Sesión 5

ESPECTROFOTOMETRÍA

Dr. Germán De Montreuil

Historia

Arnold Beckman Inventó

el Espectrofotómetro, en
1940 en National
Technology Laboratory.
En la década de 1950, en
USA.

Un aparato que logra que los

análisis sean más cuantitativos,
confiables, reproducibles;
incrementa su Precisión y
Exactitud.
Espectrofotometría

ESPECTRO FOTO METRÍA

Imagen, Vista Luz Medida
Fenómeno Instrumento

Método cuantitativo de análisis químico que utiliza la

LUZ para medir concentraciones de sustancias
químicas.
Mide la cantidad de Energía Radiante que absorbe o
transmite un sistema químico en función de su
Longitud de onda.
Espectrofotómetro
Espectrofotómetro compara la radiación obtenida o
transmitida por una solución que contiene una
cantidad desconocida de soluto con una que
contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.

Relaciona la intensidad de color de una muestra

comparándola con la cantidad de soluto dentro de
la muestra.

Radiación Monocromática
Espectrofotometría
Método de Análisis Óptico que utiliza la
luz para medir concentraciones e
identificar compuestos de manera
específica.

Técnica Experimental muy usada en la Investigación

química y biológica.

Características: Precisión,
Sensibilidad y Aplicabilidad
a moléculas de distinta
naturaleza y estado de
agregación.
Fundamento
Se fundamenta en la LUZ, la que se manifiesta como
ondas o partículas.
La Longitud de onda determina el color de la Luz.
La Energía Radiante se encuentra constituida por
FOTONES, cada uno de los cuales tiene como
característica una Longitud de onda.
 Principios
1. Toda sustancia puede
ABSORBER energía
radiante.
2. La absorción de
Radiaciones Ultravioleta,
Luz visible e Infrarroja
depende de la estructura
de las moléculas.

3. Cuando la Luz atraviesa una sustancia, parte de la

energía es absorbida.
4. El Color de una sustancia se debe a que ésta absorbe
ciertas longitudes de onda de la Luz blanca.
Espectro Electromagnético

La Luz está compuesta por ondas de diversa frecuencia.

Cuando un Rayo de Luz blanca pasa por un Prisma, se
separa de sus componentes de acuerdo a su longitud de
onda.

Longitud de onda de:

Luz visible 400 – 750nm.
Rayos Infrarrojos área mayor a
750
Rayos UV área menor a 400
Radiaciones Electromagnéticas
Diseño del Espectrofotómetro
Por problemas de Rendimiento se hizo necesario
cambios en el diseño:

Modelo B: con Prisma de Cuarzo en lugar

de un prisma de cristal.
Modelo C: Elevaron la resolución de la
Longitud de onda hasta el Rayo UV.
Modelo D: introducen la Lámpara de
Hidrógeno.
Tipos de Espectrofotómetro

Espectrofotómetro de
Absorción atómica. Espectrofotómetro de Absorción molecular

Espectrofotómetro Smart mini Espectrofotómetro UV visible

Fundamentos Teórico - Técnicos
Los mismos que para su origen.
Espectrometría de masas se basa en la separación de
partículas moleculares o atómicas por su diferente
masa.

Proceso de Espectrometría de masas comprende 4

etapas:
1. Ionización de la muestra.
2. Aceleración de iones por un campo eléctrico.
3. Dispersión de iones según su Masa / Carga.
4. Detección de los iones y producción de la
correspondiente señal eléctrica.
Componentes Externos

Cámara/Compartimiento

Pantalla LCD

Teclas Desplazadoras

Teclas DEC/INC. Sel. 𝝀

Tecla de ajuste

MODE
calibración
Imprimir
1. Cámara o compartimento, donde interactúa con la
materia, aquí no hay absorción ni dispersión de longitud
de onda.

2. Cubetas, tubo de sección circular o cuadrado, sellado

en un extremo, fabricado en plástico, vidrio o cuarzo
(transparente a la luz ultravioleta), utilizado para
mantener las muestras durante el análisis.

Deben ser tan claras o

transparentes como
sea posible, sin
impurezas que afecten
una buena lectura.
3. Selector de Longitud de Onda, la parte más importante
del equipo.
Dispositivo que filtra el espectro producido por la fuente,
dejando "pasar" sólo radiaciones en un rango de longitud
de onda determinada.
Radiación electromagnética

Longitud de onda
C vel. luz l (nm)
l long. onda
n Frecuencia Ciclo
n
Frecuencia (Ciclos/s)
(Hz)
E energía en joules
h constante de Planck:
6.62 X10-27 ergs-s
C=ln E=hn
Ej.

l = 450 nm C/l = n
C = 3 X1017 nm/s
n = 6.6 X 1014 Hz
h = 6.62 X10-27
E = 4.36 X10-12
C=ln E=hn
Componentes Internos
1. Fuente de Luz, ilumina la muestra.
Condiciones: Estabilidad, Direccionalidad, Distribución
de energía espectral continua y Larga vida.
Fuentes empleadas: Lámparas de Tungsteno, Arco de
Xenón y Deuterio (Laboratorio atómico)

Lámpara de Deuterio e
Hidrógeno.
Produce un espectro continuo en el
área UV.
Se usa a longitudes de onda menores
a 350 nm.
Requieren cubetas de cuarzo.
 Lámpara de arco de
Xenón
Emite luz producida por un arco
eléctrico (también llamado Arco
Voltaico).
Se nombra según el gas: Xenón,
Neón, Argón, Kriptón, Haluro
metálico, etc.

Lámpara de filamento
de Tungsteno.
Fuente más común de radiación
visible e infrarrojo cercano, se usa
en una longitud de onda entre 350
- 2500 nm.
2. Monocromador, constituido por rendijas de entrada
y salida, colimadores y un elemento de dispersión.

Colimador, lente
que lleva el haz de
luz con una longitud
de onda hacia el
Prisma que
separará todas las
longitudes. La
longitud de onda
deseada se dirige
hacia otro lente que
direcciona ese haz
hacia la rendija de
salida.
El Monocromador aísla las radiaciones de longitud
de onda, obteniendo Luz monocromática. Es
Superior en calidad a los filtros
Existen 2 tipos de Monocromador:

1. M. de red

2. M. de prisma
3. Detector, convierte la
energía radiante en una
señal eléctrica.
Evidencia la radiación y la
deja en evidencia para que
sea estudiada y saber a
qué tipo de respuesta se
enfrentarán (fotones o
calor).

Hay 2 tipos:
• Responden a fotones
• Responden al calor
Foto detectores, son 16 componentes encargados
de percibir la señal en 16 longitudes de onda en
forma simultánea, cubriendo el espectro visible.
Reduce el tiempo de medida y minimiza las partes
móviles del equipo.
Leyes Fundamentales
Absorción, proceso por el cuál una especie en un
medio transparente, capta selectivamente ciertas
frecuencias de la radiación electromagnética.

Ley de Beer - Lambert, relaciona la Intensidad de Luz

entrante en un medio con la Intensidad saliente
después que en dicho medio se produzca absorción.
Absorbancia es la medida de
energía radiante, absorbida por
un material o superficie como
función de la longitud de onda de
dicha energía.
Transmitancia, es la fracción
de radiación incidente
trasmitida por la solución.
expresa la cantidad de energía
que atraviesa un cuerpo en la
unidad de tiempo.
 ABSORBANCIA
0.3
1
2 50 0
%TRANSMITANCIA
0 100
EJ.
1. ¿Cuál es la A de una substancia al 2.5 X 10-5 M ,
con un e = 7,500 M-1cm-1 ?.

2. A Problema = 0.458 A Patrón = 0.765

Conc. Patrón= 145mg% Conc. Problema= ?

Conc. Prob = (A Prob/A Patrón)(Conc. Patrón)

Conc. Problema = (0.458/0.765)(145mg%)

Conc. Problema = 86.8 mg%

 Espectro de Absorción

A
b 25 mM
s
o
A r
b 5 mM
a
n
c
i
a l Max
Longitud de onda (nm)
l
 Espectrofotómetro
Calcula la cantidad de luz
que una solución es capaz
de absorber y la aplicación
de la Ley de Lambert-Beer.
Puede determinar la
concentración de una
solución con color.

Está compuesto por:

• Espectrómetro : proporciona luz a una longitud de
onda específica.
• Fotómetro: mide la intensidad de la Luz.
Funciones del Espectrofotómetro

Realiza 2 funciones
principales:
Informa sobre la
naturaleza de la sustancia
que contiene una
muestra.
Señala la cantidad de
sustancia a investigar que
se encuentra presente en
la muestra.
Calibración
Se debe calibrar (blanco) para evitar obtener
lecturas erróneas.
Si la sustancia a medir está disuelta en algún
reactivo químico, ese reactivo será el blanco.
Ej. disolver un Rvo químico en metanol, el metanol
será el blanco. Así se sabrá la concentración de
dicho reactivo, una vez que se halla hecho la curva
de concentración.

Por lo general, se usa Agua

Destilada para conocer la
absorbancia o transmitancia
de un líquido.
Manejo
Encender antes de leer la
muestra teniendo en cuenta el
tiempo de termostatización.
Seleccionar la l
Seleccionar la T° de trabajo.
Elegir una cubeta en buen
estado.
Llevar a CERO de absorbancia
con agua destilada (calibración).
Vaciar la cubeta, enjuagar con un
poco de la solución a medir, para
evitar arrastre.
Cargar la cubeta con la solución y leer la
absorbancia por duplicado informando la
Absorbancia Promedio.
Si se mide más de una solución, enjuagar con la
solución antes de medir c/u.
Empezar siempre por la solución más diluida.
Métodos Espectroscópicos

Usan la radiación emitida cuando un soluto es

excitado por energía térmica, eléctrica o radiante.
Los métodos de absorción por lo contrario, se
basan en la disminución de la potencia
(atenuación) de la radiación electromagnética
como consecuencia de la absorción que se
produce en su interacción con el soluto.
Los métodos de absorción poseen la ventaja de
producir poca o ninguna alteración en el sistema
estudiado.
Los métodos espectroscópicos recaban información
cualitativa y cuantitativa.
Estos métodos se clasifican según el área del espectro
electromagnético en:
• Rayos X • Luz Infrarroja
• Rayos Ultravioleta • Microondas
El color de las sustancias se debe a que éstas
absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca
que incide sobre ellas y sólo dejan pasar a nuestros
ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.
Aplicaciones
Estandarización de Colores (pinturas)
Detecta Contaminación en Aire y
Agua.
Determina Impurezas en Alimentos y
Rvos.
Determina Concentración de un
compuesto.
Determina Estructuras Moleculares.
Identifica Unid. Estructurales
específicas, (grupos funcionales o
isomerías).
Determina constantes de disociación
de indicadores ácido – base.
Análisis cualitativo y cuantitativo de Soluciones en
Laboratorio de investigación.
Análisis de sangre, en controles pre-quirúrgicos,
concentraciones hemáticas de monóxido y dióxido de
carbono, oxígeno, nitrógeno y gases anestésicos.