura 6. Aproximadamente 1µSe infundieron L de AP
(aplicando 2 golpes de infusión) cada 5 minutos hasta un total de
aproximadamente 10µSe administraron L de AP a la cóclea durante 50
minutos (20 golpes de infusión en total). Después de un tiempo de espera de
20 minutos, aproximadamente 10µSe extrajeron litros de líquido de la cóclea
realizando 50 golpes de extracción (son necesarios más golpes de extracción
en comparación con los golpes de infusión porque el volumen sistólico de
extracción fue menor que el volumen sistólico de infusión, como se analiza en
las secciones 3.1 y 4.1). Finalmente, iniciamos la entrega DNQX
(aproximadamente 1µL cada 5 min) accionando 2 ciclos de 1 golpe de bomba

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

de actualización de fármaco y 1 golpe de bomba de infusión cada cinco
minutos, hasta que se hayan activado un total de 20 ciclos (nuevamente,
aproximadamente 10µL de líquido entregado durante 50 min).
Durante la infusión, repetimos las mediciones de los CAP generados en
respuesta a tonos a 32, 24, 16, 12 y 8 kHz lo más rápido posible
(aproximadamente cada 20 minutos). Basado en nuestro trabajo anterior,26
figura 7Volumen entregado (o retirado) por carrera de la microbomba en función de la
No esperábamos que el DNQX alcanzara frecuencias más apicales en este resistencia hidrodinámica agregada a la salida. Una longitud de 9 cm de 100-µm ID PEEK,
período de tiempo, por lo que omitimos esas mediciones a favor de una tal como se utilizó en nuestros experimentos de fluorescencia y con animales,

mayor resolución temporal. También medimos los DPOAE durante la infusión corresponde a una resistencia de 0,61 kPa/(µl/min). Se muestran ajustes exponenciales
para ayudar a guiar el ojo. Las resistencias hidrodinámicas que se muestran aquí y a lo
(incluso en las frecuencias más apicales de 5,6, 4 y 2,78 kHz), pero solo
largo de este trabajo se calcularon utilizando la relación estándar derivada del flujo de
aproximadamente cada hora (no se esperaba que los DPOAE cambiaran, por Hagen-Poiseuille.
lo que no fue necesaria una alta resolución temporal para esas mediciones).
Antes de cada medición de DPOAE, revisamos el oído medio en busca de
perilinfa que pudiera haberse filtrado de la cocleostomía y eliminamos
piso a una frecuencia,F,se calculó a partir del espectro de magnitud DPOAE
cualquier líquido que estuviera presente mediante aspiración.
como el promedio de las magnitudes en 2 muestras de frecuencia anteriores
F,y 2 muestras de frecuencia a continuaciónF.El umbral era el SPL mínimo
Después de finalizar la infusión de DNQX, continuamos monitoreando la
requerido para generar un2F1−F2magnitud mayor que el ruido de fondo en2F
audición durante casi 3 horas para observar la recuperación. Durante la
1−F2. Las DPOAE se midieron aproximadamente al mismo tiempo en cada
recuperación, también medimos los CAP en respuesta a las frecuencias
experimento en relación con el inicio de la administración del fármaco, por lo
apicales y continuamos monitoreando los DPOAE cada hora.
que se promediaron directamente entre las réplicas biológicas.

2.9 Análisis de datos

Calculamos las amplitudes de CAP restando g los mínimos de la
formas de onda desde los máximos. En este análisis se ignoraron
los picos que fueron artefactos de filtros en el sistema acústico. El
umbral CAP se consideró como el nivel mínimo de presión sonora
(SPL, una medida de exposición al sonido) que generaba una
respuesta CAP con una amplitud de al menos 0,5.µV. Si un tone-pip
con SPL de 100 dB no generó una amplitud CAP igual o mayor a 0.5
µV, el cambio de umbral se fijó en 120 dB. Los umbrales y
amplitudes de CAP se agruparon en intervalos de 20 minutos para
que pudieran promediarse entre réplicas biológicas.
Los DPOAE son sonidos generados en la cóclea cuando es estimulada
por dos frecuencias de tonos puros,F1yF2, cuando la relación deF2
aF1está entre 1,1 y 1,3. Sirven como indicador del funcionamiento
de las células ciliadas. Para los DPOAE, medimos la magnitud de la 2
s
F1−F2respuesta (normalmente el producto de distorsión más
destacado), dondeF2fue la frecuenciaesde los tics del carácter, yF2/F1
t
era 1,2. El SPL deF1fue 10 dB mayor que el sombrero i
deF2. La nariz
3 resultados
3.1 Caracterización del rendimiento de infusión/retirada
Caracterizamos la capacidad de la microbomba para generar flujo tanto en
dirección directa (infusión) como inversa (retirada) contra diferentes cargas
midiendo el volumen sistólico en función de la resistencia de salida (Figura 7)
para los paradigmas de carrera de bomba estándar que se muestran en la
Tabla 2. Usamos diferentes longitudes de 100- µm Tubo ID PEEK conectado a
la salida para agregar resistencia. Sin carga, el volumen sistólico de la bomba
de infusión fue de 0,63µL, y disminuyó a aproximadamente 0,38µL con
resistencia de salida creciente. La carrera de retirada siguió la misma
tendencia general, pero el volumen sistólico fue menos de la mitad del
volumen sistólico de infusión para todas las cargas. Con base en estos datos,
elegimos operar nuestra bomba con 9 cm de 100-µm Tubo PEEK de diámetro
interior fijado a la salida (correspondiente a una resistencia hidrodinámica de
0,61 kPa/[µL/min]) para nuestros experimentos de infusión de fármacos.
Rendimiento de la bomba y volumen muerto de salida añadido (0,71µL) eran
aceptables con esta configuración.

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Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Figura 9El volumen sistólico de infusión es constante durante más de 1600 latidos
después de cierta dispersión inicial (probablemente debido a que el aire se asienta en el
sistema). Para obtener estos datos, la bomba se configuró para generar golpes de
infusión repetidamente. Una longitud de 9 cm de 100-µm ID PEEK y el sensor de flujo se
conectaron a la salida. Los volúmenes sistólicos se calcularon integrando los datos del
sensor de flujo. El volumen sistólico promedio fue de 0,42±0,02µl.
(a)

ración, y el tubo de salida todavía era lo suficientemente largo para viajar desde la bomba

hasta una cocleostomía en un conejillo de indias.

Con la bomba configurada como se describe anteriormente, medimos los

caudales instantáneos generados en la salida durante las carreras de infusión
y extracción de la bomba utilizando el medidor de flujo de líquido Sensirion.
El sensor de flujo se orientó de manera que los caudales positivos indican que
el fluido sale de la bomba y los caudales negativos indican que el fluido
ingresa a la bomba. Al comienzo de una carrera típica de bomba de infusión
(Figura 8a), hay un pequeño flujo negativo (-0,35µL/min) resultante de la
apertura de la válvula de expulsión, seguido de un pico mucho mayor en el
flujo positivo (54µL/min) correspondiente a la expulsión. Luego, el caudal
desciende aproximadamente exponencialmente hasta cero durante un
período de aproximadamente 5 segundos a medida que se drena el
condensador de salida. Para una carrera típica de la bomba de extracción
(Figura 8b), la válvula de expulsión está aislada del sensor de flujo, por lo que
no se observa una pequeña respuesta a la apertura de la válvula y solo hay
(b)
un gran pico de caudal (-16µL/min) seguido de decadencia. Para probar la
Figura 8F mira
w tasa generada por la bomba en función del tiempo después de (a) a consistencia de la carrera de infusión, configuramos la bomba con el sensor
soltero en fus e carrera de la bomba y (b) una sola carrera de extracción. Un 9 cm 00-µ de flujo como se describe anteriormente y activamos 1680 carreras de la
f 1m ID PEEK estaba conectado al tomacorriente. El volumen del derrame
longitud o
bomba (Figura 9). Medimos un volumen sistólico medio de 0,42µL con una
el infuso micerebral fue de 0,47.µL, y el volumen de la carrera de retirada. µl.
desviación estándar inferior al 4%.
era 0,2 2
También examinamos cómo la variación del tiempo de admisión durante la carrera de

una bomba afecta el volumen de carrera (es decir, el tiempo que los actuadores de

admisión y de bomba están encendidos; nominalmente 20 ms como se muestra en la

Tabla 2). Durante estos experimentos, el tiempo de retención de la válvula de expulsión se

fijó en 200 ms. El aumento del tiempo de admisión provocó un aumento en el volumen

sistólico (Figura 10) tanto para la bomba de infusión como para la de extracción.

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Manuscrito escrito
Figura 11Medición de mesa de la salida de volumen de fluido de la bomba en función del
tiempo para el mismo perfil de reciprocidad utilizado en nuestros experimentos con
animales. No pudimos usar un sensor de flujo para medir la producción de volumen
durante experimentos con animales, porque conectar un sensor de flujo en línea en la

(a) salida de la bomba agrega un volumen muerto inaceptable. Para este perfil, se
bombearon dos golpes de infusión cada 5 minutos, 10 veces (20 golpes de bomba de
infusión en total con un volumen total de 9,4µl). Después de una espera de 20 minutos, se
bombearon 45 pulsaciones de retirada, lo que llevó el volumen total de infusión a casi
cero.

en un chip de acceso
trazos. Cuando no se agregó resistencia hidrodinámica adicional a la salida
de la bomba, la variación del volumen sistólico con el tiempo de admisión
siguió una forma exponencial, con una constante de tiempo de 3,2 ms para la
carrera de la bomba de infusión y una constante de tiempo mucho más larga
de 43 ms para la carrera de la bomba de extracción. Cuando 9 cm de 100-µm
ID PEEK se agregaron a la salida, la relación entre el tiempo de admisión y el
volumen sistólico siguió siendo esencialmente la misma.
sNombre para la carrera de la bomba de infusión. Sin embargo, para la carrera de
extracción de la bomba, la constante de tiempo casi se triplicó a 117 ms.

Laboratorio
Durante la administración del medicamento, el líquido se bombea desde el gran

(b)
Figura 10Volumen de entrega (o retirado) por carrera de la bomba como una función del tiempo
del tiempo de ingesta (los am se en que la válvula de admisión y los actuadores de la bomba están
esto
condensador de fluido y luego se retira nuevamente al condensador en un
Alabama momento posterior. Para probar este flujo alternativo, configuramos el mp con
pu9 cm de 100-µm El tubo ID PEEK y el sensor de flujo conectaron a la salida como

mantienen en el poder apagados). En (a), no se agregó ningún tubo resistivo a

attse describió anteriormente, y ambas entradas de cebado
la salida, por lo que la resistencia de salida era baja: aproximadamente 5,4 Pa/(µL/min), fueron bloqueados. El tubo de salida del sensor de flujo se insertó en un
mientras que en (b), 9 cm de 100-µSe conectaron tubos de PEEK de diámetro interior de m a la depósito de agua. Luego se realizaron 2 golpes de infusión cada 5 minutos,
salida, lo que eleva la resistencia total de la salida a 0,62 kPa.µl/min). Para todos estos datos, el 10 veces (un total de 20 golpes de infusión). Después de un tiempo de espera
/( de retención de la válvula de expulsión fue
tiempo
de 20 minutos, se realizaron 45 golpes de retirada. El caudal,
ajustado a 200 ms, y el La resistencia de entrada fue de 0,9 Pa/(µl/min).
medido en función del tiempo durante todo este procedimiento, se
metro

integró para producir el volumen de infusión acumulativo en función del

tiempo (Figura 11). El volumen de infusión acumulado aumentó en 0,94µ
L durante cada uno de los pasos de infusión de 2 tiempos, y luego
disminuyó de nuevo a cero durante los 45 golpes de retirada.

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Línea de infusión-retirada
fluoresceína
Tubo de salida Agua
Colocado en 1er
Bien en el plato
Entrada de cebado
Conectado a
Agua Externa
Reservorio
Depósito de drogas
Lleno de fluoresceína

1 actualizar
Ataque

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

Para bien
Lámina

1 infusión 3 infundir
Ataque 2 infundir Trazos
Trazos

20 trazos de infusión y 20 20 trazos de infusión y 10 21 trazos de infusión y 7 trazos

trazos de actualización en total trazos de actualización en total de actualización en total
Depositado en pozo Depositado en pozo Depositado en pozo

repetir t
e trazos
Hasta las 20 - 21 infusores

Tener estado de postulado

en un pozo

Mover salida
Tubo al siguiente
Bien

20 infundir
Trazos
x20
Repetir un total de
5 veces

(a) (b)

Figura 12La dosificación del medicamento se inicia electrónicamente a pedido. La concentración eficaz del fármaco administrado se puede reducir reduciendo el número de pulsaciones
de actualización en relación con el número de pulsaciones de infusión. (a) Esquema que muestra el flujo del proceso para experimentos de fluorescencia que demuestran 3 esquemas de
dosificación diferentes. El depósito de fármaco de la bomba se cebó con solución de fluoresceína, mientras que el resto de la bomba se cebó con agua desionizada. Una mayor
proporción de infusión para refrescar trazos conduce a una mayor dilución de la dosis. Tenga en cuenta que se produce cierta dilución en todos los esquemas de dosificación debido al
volumen muerto (∼4µL) que debe ser aclarado al inicio de la dosis. Todo el proceso se repitió 10 veces en los pocillos posteriores de la microplaca para generar los datos que se muestran
en (b), lo que dio como resultado un total de 60 alícuotas recolectadas secuencialmente en pocillos individuales. (b) 10-µSe recogieron alícuotas L (20 golpes de infusión cada una)
dispensadas por la bomba en pocillos sucesivos en una placa de 96 pocillos. Para la primera alícuota y cada sexta alícuota posterior (es decir, primera, sietenorte º, decimotercero, etc.),
los golpes de actualización del fármaco se activaron antes de los golpes de infusión de acuerdo con uno de los esquemas mostrados en (a). Los datos de fluorescencia se normalizaron a
la concentración inicial de fluoresceína (0,1 mg/ml).

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3.2 Circuito de actualización de fármacos y dosificación controlada electrónicamente
Debido a que no teníamos un método preciso para monitorear las tasas de flujo/
volumen sistólico dentro de la bomba durante un ciclo de recarga de fármaco,
utilizamos fluoresceína como fármaco de prueba para medir la producción de
fármaco desde la bomba con dosificación controlada electrónicamente. Queríamos
asegurarnos de que (1) el medicamento se transfiriera con éxito desde el depósito
de medicamento a la línea principal de infusión/extracción y, finalmente, fuera de la
bomba, (2) las dosis del medicamento pudieran administrarse según demanda, (3)
no se infundiera ningún medicamento cuando se administrara el medicamento. no
se activaron las pulsaciones de actualización y (4) la dosificación fue
razonablemente repetible/controlable. Con base en estos criterios, evaluamos la
bomba recolectando∼10-µL alícuotas (que comprenden de 20 a 21 golpes de
bomba de infusión cada una) dispensadas por la bomba en pocillos de microplacas
sucesivos. Dosificamos activamente solo cada sexta alícuota con fluoresceína,
comenzando con el primer pocillo (Figura 12a).
Probamos tres esquemas de dosificación diferentes, donde el número total de
pulsaciones de infusión se mantuvo constante (20 a 21 pulsaciones) y variamos el
número de pulsaciones de actualización: 1 pulsación de actualización del
medicamento por cada pulsación de infusión (20 pulsaciones de actualización en
total), 1 pulsación de actualización por cada 2 pulsaciones de infusión (10
pulsaciones de actualización en total) y 1 pulsación de actualización por cada 3
pulsaciones de infusión (7 pulsaciones de actualización en total). Para cualquier
alícuota a la que se le administró fluoresceína, se repitió uno de estos esquemas
hasta que se activaron un total de 20 (21 para el esquema de 7 pulsaciones de
actualización) de la bomba de infusión. Para todos los esquemas de dosis, los
pocillos dosificados activamente eran fluorescentes, lo que indica que la
fluoresceína se administró exitosamente a esos pocillos (Figura 12b). El esquema de
20 golpes de refresco produjo la dosis promedio más alta, 0,58±0,04 de la
concentración de fluoresceína original (n = 10). Los esquemas de 10 golpes de
actualización y 7 golpes de actualización produjeron dosis promedio de 0,48±0,07 y
0,28±0,02, respectivamente. Para todos los esquemas, los pocillos inmediatamente
después de los pocillos dosificados activamente también eran fluorescentes, con
concentraciones normalizadas de 0,76.±0,06, 0,41±0,04 y 0,22±0,02 para los
esquemas de 20 tiempos de actualización, 10 tiempos de actualización y 7 tiempos
de actualización, respectivamente. Para el esquema de 20 pulsaciones de
actualización, estos pocillos tenían una concentración promedio de fluoresceína
más alta que los pocillos dosificados, lo que probablemente resultó de que el
volumen sistólico de actualización fue significativamente mayor que el volumen
sistólico de infusión (ver discusión). En los pocillos posteriores a una dosis, la
concentración de fluoresceína cayó rápidamente a casi cero.
3.3 Administración aguda de fármacos intracocleares en cobayas
Evaluamos la seguridad y eficacia del uso de nuestra microbomba para la
administración intracoclear aguda de fármacos. Comenzamos con la
administración recíproca de AP para poder cambiar electrónicamente a la
administración de un fármaco de prueba más adelante y demostrar la dosificación
según demanda. Utilizamos DNQX como nuestro fármaco de prueba y
monitoreamos los cambios en la audición en función del tiempo y la frecuencia del
sonido para evaluar la eficacia de la administración. DNQX, un antagonista del
receptor de glutamato que suprime los CAP sin afectar los DPOAE,34–36
se ha utilizado como indicador fisiológico porque los cambios dependientes de la
frecuencia en las amplitudes y umbrales de CAP en respuesta a la administración
de DNQX a lo largo del tiempo pueden usarse para inferir la distribución del
fármaco en la cóclea.18,24,26,27
Como se esperaba, los cambios en el umbral de DPOAE fueron
mínimos durante la administración AP recíproca, la administración
DNQX y el período de recuperación posterior a la administración en
todas las frecuencias probadas, entre 2,78 y 32 kHz (Figura 13).
Durante la infusión y retirada de AP, las elevaciones del umbral de
CAP fueron inferiores a 15 dB en todas las frecuencias medidas.
Después del inicio de la entrega de DNQX, los umbrales de CAP se
Manuscrito aceptado de laboratorio en chip
volvieron más elevados en todas las frecuencias monitoreadas (8–
32 kHz), donde los umbrales se elevaron en al menos 33 dB en
todas las frecuencias. La mayor elevación observada (75 dB) se
produjo a 16 kHz al final de la entrega DNQX. La elevación máxima
del umbral a 8 kHz (33 dB) ocurrió aproximadamente 1 hora
después de que se apagó la bomba, mientras que las elevaciones
máximas en las otras frecuencias observadas (basal al sitio de la
cánula o cerca de él) ocurrieron al final de la administración de
DNQX o justo después. .
De manera consistente con las elevaciones del umbral de CAP, las amplitudes de
CAP comenzaron a disminuir después del inicio de la administración de DNQX en
todas las frecuencias observadas (Figura 14). Para las frecuencias cercanas al sitio
estimado de la cánula (12 y 16 kHz) y todas las frecuencias basales a ese sitio, la
amplitud mínima de CAP se observó al final de la administración de DNQX. A 8 kHz,
una ubicación apical al sitio de la cocleostomía, la amplitud mínima de CAP se
observó aproximadamente 1 hora después de que se apagó la bomba. La mayor
reducción en la amplitud de CAP (un factor de 40) se produjo a 16 kHz. Hubo menos
supresión de amplitud de CAP más lejos del sitio de infusión, ya que las amplitudes
a 32 y 8 kHz solo se redujeron en un factor de 5 a 7. También hubo cierta reducción
en las amplitudes de CAP durante la administración recíproca de AP, lo que
probablemente se debe a una pequeña cantidad de DNQX que quedó en la
infusión/extracción como un artefacto del procedimiento de cebado de la bomba.
Durante la administración AP, la mayor disminución en la amplitud de CAP, también
observada a 16 kHz, fue un factor de 2,7 (en comparación con la reducción de 40
veces durante el período de administración del fármaco). Después de la infusión
AP, el tiempo de espera de 20 minutos en el que la bomba estuvo apagada y la
retirada de aproximadamente 10µL de líquido de la cóclea, las amplitudes de CAP
se recuperaron (aumentaron) ligeramente a 32, 24, 16 y 12 kHz, mientras que la
amplitud disminuyó ligeramente a 8 kHz. Las reducciones dependientes de la
frecuencia en las amplitudes de CAP (visualizadas más claramente en la Figura 15) y
la recuperación después de la retirada son consistentes con la administración de
una concentración baja (<100µM) de DNQX26durante la primera fase de entrega
recíproca. Como fue el caso con los umbrales de CAP, después de que se apagó la
bomba después de la administración de DNQX, hubo recuperación (un aumento en
la amplitud de CAP) en todas las frecuencias y las amplitudes regresaron a niveles
cercanos al valor inicial aproximadamente entre 1,5 y 2 horas después del CAP
mínimo. Se observaron amplitudes. GORRA
j nuestro
n/y o / Aa mí,[year], [volumen
AN .],–19
1 | 13
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Figura 13Los umbrales de CAP (líneas continuas, círculos cerrados) y DPOAE (líneas discontinuas, círculos abiertos) cambian en función del tiempo durante la infusión de AP, la extracción
de líquido y la infusión de DNQX en una cóclea de cobaya. La infusión AP comenzó en t = 0, y los cambios se calcularon con respecto a las mediciones tomadas justo antes de t = 0. Las
áreas sombreadas en gris (t = 0 a t = 0,83 horas) representan los tiempos durante los cuales se infundió perilinfa artificial. Las áreas sombreadas en azul (t = 1,17 a t = 1,24 horas)
representan los tiempos durante los cuales se extrajo líquido de la cóclea. Las áreas sombreadas en amarillo (t = 1,38 horas a t = 2,22 horas) representan los tiempos durante los cuales se

Manuscrito aceptado de laboratorio en chip

ejecutó una bomba de actualización de fármaco antes de cada bomba de infusión, lo que dio como resultado la infusión de DNQX en la cóclea. En las zonas sin sombra, la bomba estaba
inactiva. Los asteriscos para los umbrales de CAP indican puntos de datos que son la media de 3 o 4 réplicas biológicas, y las barras de error en esos puntos representan el error estándar
de la media. Todos los demás puntos de datos del umbral de CAP tuvieron menos de 3 réplicas. Todos los umbrales de DPOAE mostrados son la media de 4 réplicas biológicas, con barras
de error que representan el error estándar. En los casos en los que no hubo respuesta del CAP, los cambios del umbral del CAP se establecieron en 120 dB.

Figura 14Amplitud de CAP en función del tiempo en respuesta a estímulos de tono de 60 dB durante la infusión de AP, la extracción de líquido y la infusión de DNQX en
una cóclea de cobaya. Consulte la Figura 13 para ver la notación.

No se observó supresión de amplitud en ningún momento durante o después Ofrece volúmenes de embolada repetibles en más de 1000 emboladas de bomba
del parto para frecuencias inferiores a 8 kHz (monitoreada solo después de (Figura 9). La mayor parte de la dispersión en los volúmenes sistólicos que se
que se apagó la bomba). muestran en la Figura 9 se produce al principio del experimento y probablemente

La distribución del fármaco a través de la cóclea a lo largo del tiempo se se debe a burbujas de aire que se asientan en el sistema. Curiosamente, la bomba

visualizó mediante gráficos de imágenes de amplitud de CAP y cambio de es menos de la mitad de efectiva para bombear fluido en la dirección de extracción

umbral (Figura 15). Los efectos de DNQX se observaron por primera vez cerca que en la dirección de infusión. Esto se debe a una combinación de baja

del sitio estimado de la cánula a 12 y 16 kHz, y también rápidamente en capacitancia de salida y alta resistencia de salida. Durante la fase de admisión de

frecuencias basales al sitio de la cánula. El DNQX comenzó a extenderse una carrera de extracción, el actuador de la bomba recibe energía y el botón

hacia la a pex lat mi

r. AFtejem
thmipudiputadose apagó, la recuperación fue la situado encima de la cámara de la bomba se retrae. Esto da como resultado la

observado en la mo stuberculosis
s yo
Automóvil frecuación
club uenci
británico primera y en las zonas más apicales restauración pasiva de la membrana sobre la cámara de la bomba y la aspiración

frecuencianorte cies lagua. de fluido desde el condensador de salida. Debido a que este proceso es pasivo, es
impulsado por la ecualización de presión entre la cámara de la bomba y el capacitor
4Di escudería ssio norte de salida.

4.1Ptu diputado realizar metro unCmi Durante este equilibrio, el fluido fluirá desde el exterior de la bomba hacia
Cifra 7, el EP tu
Como se muestra en MP metroaintained su capacidad para generar todas el capacitor de salida, y tanto la cámara de la bomba como el capacitor de
flujo neto en b otro el infa nosotros
miundw élhdrlas direcciones a medida que se agrega salida llegarán finalmente al equilibrio de presión con la fuente de fluido
salidar esist ance w asi norteCreased FROM0 a 1,4 kPa/(µl/min). mph externa, si se le da el tiempo suficiente. Sin embargo, debido a que la
la hidrosta tic pre ssurmiinortethmiEducación rily de cobayas típicas
física resistencia de salida es alta, la escala de tiempo para el flujo de fluido desde
, 37–41 entonces
rangosF ROM 0,1–0,4 kPensilvania t h miLa bomba puede mantener la distribución del fluido. el exterior de la bomba al interior de la bomba es larga en comparación con
lugarmi no es uncontra t yFoto
ap
yohola
sioh
mira ical presiones encontradas en
gramo la cantidad de tiempo que se mantiene abierta la válvula de salida. En otras
el caudal bed i tHola
s descripción s sttudy con un margen de seguridad para cualquier
norte palabras, la bomba extrae casi todo el volumen sistólico del condensador de
zuecos que m sí desarrollador mi
podar i thmi tem. Además, la bomba
norte sistema salida.

14 |j nlnuestraaNaa mí,[yea[
r], .],–91 1
volumen
Página 15 de 19 Laboratorio en un chip

En nuestro diseño, el capacitor de salida tiene una capacitancia que es

mayor pero comparable a la de la cámara de la bomba (4 mm de diámetro
frente a 3,5 mm de diámetro), por lo que el estado de equilibrio es aquel en el
que la cámara de la bomba no está completamente llena (la membrana no
completamente a su posición plana y de equilibrio). Por otro lado, para la
carrera de infusión, la cámara de la bomba extrae fluido del capacitor de
almacenamiento de fluido mucho más grande (14 mm de diámetro), por lo
que se llena casi por completo durante la fase de admisión, como la
eliminación de un volumen de carrera del capacitor de almacenamiento de
fluido. cambia mínimamente su presión. El rendimiento de extracción se

ac p ed manuscrito
puede mejorar aumentando el diámetro del condensador de salida para
aumentar su capacitancia.33pero esto también aumentaría su volumen
muerto. Elegimos el diámetro del condensador de salida como un
compromiso entre el rendimiento de la carrera de extracción y el volumen
muerto.

Verificamos que el mecanismo descrito anteriormente explica el

rendimiento reducido de la carrera de retirada al examinar el efecto del
tiempo de retención del actuador de admisión en el volumen de carrera
(Figura 10). Esperábamos que aumentar la cantidad de tiempo que los
actuadores de admisión y de bomba se mantuvieran en el estado encendido
permitiría que se aspirara más fluido a la cámara de la bomba desde fuera de
(a)
la bomba, lo que daría como resultado un mayor volumen de carrera. Al

pCmit
medir el volumen sistólico en función del tiempo de admisión, medimos
efectivamente la constante de tiempo para el equilibrio de presión de la
cámara de la bomba con fuentes de fluido externas a presión atmosférica.

Para la carrera de infusión, la constante de tiempo RC para este

l ab en un capítulo
equilibrio está definida por la resistencia de entrada, 0,9 Pa/(µL/min), y
la capacitancia equivalente del condensador de almacenamiento de
fluido y la cámara de la bomba en serie. Para la carrera de retirada, la
constante de tiempo está definida por la resistencia de salida: 5,4 Pa/(µ

i
L/min) sin PEEK y 620 Pa/(µL/min) con 9 cm de 100-µm ID PEEK y la
capacitancia equivalente del condensador de salida y la bomba c
hamiembro en serie. Debido a que la capacitancia de la cámara de la bomba,
Cpag,es s ayo ler que la capacitancia de salida o la capacidad de almacenamiento de fluido.
metro

age ca Ci Carolina del Norte e, la capacitancia equivalente tanto para la infusión

Pensilvania
ejército de reserva

und thmiwélhdraw cae entreCpag/2yCpag(Para infundirlo

es cperder r tohCpag, y para el retiro está más cerca deCpag/2).El
uivale t CLa apacitancia, por lo tanto, difiere entre la infusión y la
ecuación norte
(b)
hdraw porcomo máximo un factor de 2, por lo que las diferencias en el tiempo
ingenio

fi gramo. 1 5 soy ge pl oh ts de (a)C AP threshoh ld sh si un re (b) norma alizar d PAG

California ntb y wmi
personal es infundir y retirar están dominados por las diferencias
a plitu DEAs función ciones de ti e und
metro metro frecuencia uenc rmercolor
y. Washington esent
representante enhidr dy ohametro resistencia ic.
norte

comensal escuchar ing lo ss (la más t horas hviejo cambios, pequeño es CA pa plitu des).
X mi ed, aumentar el tiempo de ingesta aumentó el derrame cerebral
gramo metro

APAG infusión bega en t= 0, un y volverregiones de APAG

norte infusión, con drawatierra como episodio Connecticut

DNQX infusi en ar e indio cated . Para (b), t he color b ar es o na lo g scale, un d norte

ume Fohdebido a una forma exponencial saturada tanto para el
volumen todos

thy CA ps wmi reg mi nerated en resp. uno a 60 - dBt oh ne-pIP STI uli. mi
metro dolor fuse und con i trazos (Figura 10). La constante de tiempo RC
Pixel re presmi nts t hellos mi
un de arriba t oh4 bis oh
logiCal re pag
licat mi
s. para el pesohdi La entrada cruda fue un factor de 13,4 mayor que la
para i F nue,
entrada s principalmente debido al tubo de acero inoxidable más
steresistente
bi (28 Ga) en la salida en comparación con la entrada (22). La
gramo

h d de tubería PEEK en la salida no afectó el medio ambiente.

instalación
Georgia

timón ant para el golpe de infusión mucho (aumentó en un factor

norte
calle

de1.3) segundo
, mi uso que el tubo no estuvo involucrado en la fase de ingesta
California

j nuestro
n/y o / Aa mí,[year], [volumen
AN .],–19
1 | 15
 Laboratorio en un chip
del golpe de infusión. Sin embargo, la resistencia adicional del tubo de
PEEK aumentó la constante de tiempo para la entrada de extracción en
un factor de 2,7.
4.2 Caudales seguros
En nuestro trabajo con nuestra microbomba de sólo infusión de la
generación anterior,26Intentamos limitar los caudales máximos a menos de
10µL/min para evitar posibles daños debido a altos caudales. En ese trabajo,
aumentamos la resistencia en la salida hasta que los caudales estuvieron por
debajo de 10µL/min. Habíamos utilizado datos DPOAE generados en estudios
anteriores,18en el que se utilizó una bomba de jeringa para la administración,
para estimar este caudal máximo seguro para este tipo de administración
pulsada (el medicamento se administra en ráfagas cortas de flujo al caudal
máximo que duran del orden de cientos de milisegundos, a intervalos del
orden de cientos de milisegundos). orden de minutos). Nuestro diseño actual
de microbomba (con 9 cm de 100-µm ID PEEK conectado a la salida) genera
pulsos de flujo con picos en el rango 45–55µRango de l/min para carreras de
bomba de infusión y en el rango 13-18µRango de L/min para carreras de
bomba de extracción (Figura 8).
Para la microbomba de la generación actual, no pudimos agregar
arbitrariamente resistencia a la salida de la bomba para reducir los caudales
máximos, porque tuvimos que considerar el rendimiento de la carrera de
extracción y el volumen muerto, parámetros que son críticos para el
suministro alternativo. La adición de resistencia de salida afecta la carrera de
retirada con más fuerza que la carrera de infusión, por lo que elegimos
agregar la máxima resistencia de salida posible para la cual el rendimiento de
la carrera de retirada aún era adecuado. Aumentar la capacitancia de salida
aliviaría la disparidad entre las carreras de infusión y extracción, pero
también agregaría un volumen muerto inaceptable. A pesar de que los
caudales máximos generados por el dispositivo de la generación actual
fueron cinco veces mayores que nuestro límite de seguridad típico, no vimos
evidencia de daño mecánico durante la administración aguda del fármaco
(Figura 13, DPOAE). En general, los límites de seguridad no están bien
caracterizados y nuestros datos de este estudio sugieren que nuestra
estimación original de 10µL/min es conservador para el parto agudo y
pulsado. Sin embargo, estos caudales aún pueden causar daños crónicos.
4.3 Dosificación controlada electrónicamente
Cuando utilizamos fluoresceína como fármaco de prueba, vimos un claro aumento
en la salida de fluorescencia de la bomba cuando iniciamos las pulsaciones de la
bomba de actualización del fármaco (Figura 12). Esto demuestra que nuestro
dispositivo es capaz de realizar dosificaciones controladas electrónicamente bajo
demanda. Para todos los esquemas de dosificación que probamos, la fluoresceína
dispensada por la bomba estaba en una concentración más baja que la solución de
fluoresceína que cargamos en el depósito de medicamento de la bomba. Había
aproximadamente 4µL de volumen muerto entre la válvula de salida y el extremo
del tubo de PEEK que estaba conectado a la salida, por lo que esperábamos que el
40% de cada 10-µLa alícuota sería agua, lo que provocaría una disminución de la
concentración de fluoresceína. Para los 20-refresh-
16 |j n/
nuestro y
ANo / Aa mí,[year], [volumen
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esquema de carrera, la concentración normalizada de los pocillos dosificados fue
aproximadamente 0,6, lo que es consistente con la dilución debido al volumen
muerto. Para los esquemas de 10 y 7 golpes de actualización, hubo dilución
adicional porque el volumen infundido fue mayor que el volumen de medicamento
cargado en la línea de infusión-extracción durante los golpes de actualización del
medicamento.
La reducción del número relativo de pulsaciones de actualización durante
una dosis de fármaco en comparación con el número de pulsaciones de
infusión al cambiar de los esquemas de dosis de 20 pulsaciones de
actualización a los de 10 pulsaciones de actualización y 7 pulsaciones de
actualización dio como resultado disminuciones en la producción de
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fluoresceína. concentración, como se esperaba. Para el esquema de 20
golpes de actualización, los pocillos inmediatamente después de los pocillos
dosificados activamente tenían una concentración promedio de fluoresceína
incluso mayor que la de los pocillos dosificados. Lo más probable es que esto
se deba a que el volumen sistólico de actualización es mayor que el volumen
sistólico de infusión, debido a la menor resistencia hidrodinámica en la ruta
del circuito de actualización en comparación con la línea de infusión-retirada.
Después de cada ciclo de un golpe de actualización y un golpe de infusión, se
dejó un volumen adicional de fluoresceína en la línea de infusión-retirada. Al
final de una dosis de 20 infusiones,µL. Debido a que el volumen muerto
después de la válvula de salida también se llenó con solución de fluoresceína,
la alícuota de 20 tiempos depositada en el pozo siguiente no se diluyó con
agua en el volumen muerto y tuvo una fluorescencia aún mayor. Para los
esquemas de dosis de 10 golpes de actualización y 7 golpes de actualización,
el volumen total infundido por ciclo excedió el volumen de fármaco cargado
en la línea de infusión-extracción, por lo que los pocillos inmediatamente
después de los pocillos dosificados activamente tenían concentraciones más
bajas de fluoresceína que los pocillos dosificados, correspondientes a los
restos de fluoresceína en la bomba que se están limpiando.
4.4 Entrega aguda de DNQX
Como hemos hecho en el pasado,18,24,26,27Utilizamos DNQX en este estudio como
fármaco de prueba porque es un antagonista del receptor de glutamato bien
conocido que interrumpe reversiblemente la transmisión sináptica de las células
ciliadas al nervio auditivo cuando se perfunde/infunde en las cócleas de los
cobayas.34–36Nuestros resultados (Figuras 13 y 14) son consistentes con informes
anteriores, ya que la infusión de DNQX resultó en la supresión de las amplitudes de
CAP y la elevación de los umbrales de CAP, con cambios mínimos en las DPOAE.
Después de que se detuvo la infusión de DNQX, tanto los umbrales como las
amplitudes volvieron a niveles cercanos al valor inicial, lo que es consistente con
informes anteriores sobre la reversibilidad de los efectos de DNQX.
Comenzamos la administración del fármaco con infusión y retirada de AP para
poder cambiar más adelante a la administración de DNQX y demostrar la
dosificación controlada electrónicamente. La perfusión AP normalmente produce
ligeros aumentos en la amplitud de CAP.42,43Observamos disminuciones
dependientes de la frecuencia en las amplitudes de CAP durante la infusión AP, lo
que es consistente con nuestras expectativas de que habría
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Puede haber una pequeña cantidad de DNQX en el AP como un artefacto del
procedimiento de cebado de la bomba. Estimamos aproximadamente la
cantidad de fármaco que queda en la línea de infusión y extracción después
de cebar con un experimento de fluoresceína. Primero cebamos el depósito
de fármaco con solución de fluoresceína y luego lavamos la línea de infusión
y extracción con 0,5 ml de agua. Luego realizamos 20 golpes de infusión,
recogimos el resultado en una placa de micropocillos y medimos la
fluorescencia. Debido a que la fluoresceína y el DNQX son moléculas de
tamaño similar, asumimos que tienen características de transporte similares.
A partir de esta prueba, estimamos que la concentración de DNQX en la línea
de extracción de infusión después del cebado fue de aproximadamente 60 a
80µM. Los cambios de amplitud fueron lo suficientemente pequeños como
para que no hubiera elevaciones significativas del umbral. Esto es consistente
con nuestro informe anterior de que las amplitudes de CAP son más
sensibles a DNQX que los umbrales.26Las amplitudes también se recuperaron
ligeramente durante el tiempo de espera entre la infusión y la retirada, lo que
es consistente con la bien conocida reversibilidad de los efectos DNQX.
Durante todo el proceso de infusión y retirada, no hubo cambios en los
DPOAE, lo que indica que nuestra bomba no causó ningún daño mecánico al
oído interno durante un ciclo completo de administración recíproca. Una vez
completada la entrega recíproca de AP, iniciamos el programa de entrega
DNQX, que resultó en una supresión de la amplitud de CAP y un aumento de
los umbrales de CAP después de un breve retraso (aproximadamente 15
minutos) debido al tiempo que tardó el dispositivo en eliminar AP del
volumen muerto en el outlet. Esto demostró nuestra capacidad para
controlar electrónicamente la dosificación de fármacos en un modelo animal
utilizando nuestro dispositivo.
Utilizamos los cambios dependientes de la frecuencia en los CAP y nuestro
conocimiento de la conocida organización tonotópica de la cóclea.44para
inferir la distribución y propagación de DNQX a lo largo del tiempo durante la
administración del fármaco. Estimamos que el extremo de la cánula estaba
colocado en la región de 12 a 16 kHz de la cóclea, lo que concuerda con
nuestros datos de CAP que muestran los efectos DNQX más grandes y
tempranos a 16 kHz (Figuras 13, 14 y 15). La cocleostomía, ubicada
aproximadamente en la región de 28 kHz, estaba cerca del acueducto coclear.
45Esperábamos que el fármaco fluyera desde la cánula basalmente hacia el
acueducto coclear, lo que resultaría en una distribución rápida de DNQX a las
regiones de frecuencia basal (por encima de 16 kHz) y una distribución más
lenta de DNQX a las regiones de frecuencia apicales (por debajo de 12 kHz),
donde el transporte de Se esperaba que DNQX fuera principalmente de
difusión. Según nuestros datos anteriores,26No esperábamos que DNQX
alcanzara regiones de frecuencia por debajo de 8 kHz dentro del plazo de
entrega explorado en este estudio, por lo que no monitoreamos los CAP en
esas frecuencias durante la entrega. Sin embargo, medimos los CAP a 5,6, 4 y
2,78 kHz comenzando inmediatamente después del final de la administración
de DNQX y cada hora a partir de entonces, y no observamos ningún cambio
de amplitud ni elevaciones de umbral en esas frecuencias. La supresión de
CAP a 8 kHz se retrasó y fue de menor magnitud que en frecuencias más
basales, lo que también es consistente con un transporte apical más lento. A
24 y 32 kHz, la droga máxima
Los efectos se observaron al mismo tiempo que para 16 kHz, lo que
indica una entrega convectiva rápida. Sin embargo, hubo menos
supresión de CAP a 24 y 32 kHz que a 16 o 12 kHz.
Para los experimentos discutidos aquí, elegimos un tiempo de espera arbitrario
entre la infusión de AP y la retirada de AP porque no esperábamos que AP afectara
significativamente la audición. Sin embargo, para la administración recíproca de un
medicamento, este tiempo de espera debe optimizarse para lograr la máxima
eficiencia de administración. El tiempo de espera no debe ser demasiado corto, ya
que el fármaco infundido no tendrá tiempo de difundirse por la cóclea. Si el tiempo
de espera es demasiado largo y los efectos del fármaco son reversibles, como es el
caso de DNQX, el animal puede recuperarse completamente de los efectos del
Manuscrito aceptado de laboratorio en chip
fármaco antes de que se administre la siguiente dosis. Al apagar la bomba después
de la administración de DNQX y observar la recuperación, hemos generado datos
que sugieren que 1 hora será un tiempo de espera adecuado entre la infusión y la
retirada para la administración recíproca de DNQX.
5. Conclusiones
Diseñamos, caracterizamos y probamos exhaustivamente una microbomba
recíproca para la administración intracoclear de fármacos. El dispositivo tiene un
almacenamiento de medicamentos integrado y es capaz de realizar una
dosificación controlada electrónicamente. Diseñamos la microbomba para que
forme parte de un sistema montado en la cabeza para experimentos de
administración de fármacos en el oído interno en modelos animales de cobayas, lo
que permite la caracterización farmacocinética a largo plazo de nuevos fármacos.
Con estos experimentos a largo plazo en mente, incluimos funciones en nuestros
microfluidos que ayudan a reducir el consumo de energía, como condensadores
fluídicos; Esto será fundamental para futuros experimentos crónicos en los que la
bomba funcionará con una batería portátil. También prestamos especial atención a
reducir el volumen muerto de salida para aumentar la eficiencia del suministro
alternativo y a minimizar los caudales máximos por motivos de seguridad.
Demostramos que nuestra microbomba es lo suficientemente robusta como
para funcionar bien cuando se agrega resistencia hidrodinámica a la salida, lo que
le permite mantener la administración del fármaco contra presiones 50 veces
mayores que la presión intracoclear típica en conejillos de indias. Cuando
utilizamos una solución de fluoresceína como fármaco de prueba, demostramos
que la administración de dosis del fármaco se puede controlar electrónicamente,
incluido el cambio entre la administración de fluoresceína y agua, y la reducción de
la concentración efectiva de fluoresceína administrada. Demostramos una
administración de fármacos segura y eficaz y una dosificación controlada
electrónicamente en conejillos de indias utilizando el antagonista del receptor de
glutamato, DNQX, como fármaco de prueba. La administración recíproca de AP no
resultó en elevaciones del umbral auditivo, pero el cambio electrónico de la
administración AP a DNQX dio como resultado una supresión de la amplitud de la
CAP dependiente de la frecuencia y elevaciones del umbral que eran consistentes
con la ruta de transporte esperada del fármaco y la anatomía cochelar del conejillo
de indias. No hubo cambios en los DPOAE durante la entrega de AP y DNQX, lo que
indica que nuestra bomba no causó ningún daño mecánico agudo.
Cuando se combina con hardware de control electrónico miniaturizado
j nuestro
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e integrada en un recinto montado en la cabeza, nuestra microbomba permitirá
experimentos de administración crónica de fármacos altamente controlados en modelos
animales y minimizará la exposición sistémica al fármaco. La mayor precisión de la dosis
que ofrece la administración mediante cocleostomía utilizando nuestra microbomba
facilitará la caracterización de la farmacocinética en experimentos de desarrollo de
fármacos. Reducir la exposición sistémica probablemente será fundamental cuando
también se utilicen medicamentos para restaurar la audición en humanos, ya que muchos
medicamentos existentes y los primeros candidatos a fármacos son tóxicos cuando se
administran sistémicamente. La dosificación controlada electrónicamente demostrada en
este estudio también se puede adaptar para la administración secuencial de una serie
cronometrada de medicamentos, lo que probablemente será importante para la terapia
de regeneración de células ciliadas.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por NIH NIDCD Grant 5 R01 DC006848-08.
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