Espectrofotometría

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección

específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente
sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la
fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola
longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el
medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde
Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase
líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la
muestra es generalmente disuelta para formar una solución. Cada sustancia tiene su propio
espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante
absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético,
es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una
cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto

1.- Ley de Lambert: Establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la
disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo que
equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar
aritméticamente el espesor del medio absorbente:

2.- Ley de Beer: La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al

aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a
través de un medio homogéneo (Fig. 3).
Ley de Lambert-Beer. La cantidad de radiación electromagnética absorbida por un analito se puede relacionar
cuantitativamente con la concentración de dichas sustancias en solución. La transmitancia (T) se define como la
fracción de radiación incidente trasmitida por la disolución. Si la potencia radiante que incide sobre la disolución es
Po y P la potencia radiante que sale, entonces: P0 P T = Además se observa que la potencia de la energía trasmitida
disminuye geométricamente (exponencialmente) con la concentración C y con la distancia b recorrida a través de la
disolución

Transmitancia (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una muestra y la
energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente como la transmitida
deben ser medidas a la misma longitud de onda.
T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0
Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida por la muestra y la
luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el líquido (solvente) en que
esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución que contiene todos los componentes de la
solución problema menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente. Debido
a que la transmitancia de este estándar no es necesariamente 100%, es necesario especificar el
estándar con el cual la muestra es comparada.
Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia
pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia,
expresada como porcentaje.
A = - log T = 2 – log %T
Selección de longitud de onda de trabajo. Corresponde, generalmente, a la longitud de onda
en la cual la absorbancia del analito es máxima, y recibe la denominación de longitud de onda
máximo (λmax). Para seleccionar la λmax., se realiza el espectro de absorción o curva espectral,
y que consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de
concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina la λmax.
Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda donde se espera que
absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan
en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 780nm). En el caso de sustancias no
coloreadas, las mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético
(200 a 380nm).
Espectro y fotocolorímetro
:
Estos son equipos utilizados en el Laboratorio para el análisis de muestras biológicas, basándose
en el principio que cada compuesto químico absorbe o emite energía lumínica de diferente
longitud de onda. Esta longitud puede estar en el espectro de luz visible, o en otra parte del
espectro electromagnético. La diferencia fundamental entre un espectrofotómetro y un fotómetro o
fotocolorímetro, consiste en que el fotocolorímetro trabaja únicamente en el espectro de luz visible
y selecciona una longitud de onda determinada mediante filtros fijos. En cambio, un
Espectrofotómetro es capaz de trabajar, no solo con la luz visible, sino que en otras regiones del
espectro electromagnético (ultravioleta e infrarroja). Además, posee un monocromador para
seleccionar la longitud de onda deseada.

Calibración
Antes de utilizar el espectrofotómetro o fotocolorímetro es indispensable realizar
rutinas básicas de calibración para asegurarnos que el aparato proporcione datos y lecturas
confiables.
Antes de usar sus equipos debe hacer lo siguiente:

• Limpieza de la superficie del instrumento.

• Limpieza de los filtros y fuente de luz (lámpara y condensador).
• Verificar instalaciones eléctricas.
• Los pasos para probar la operatividad del equipo son los siguientes:

a) Se enciende el equipo y se deja que caliente por lo menos 15 minutos (sí el aparato es
automático, dará una señal cuando esté listo para funcionar).
b) Seleccionar la longitud de onda deseada según la técnica del análisis bioquímico.
c) Seleccionar absorbancia o transmitancia.
d) Ajustar a cero con agua destilada. Si el equipo a utilizar tiene las dos escalas (absorbancia y
transmitancia) se ajustan las lecturas a cero de absorbancia y 100% de transmitancia utilizando la
función calibración.
e) Se lee un estándar de concentración conocida y se ajusta el aparato a esa concentración. Si el
aparato que se va a utilizar no tiene control estándar,
este se utiliza para obtener el factor de calibración, dividiendo la concentración del estándar entre
su lectura.

Recomendaciones de uso y Cuidados del equipo

a) Coloque el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor excesivo,

humedad o luz directa.
b) Proteja el instrumento del polvo. Nunca toque las superficies ópticas tales como lentes y filtros.
Siga las instrucciones que da el fabricante para la limpieza de tales componentes.
c) Permita que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento.
d) Se debe hacer un chequeo periódico (cada semana) de la calibración de la longitud de onda .
e) Verifique el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando varíe la longitud de
onda.
f) Asegúrese de que las cubetas estén limpias y libres de rayaduras y huellas digitales. Esto debe
hacerse cada vez que va a usarse.