Análisis Inmunológico y Hematológico

CURSO 2015-2016
ANÁLISIS INMUNOLÓGICO Y
HEMATOLÓGICO
FARMACIA USC
RUBÉN PRIETO
ÍNDICE
ANÁLISIS HEMATOLÓGICO
Tema 1. Recogida y procesado de las muestras. Métodos de extracción de sangre.
Anticoagulantes de recolección. Fraccionamiento de la sangre. Conservación y
manipulación de las muestras.
Tema 2. Control de calidad y expresión de los resultados en hematología. Concepto de

control de calidad. Procedimientos de valoración de la calidad. Control de calidad interno y
externo. Expresión de los resultados en hematología. Valores de referencia.
Tema 3. Recuento celular sanguíneo. Recuento mediante cámara cuenta glóbulos.

Recuento automático.
Tema 4. Hemograma. Índices hemáticos. Síntomas clínicos de la anemia. Tipos de anemia.

Procedimientos para la detección y el diagnóstico de la anemia.
Tema 5. Recuento diferencial de leucocitos. Aspectos generales en el diagnóstico de las

alteraciones cualitativas de los leucocitos. Diagnóstico diferencial de las leucocitosis y
leucopenias.
Tema 6. Métodos diagnósticos de trastornos hemorrágicos. Exploración analítica de la

hemostasia primaria: estudio de la fragilidad vascular, recuento de plaquetas, y estudio de la
agregación plaquetaria. Exploración analítica de la coagulación plasmática.
Tema 7. Terapia anticoagulante, antiplaquetaria y trombolítica. Control de laboratorio de la

terapia anticoagulante, antiplaquetaria y trombolítica.
Tema 8. Inmunohematología. Grupos sanguíneos: Sistema ABO y Sistema Rh.

Transfusiones sanguíneas. Reacciones transfusionales hemolíticas.
ANÁLISIS INMUNOLÓGICO
Tema 9. Análisis inmunológico. Definición. Aplicaciones. Muestras biológicas. Analitos.
Clasificación de los inmunoensayos. Antígenos. Naturaleza y tamaño de los antígenos.
Epitopos simples y múltiples. Antígenos naturales y recombinantes. Haptenos. Clasificación
de los inmunoensayos. Inmunoensayos homogéneos y heterogéneos. Pruebas in vivo.
Tema 10. Moléculas de reconocimiento inmunológicas. Anticuerpos policlonales.

Anticuerpos monoclonales. Nanobodies. Anticuerpos como analitos. Interacciones antígeno-
anticuepo. Moléculas de reconocimiento no inmunológicas. Avidina y estreptavidina.
Proteínas A, G y L. Lectinas. Aptámeros.
Tema 11. Validación de los inmunoensayos. Afinidad y avidez. Sensibilidad, especificidad y

detectabilidad. Precisión y exactitud. Calibradores y controles. Reactividad cruzada y unión
no específica (NSB).
Tema 12. Inmunoensayos sin moléculas trazadoras. Reacciones de inmunoprecipitación,
aglutinación y hemólisis. Concepto. Tipos. Factores condicionantes. Interpretación de
resultados. Aplicaciones. Detección de reacciones antígeno-anticuerpo mediante
turbidimetría y nefelometría. Concepto. Factores condicionantes. Interpretación de
resultados. Aplicaciones.
Tema 13. Inmunoensayos que emplean partículas trazadoras coloreadas. Inmunoensayos

de difusión lateral (Pruebas inmunocromatográficas). Fundamento. Tipos. Aplicaciones.
Inmunoensayos que emplean moléculas trazadoras radiactivas. Radioinmunoensayos.
Fundamento. Tipos. Ventajas e inconvemientes. Aplicaciones.
Tema 14. Ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Fundamento. Soportes.
Agentes bloqueantes. Sustratos enzimáticos. Tipos. Sistemas de amplificación.
Aplicaciones.
Tema 15. Otros inmunoensayos heterogéneos. Inmunodot (dot-blot). Fundamento.

Soportes. Tipos. Aplicaciones. Inmunotransferencia. Fundamento. Soportes. Tipos.
Aplicaciones. ELISPOT. Fundamento. Tipos. Aplicaciones.
Tema 16. Inmunoensayos automatizados: Sistemas homogéneos. Concepto. Tipos.

Sistema EMIT. Sistema EMIA. Sistema CEDIA. Inmunoensayo por polarización de
fluorescencia (FPIA). Aplicaciones. Sistemas heterogéneos. Enzimoinmunoensayo por
micropartícula (MEIA). Enzimoensayo magnético quimioluminescente (CMIA). Tecnología
de microarrays. Concepto. Tipos. Aplicaciones.
Tema 17. Inmunoensayos sobre células o tejidos. Inmunofluorescencia. Fundamento. Tipos.

Aplicaciones. Microscopía confocal. Fundamento. Aplicaciones. Inmunocitometría de flujo.
Fundamento. Aplicaciones en inmunofenotipado. Inmunohistoquímica. Fundamento. Tipos.
Microtomos, ultramicrotomos, criotomos. Aplicaciones. Fagocitosis (Test de reducción del
NBT). Fundamento y aplicaciones.
Tema 18. Pruebas inmunológicas en alergia. Concepto de alergia. Reacciones de

hipersensibilidad implicadas. Alérgenos por inhalación. Alérgenos por ingestión. Otros
alérgenos. Pruebas alérgicas in vivo e in vitro. Test de activación de basófilos. Fundamento.
Aplicaciones. Significado clínico.
Tema 19. Pruebas inmunológicas en trasplantes. Tipos de trasplantes. Procedimientos para

la selección de donantes y receptores. Tipado HLA. Pruebas cruzadas.
Tema 20. Pruebas inmunológicas en autoinmunidad. Concepto de autoinmunidad.

Características de las enfermedades autoinmunes. Enfermedades autoinmunes sistémicas
y órgano específicas. Significado clínico de los anticuerpos antinucleares. Algoritmos
diagnósticos.
Análisis Inmunológico y Hematológico Rubén Prieto
Tema 1
1. RECOGIDA Y PROCESADO DE LAS MUESTRAS
Vamos a tratar:
1. Métodos de extracción de sangre.

2. Anticoagulantes de recolección.
3. Fraccionamiento de la sangre.
4. Conservación y manipulación de las muestras.
5. Aplicaciones a los bancos de sangre.
1.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE SANGRE

La sangre es un tejido que se utiliza como método de análisis para diagnosticar o ver la
evolución de enfermedades. Se trata, a diferencia de lo conocido comúnmente, de un
tejido líquido, compuesto por:
 Plasma sanguíneo: formado mayoritariamente por agua, en la que hay

sustancias disueltas: proteínas plasmáticas (mayoritariamente albúmina, pero
también se engloban a las proteínas del complemento y factores de
coagulación), sales (electrolitos), moléculas orgánicas (por ejemplo, urea), gases
(como el O2 y el CO2).
 Elementos en suspensión: no son exactamente células, ya que, por ejemplo,
el hematíe no posee núcleo, y las plaquetas son partes de células. También hay
leucocitos en suspensión.
Si centrifugamos una muestra de sangre, los elementos en suspensión, que son más
pesados, van al fondo del tubo y el plasma se queda arriba. Esta separación tan sencilla
de obtener ya forma parte de un hemograma. El parámetro obtenido se denomina
hematocrito, y es el volumen que ocupan los hematíes en relación al volumen total de
sangre. Se puede expresar o no en porcentaje:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝐻𝑒𝑚𝑎𝑡í𝑒𝑠
𝐻𝑒𝑚𝑎𝑡𝑜𝑐𝑟𝑖𝑡𝑜 = ×100 ≈ 𝟒𝟓%1
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒
En la práctica, al centrifugar, se obtiene también precipitado

de leucocitos y plaquetas. La utilización de la suma del
volumen ocupado por leucocitos, plaquetas y hematíes para
el cálculo del hematocrito no supondría un error muy grande,
ya que la cantidad de plaquetas y leucocitos que hay en
sangre es mucho menor a la de eritrocitos.
Generalmente la sangre se extrae con un anticoagulante

para evitar la coagulación. La diferencia entre usar o no
anticoagulante y centrifugar será la obtención de plasma o
suero sanguíneo:
1 Valor normal.
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 Plasma: sangre completa excepto células.

 Suero: plasma sin factores de coagulación (se formó
ya el coágulo).
El dejar o no coagular la sangre dependerá del análisis que

se quiera realizar a la misma:
 Pruebas químicas/bioquímicas: suero o plasma

indistintamente.
 Estudio de coagulación: hay que usar el plasma,
ya que en el suero no hay factores de coagulación,
se han gastado formando el coágulo.
 Estudio del hematocrito: generalmente no se usan tubos de ensayo. Se usan
unos tubos capilares. Con un pequeño pinchazo en el dedo se puede obtener la
sangre necesaria para realiar el análisis, La sangre asciende por capilaridad. Se
sella el fondo y se centrifuga el tubo capilar. Se usa menos sangre y se obtienen
buenos resultados. En este caso estamos usando sangre capilar.
Se usa este método (en el que se obtiene poca sangre) para realizar otras pruebas
como:
 Determinar el grupo sanguíneo.

 Frotis sanguíneo.
 Control de la glucosa.
Hay que tener en cuenta que no sólo va a salir sangre capilar,

sino que va a haber una mezcla de sangre capilar, arteriolar y
líquido intersticial. El pinchazo para obtener la muestra de
sangre se puede realizar en el dedo, en el lóbulo de la oreja
(donde hay menos nociceptores y por tanto duele menos) y en
recién nacidos en el talón.
Lo más frecuente es obtener sangre venosa de la fosa

anterocubital. Ahí hay venas superficiales, es una zona poco
dolorosa y la piel es fina.
La razón de usar venas es que al poner el compresor se dificulta

el retorno venoso (las venas son más superficiales que las
arterias) de manera que la vena se hincha, haciendo más fácil
el pincharla. Si por cualquier motivo, como obesidad, heridas en
la zona o hospitalización (mayor movilidad), se suele pinchar en
las venas de las manos. Menos frecuente es el uso de las venas
de la pierna.
1.1.1. MATERIAL
Se usan agujas de diferentes calibres y con diferentes colores que facilitan su uso. Los
tubos para recoger sangre tienen los tapones de diferentes colores según el aditivo que
contenga cada uno.
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1.1.2. EXTRACCIÓN
Se desinfecta la zona y se aplica un torniquete. Se pincha con unos 30º (casi paralela a
la vena). Muchas veces las agujas tienen palomillas, que se usan para facilitar el
pinchazo La aguja debe tener el bisel para arriba.
La sangre entra en tubos con diferentes colores de tapón, que como indicamos antes,
tienen diferente aditivo (mayoritariamente anticoagulantes), que serán recomendados
para diferentes tipos de análisis.
1.2. ANTICOAGULANTES DE RECOLECCIÓN (ADITIVOS)

Los diferentes colores de los tapones de los tubos de recolección indican el aditivo
existente en el tubo:
V.H.S: Velocidad de sedimentación, se usa citrato (anticoagulante) en proporciones 1:4.

Lo general es que los anticoagulantes se encuentren en concentración 1:9. Para realizar
pruebas bioquímicas se usa heparina. El EDTA se usa en hematología, ya que mantiene
intactas las células. Los aditivos que se usan son de tres tipos:
a) Anticoagulantes:
i. Citrato sódico.
ii. EDTA.
iii. Heparina.
iv. Oxalato
v. Bancos de sangre: ACD2 o CPD3.
b) Coagulantes:
i. Cristales de vidrio.
ii. Fibrina.
2 Ácido cítrico citrato dextrosa.

3 Citrato fosfato dextrosa.
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c) Gel separador: se sitúa entre la capa líquida y sólida para facilitar su

manipulación. Cambia de viscosidad durante la centrifugación.
1.2.1. ORDEN DE EXTRACCIÓN DE LOS TUBOS

Se extraen de manera que se evita la contaminación de los siguientes tubos con el
aditivo que contiene el inmediatamente anterior. El orden de extracción es:
1. Frascos para hemocultivos.

2. Tubos para análisis de suero: sin anticoagulante. Tapón rojo.
3. Tubos con citrato: anticoagulante. Primero este ya que los otros interfieren en el
proceso de coagulación.
4. EDTA, heparina y demás anticoagulantes, tubo de velocidad de sedimentación
(negro) y jeringas de gasometría.
1.2.2. NORMAS BÁSICAS EN LA EXTRACCIÓN

El tubo de citrato destinado a pruebas de coagulación (azul) debe extraerse siempre
antes que los que llevan otros anticoagulantes, de manera que no se contamine con
EDTA o heparina, lo cual puede interferir en el estudio de la coagulación.
Hay que llenar cada tubo con cuidado hasta que haya suficiente cantidad de sangre.
Los tubos con anticoagulante deben llenarse hasta consumir todo el vacío para
mantener la proporción correcta de anticoagulante y sangre. Hay que respetar siempre
la proporción sangre-anticoagulante. No retirar el tubo hasta estar seguros de que no se
llena más.
Para evitar hemólisis dejar resbalar suavemente la sangre por la cara interna del tubo.
Para mezclar la muestra con el aditivo, no se debe agitar, sino invertir suavemente el
tubo lleno para homogenizar la muestra, evitando de nuevo la hemólisis.
Los tubos que no contengan anticoagulante no moverlos, para evitar la hemólisis.
1.3. FRACCIONAMIENTO DE LA SANGRE

La sangre obtenida con anticoagulante se puede homogeneizar, obteniendo sangre
completa, o centrifugar, obteniendo plasma. De la sangre sin anticoagulante se obtiene
suero tras la centrifugación.
1.4. CONSERVACIÓN
El tiempo y el método de
conservación varían
dependiendo del análisis que le
queramos realizar a la muestra.
Como vemos, por ejemplo, para

realizar un análisis de la
velocidad de sedimentación se
puede conservar a temperatura
ambiente, mientras que para
pruebas como recuentos de
leucocitos y hematíes se deben
conservar a 4ºC.
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1.5. APLICACIONES A LOS BANCOS DE SANGRE

En los bancos de sangre se usa como anticoagulante ACD (Ácido cítrico citrato
dextrosa). La sangre se almacena según el grupo sanguíneo. Normalmente la sangre
obtenida se fracciona en hematíes, glóbulos blancos y plaquetas.
En la donación se puede realizar este fraccionamiento directamente, realizando una

donación por aféresis. Se obtiene sólo un componente de la sangre, obteniéndose
mayor proporción del mismo.
El fraccionamiento post-donación se realiza siguiendo el siguiente esquema:
Las plaquetas duran 5 días a temperatura ambiente y con agitación para evitar
agregación. Los hematíes se pueden congelar (usando un crioprotector), durando al
menos 10 años. Se pueden usar también inmediatamente. El plasma se puede usar al
momento o refrigerar, durando 24 meses.
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10
Tema 2
2. CONTROL DE CALIDAD. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
La calidad son todas las acciones que nos van a permitir saber que los resultados de un
análisis son fiables. Para garantizar la calidad ha de haber:
 Exactitud: similitud entre el valor obtenido y el real.

 Precisión: concordancia entre las réplicas. Indica reproductibilidad.
Lo ideal es que los valores obtenidos sean exactos y precisos, donde no se comete
ningún error.
Puede ocurrir que obtengamos valores exactos pero imprecisos (los valores se acercan
al real, pero al hacer réplicas el valor varía de forma imprevisible). Ocurren errores
aleatorios, que principalmente se deben a una mala realización del experimento. La
causa de este tipo de errores es difícil de determinar.
Puede que nuestro análisis sea inexacto pero preciso (los valores se alejan del real,
pero al hacer réplicas obtenemos valores muy semejantes). Ocurren errores
sistemáticos, siempre en la misma dirección. El error sistemático es más fácil de
detectar. Puede ocurrir por errores de calibración o deterioro del reactivo (aunque cada
día el reactivo se deteriora más y el error sería mayor, siempre varía en la misma
dirección).
Hay tres fases de un proceso analítico en las que se deben garantizar la calidad
(Garantía de calidad):
 Fase pre-analítica: desde que se recibe la muestra hasta que queda preparada
para su análisis. Engloba a la preparación del paciente, toma de las muestras,
competencia del personal, transporte y recepción de la muestra. En esta fase es
donde hay mayor incidencia de errores (y, aun así, los controles de calidad se
encaran a la fase analítica).
 Fase analítica: realización del análisis. Engloba a el mantenimiento de equipos,
disponer de reactivos de calidad garantizada, calibración de las pruebas, control
de calidad interno y evaluación externa de calidad.
o El control de calidad interno (CCI) se realiza por el propio laboratorio
frente a reactivos de control. El reactivo se somete al mismo proceso que
la muestra normal para comprobar que todo el procedimiento funciona
correctamente.
o Las evaluaciones externas de calidad (EEC) son realizadas por una
entidad ajena que manda muestras a laboratorios asociados donde se
realizan los pertinentes controles.
 Fase post-analítica: engloba a la realización de informes y archivo de los
mismos.
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2.1. CONTROL DE CALIDAD EN LAS DISTINTAS FASES DE ANÁLISIS

2.1.1. FASE PRE-ANALÍTICA
Mayoría de las causas de rechazo de muestras en la fase pre-analítica:
 Mal identificadas.
 No cumplen condiciones preanalíticas.
 Hemolizadas.
 Coaguladas.
 Muestras insuficientes.
Para mantener una garantía de calidad se deben ajustar:
 Condiciones del paciente: hora, posición, alimentación, fármacos, ejercicio físico,

etc.
 Extracción y recogida de las muestras: tubo adecuado, orden de los tubos…
 Identificación.
 Preparación de la muestra: centrifugar, alícuotas, distribuir…
 Conservación.
 Transporte
2.1.2. FASE ANALÍTICA

Las fuentes de variación en la fase analítica son:
 Reactivos (incluyendo agua):

o Pureza.
o Preparación
o Estabilidad y almacenamiento.
 Tipo de material y su limpieza.
 Medición de volúmenes.
 Mezclado.
 Tiempo y temperatura de reacción.
 Instrumentación:
o Manejo adecuado.
o Mantenimiento.
o Calidad.
o Estabilidad electrónica.
o Resolución óptica.
o Linealidad.
Hay que tener en cuenta la regla de decisión: permite aceptar o rechazar resultados
dependiendo de la desviación estándar de la muestra.
Por ejemplo, si un resultado nos

da dos veces la desviación
estándar de la media de
resultados al realizar varias
mediciones, lo rechazamos por
un error muy grande.
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Para preservar la garantía de calidad en la fase analítica se debe mantener:
 Equipos en buen estado de mantenimiento.

 Reactivos de calidad garantizada.
 Actualización de procedimientos.
 Exactitud y precisión de métodos analíticos: uso de controles comerciales,
calibradores, intercalado de muestras, control interno de calidad.
 Participación en programas de evaluación externa de calidad.
2.1.3. FASE POST-ANALÍTICA

Para garantizar la calidad en la fase post-analítica (emisión y archivado del informe y
datos):
 Validación de los resultados.

 Revisión de resultados sospechosos.
 Elaboración y emisión de informes: unidades de expresión de resultados. Se
usan valores de referencia cuando el resultado sea numérico.
 Archivado de resultados.
2.2. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

El S.I. establece que las unidades que se deben usar son Litros (L), Kilogramos (Kg) y
moles (Mol), además de múltiplos y submúltiplos de los mismos. Por ejemplo, en la
medida del VCM se usa el femtolitro (fL), que equivale a 10-15L.
13
2.2.1. VALORES HEMATOLÓGICOS DE REFERENCIA

Acompañan a los valores obtenidos. Para establecerlos se utilizan individuos sanos con
unas determinadas características, y se obtienen valores en función de muchas
variables:
 Grupo poblacional: recién nacidos, niños, jóvenes adultos, adultos, ancianos.

 Edad.
 Sexo.
 Raza.
 Hábitos: alimentarios, físicos, tóxicos, proesionales…
 Condiciones en las que se ha practicado la extracción: postura, lugar de
punción, tipos de tubos, hora, ayunas, ejercicio intenso…
Se pueden obtener también valores de referencia para determinadas patologías, que

ayudan en el diagnóstico (valores de Hb entre los que hay anemia, por ejemplo).
Hay unos criterios de exclusión para elaborar una población de referencia:
 Alcoholismo.
 Tabaquismo.
 Obesidad.
 Drogodependencia.
 Administración de anticonceptivos orales.
 Factores ambientales, genéticos, profesionales, etc.
 Menstruación reciente.
 Embarazo.
 Menopausia.
 Ejercicio intenso.
 Estado tensional.
 Enfermedad reciente: tras sufrir una enfermedad, diferentes parámetros pueden
sufrir variaciones que tardan en normalizarse.
En los análisis se incluye el valor medio y la desviación típica, aunque pueden aparecer
directamente en forma de intervalos. Éstos resultados se organizan por edades y a partir
de la pubertad se separan en función del sexo.
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Tema 3
3. RECUENTO CELULAR SANGUÍNEO
3.1. HEMOGRAMA
El hemograma es el estudio de los elementos formes de la sangre. Se estudian el
número de células (recuento, en unidad/L) y también se estudian algunas características
celulares (el tamaño, la cantidad de hemoglobina, por ejemplo).
El hematocrito va a depender de la cantidad de hematíes y del volumen corpuscular

medio (VCM) o tamaño de los mismos.
3.2. RECUENTO CELULAR

El recuento puede llevarse a cabo de forma manual o automática.
3.2.1. RECUENTO MANUAL

Se usa para contrarrestar errores en el autoanalizador, puesto que hoy en día los
análisis se realizan de forma automática mayoritariamente. También se puede usar para
calibrar el mismo. Por ejemplo: en el resultado aparecen células extrañas, que
simplemente puede estar causado porque dos células están pegadas, y se detectan
más grandes de lo normal. Se realiza el recuento manual y se elimina el error. Para
realizar el recuento manual hay que disponer de:
 Muestras diluidas: para lo que se utiliza pipeta y líquido para diluir. El número
de hematíes es muy grande y por tanto hay que diluir para poder realizar el
conteo fácilmente. El líquido de dilución varía dependiendo de lo que vayamos a
contar:
o Hematíes: Isotónico con la sangre: suero fisiológico. Para que no se
produzca hemólisis. Se usa una dilución 1:100
o Leucocitos y plaquetas: se usa líquido de dilución que produce
hemólisis de hematíes para permitir el recuento de leucocitos más fácil.
A mayores, el líquido también colorea las células, lo que permite una
mejor visualización. Se usa una dilución 1:10.
 Cámara de recuento.
 Microscopio.
Cuando se tiene preparada la dilución se coloca la muestra en una cámara de recuento,

que se recubre con un cubreobjetos. En la cámara se cuentan las células que hay en un
recuadro (como se ve en la imagen) y se hace el cálculo.
15
Es importante destacar que el cubre se coloca sobre dos pestañas laterales que
producen que entre el cubre y la cámara de conteo haya un espacio de 0,1mm. En
consecuencia a esto, cuando ponemos líquido entre el cubreobjetos y la cámara hay un
volumen que viene determinado por las tres longitudes de la cámara: 0,1mm de altura,
y otras dos medidas de anchura y largo que vienen determinadas por el tipo de cámara
que estemos usando. Por ejemplo, en la Cámara de Thoma, cuyas medidas del
recuadro son 1mm x 1mm, tenemos un volumen de 0,1mm3 de líquido, por lo que
podemos extrapolar el resultado al volumen sanguíneo total.
3.2.2. RECUENTO AUTOMÁTICO

Puede realizarse mediante impedancia o resistencia eléctrica o por dispersión óptica.
3.2.2.1. IMPEDANCIA O RESISTENCIA ELÉCTRICA

El autoanalizador coge muestras y las va mezclando con diferentes reactivos, según
para el análisis que se trate. El número de canales por donde circula la sangre varía con
el modelo. El método se basa en que las células sanguíneas presentan resistencia a la
corriente eléctrica mientras que el líquido de dilución no. Cada vez que pasa una célula
por el electrodo (pasan de una en una, porque el tamaño del camino es muy pequeño)
se produce un cambio de voltaje, que además de cuantificar el número, va a tener
diferentes niveles de manera que cuanto mayor sea la célula, mayor el cambio de
voltaje, pudiendo cuantificarse también el tamaño.
3.2.2.2. DISPERSIÓN ÓPTICA

Se basa en que si hay una fuente de luz, cuando pasa una célula, la luz choca y se
dispersa. Lo más frecuente es usar rayos láser. La sangre se hace pasar por un canal
muy fino de manera que se cuentan las células de una en una. La dispersión va a ser
mayor o menor según el tamaño celular, al igual que los cambios de voltaje en el método
anterior. La dispersión se recoge mediante espejos y lentes.
Usemos el método que usemos, se obtiene un hemograma (imagen de la página

siguiente). En él podemos ver:
 Recuento de leucocitos, eritrocitos y plaquetas (marcado por un óvalo de color

rojo).
 Índices eritrocitarios, marcados por un recuadro azul. Son índices eritrocitarios
el VCM, el hematocrito…
 Se indican con letras H o L si los niveles son elevados o bajos respectivamente.
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 Gráficos a la derecha que indican el volumen celular y plaquetario.

 Fórmula leucocitaria, también con gráficos.
En los últimos años se integró en los autoanalizadores canales para detectar

reticulocitos, que son células inmediatamente anteriores a los hematíes maduros. Se
denominan así porque tienen restos de núcleo (ARN) formando retículas. En la génesis
de eritrocitos se va perdiendo el núcleo y adquiriendo hemoglobina. Lo normal es tener
valores de reticulocitos sobre un 5% (porque la médula también envía células
inmaduras). Es importante realizar mediciones de reticulocitos para ver cómo trabaja la
médula:
 Tras un trasplante de médula.

 En tratamientos de quimioterapia, los cuales pueden dañar la médula.
Para medir reticulocitos se aprovecha la presencia de ARN, usándose un colorante que

se une al ARN, lo que permite diferenciarlo de un eritrocito maduro.
3.3. FÓRMULA LEUCOCITARIA

Se hace, además del contaje global de
leucocitos, un contaje específico para cada tipo
de leucocito (linfocitos, monocitos, eosinófilo,
basófilo y neutrófilos).
Para que el autoanalizador pueda diferenciar

entre cada tipo de leucocito se usan dos
principios:
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 Los glóbulos blancos pueden tener actividad peroxidasa.

 Además, tienen diferente tamaño.
Para conocer la actividad peroxidasa se usa el sustrato para la peroxidasa, formándose

un precipitado oscuro. Según la cantidad de precipitado, más peroxidasa, obteniéndose
el siguiente gráfico:
A la derecha de la gráfica se aumenta la actividad peroxidasa. Neutrófilos y eosinófilos

tienen actividad peroxidasa ALTA. Entre ellos dos se pueden diferenciar mediante el
tamaño, que aumenta hacia arriba en la gráfica.
Linfocitos y basófilos no tienen peroxidasa, y tampoco las LCU (Large Uncoloured Cells).
Para diferenciar linfocitos de basófilos se usa un reactivo, no iónico con pH<3, que
rompe la membrana de todas las células menos la de los basófilos. Por tanto, del resto
de células sólo queda el núcleo (lo que se cuenta como célula pequeña) y los únicos
contados son los basófilos.
Por tanto, Neutrófilos son grandes con actividad peroxidasa y eosinófilos son pequeños
con actividad peroxidasa. Los linfocitos son grandes sin actividad peroxidasa, y los
basófilos son pequeños sin actividad peroxidasa. Los monocitos son células grandes
con actividad peroxidasa.
3.4. RECUENTO DE HEMOGLOBINA

Se usa un método colorimétrico. La hemoglobina está dentro de los hematíes, por tanto,
hay que producir hidrólisis de la muestra. Los valores normales de hemoglobina se
muestran en el tema 4.
3.5. ÍNDICES ERITROCITARIOS

Son:
 VCM: Volumen corpuscular medio: Tamaño medio de hematíes: entre 80 y 100

fL4.
 HCM: Hemoglobina corpuscular media: Cantidad de Hb por hematíe.
 CCMH: Concentración corpuscular media de Hemoglobina: VALOR
IMPORTANTE. Aunque la cantidad de Hb sea normal, puede haber baja
concentración (célula grande) o alta concentración (célula pequeña).
4 Femtolitros.
18
3.5.1. CÁLCULO DE VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO (VCM)

Se calcula a partir del hematocrito y del número de hematíes mediante la siguiente
fórmula:
𝐻𝑒𝑚𝑎𝑡𝑜𝑐𝑟𝑖𝑡𝑜 (𝐿/𝐿)
𝑉𝐶𝑀 =
𝑛º 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚𝑎𝑡í𝑒𝑠 (𝑥1012 /𝐿)
3.5.2. CÁLCULO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA (HCM)

Se determina mediante el cociente entre el valor de concentración de Hemoglobina en
sangre total (g/L) y el número de hematíes por litro (L):
𝐻𝑒𝑚𝑜𝑔𝑙𝑜𝑏𝑖𝑛𝑎 (𝑔/𝐿)
𝐻𝐶𝑀 =
𝑛º 𝑑𝑒 ℎ𝑒𝑚𝑎𝑡í𝑒𝑠 (𝑥1012 /𝐿)
3.5.3. CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN CORPUSCULAR MEDIA DE

HEMOGLOBINA (CCMH)
Corresponde a la concentración de Hemoglobina en un litro de hematíes y se calcula
a partir de la concentración de hemoglobina por litro (L) en sangre y del valor
hematocrito:
𝐻𝑒𝑚𝑜𝑔𝑙𝑜𝑏𝑖𝑛𝑎 (𝑔/𝐿)
𝐶𝐶𝑀𝐻 =
𝐻𝑒𝑚𝑎𝑡𝑜𝑐𝑟𝑖𝑡𝑜 (𝐿/𝐿)
19
20
Tema 4
4. HEMOGRAMA Y ANEMIA
4.1. ANEMIA
Se define anemia como una disminución en la capacidad de la sangre para
transportar oxígeno a los tejidos, lo que provoca hipoxia tisular. También se puede
definir como una disminución en la concentración de hemoglobina (Hb) en sangre.
Síntomas de la anemia (el conjunto se denomina “Síndrome anémico”:
 Manifestaciones generales:
o Astenia.
o Anorexia.
o Disnea de esfuerzo.
 Manifestaciones cutáneas:
o Palidez de piel y mucosas.
 Manifestaciones cardiovasculares:
o Taquicardia.
o Soplo sistólico funcional, provocado por la sangre al salir del corazón.
 Manifestaciones neurológicas:
o Trastornos visuales.
o Cefaleas.
o Alteraciones de la conducta.
 Otras manifestaciones:
o Amenorrea.
o Trastornos digestivos.
Todos estos síntomas aparecen debido a la mala oxigenación tisular. Los tejidos más
afectados son los que tienen más dependencia de oxígeno.
Según la OMS, se considera anemia cuando los valores de hemoglobina están por
debajo de:
 110 g/L en niños de 6 meses a 6 años.

 120 g/L en niños de 6 a 14 años.
 130 g/L en varones adultos.
 120 g/L en mujeres adultas.
 110 g/L en mujeres embarazadas.
4.1.1. DIAGNÓSTICO DE LA ANEMIA

El diagnóstico se realiza en tres puntos clave:
 Anamnesis: evaluación de la historia clínica del paciente (antecedentes

familiares, trabajo, operaciones…)
 Evaluación física: se vería palidez, taquicardia, etc. Se trata de observar los
síntomas característicos del síndrome anémico.
21
 Laboratorio: que conlleva:

o Recuento de glóbulos rojos.
o Análisis de hemoglobina. Hematocrito.
o Índices eritrocitarios.
o Reticulocitos.
o Frotis de sangre periférica.
o Dinámica de hierro, folatos y vitamina B12.
o Pruebas para medir la destrucción eritrocitaria.
4.1.2. CAUSAS Y TRATAMIENTO DE LA ANEMIA

A partir de un hemograma no solo podemos determinar si existe o no anemia, sino que
también podemos saber la etiología de la misma. Recordemos que el hemograma es el
estudio de los elementos formes de la sangre (recuento, hemoglobina, hematocrito…).
4.1.3. RESPUESTA DEL ORGANISMO ANTE UNA ANEMIA

Ante una falta de O2 tisular se estimula la liberación de Eritropoyetina (EPO) por el riñón,
que actúa sobre la médula ósea para aumentar la síntesis de hematíes. Al trabajar con
rapidez, la médula genera más eritroblastos de lo normal. Esto provoca un aumento
de reticulocitos en sangre. Para realizar la determinación de reticulocitos se
aprovecha que el reticulocito todavía tiene RNA en su citoplasma, el cual se tiñe con
azul de cresilo. Basándonos en la presencia o no de reticulocitos distinguimos dos tipos
de anemia:
 Anemia regenerativa o periférica: aparecen más reticulocitos de lo normal en

sangre. Hay anemia, pero la causa no es medular (funciona correctamente, se
generan reticulocitos).
 Anemia arregenerativa o central: hay igual número o menos reticulocitos de
lo normal en sangre. Hay anemia, y es por causa central (la médula no funciona
correctamente).
4.1.4. CARACTERÍSTICAS DE LOS HEMATÍES

Una vez que sabemos que existe anemia y conocemos si es central o periférica,
podemos diferenciar el tipo de anemia gracias a los índices eritrocitarios:
 Volumen corpuscular medio (VCM):

o Tamaño normal (80-100fL): anemia normocítica.
 Anemia hemolítica.
 Aplasia medular.
o Tamaño pequeño (<80fL): anemia microcítica.
 Talasemia:
 Anemia ferropénica.
 Esferocitosis.
o Tamaño grande (>80fL): anemia macrocítica.
 Anemias megaloblásticas.
 Anemias hemolíticas.
 Aplasia medular.
 Cantidad de hemoglobina:
o Poca hemoglobina: anemia hipocrómica.
o Hemoglobina normal: anemia normocrómica.
22
23
4.1.5. PRINCIPALES ANEMIAS PERIFÉRICAS

El número de reticulocitos aumenta:
 Anemia hemorrágica: a veces evidentes, a veces por hemorragia interna. Se

compensa por la producción de EPO.
 Hemolíticas: ruptura de células a una velocidad anormalmente elevada:
o Hereditarias:
 Esferocitosis hereditaria: defectos en la membrana. Fallos en los
genes que codifican las proteínas del citoesqueleto.
 Anemia drepanocítica: cambio de Hb A por Hb S, con mayor
tendencia a la agregación, formando drepanocitos, que se
eliminan en el bazo.
 Talasemias: alteraciones en la síntesis de globinas.
o Adquiridas:
 Infecciones parasitarias: paludismo (hemólisis).
 Fármacos.
 Reacciones autoinmunes.
4.1.6. HIERRO
El hierro se encuentra en el organismo en:
 Hierro plasmático o sideremia.

 Ferritina: depósitos de hierro.
 Transferrina: transporta hierro en el plasma (mayormente a la médula ósea).
 TIBC (o CTFH): capacidad total de fijación del hierro en sangre. Más alta de lo
normal cuando las reservas de hierro son bajas.
 IST: capacidad de fijación del hierro a la transferrina.
Cuando se inicia una anemia disminuye la cantidad de hierro en los depósitos (aumenta
la TIBC y disminuye la ferritina) pero el hierro sérico y la cantidad de hemoglobina siguen
normales. A medida que la anemia avanza se van obteniendo valores de hierro sérico y
hemoglobina más bajos.
24
Tema 5
5. RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
5.1. COMPONENTES DE LA SANGRE
Vamos a centrar la atención en los leucocitos. Es necesario realizar la fórmula
leucocitaria o recuento diferencial. Consiste en realizar frotis sanguíneos, por lo que
necesitamos dos portaobjetos y una gota de sangre. Mediante el deslizamiento de un
portaobjetos sobre otro se obtiene el frotis que, tras teñirse y observarse con el objetivo
de inmersión, se observan las células sanguíneas, entre ellas los leucocitos. Hay
muchos tipos de leucocitos, con morfología diferente.
La fórmula leucocitaria consiste en contar 100 leucocitos haciendo movimiento en zigzag

por el portaobjetos, de los cuales, habrá diferentes cantidades de cada tipo. No es un
recuento leucocitario estricto, ya que no se cuenta el total en sangre, sino el porcentaje
de cada tipo.
Una vez realizada la fórmula leucocitaria, se detectan fallos en la cantidad o en la

morfología de los leucocitos.
5.2. TRASTORNOS CUALITATIVOS

Aparecen más frecuentemente en granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) y
sobre todo en las células polimorfonuclearles (PMF o neutrófilos).
Podemos mencionar dos grandes alteraciones:
 Alteraciones morfológicas: fundamentalmente pueden ser:

o Nucleares: no tienen gran relevancia clínica y no suelen alterar la
capacidad nuclear.
 Anomalía de Pelger-Huët: la cromatina
sufre una condensación patológica, lo que
va a causar una incapacidad del núcleo
para segmentarse. El núcleo tiene
aspecto redondeado y ovalado. Se
observa en infecciones graves y en
anemia perniciosa.
 Hipersegmentación: lo normal es que la
segmentación produzca 4 o 5 lóbulos. La
hipersegmentación se caracteriza por la
presencia de más de 5 lóbulos y células
grandes. Aparece en anemias
megaloblásticas, uremia (sustancias
nitrogenadas en sangre), en insuficiencia
renal y por déficit de hierro.
25
o Citoplasmáticas: van asociadas a un estrés severo en el organismo

(infecciones graves, quemaduras, etc.). Veamos las más típicas:
 Anomalía de Alder-Reilly o
hipergranulaciones: gránulos muy
grandes de color violeta oscuro. Se
generan como consecuencia de
acúmulos de glucopolisacáridos que
no se pueden destruir. Cuesta
distinguir el núcleo.
 Granulaciones tóxicas: son
granulaciones de gran tamaño (no
tanto como las anteriores) con
coloración basófila (azul oscuro, por
azul de metilen). Se ve el núcleo
perfectamente. Aparece por
infecciones bacterianas.
 Cuerpos de Döhle: inclusiones
rectangulares u ovaladas en el
citoplasma con posición excéntrica
(no en el centro celular). Coloración
de gris a celeste. Aparece en
infecciones y quemaduras graves.
 Síndrome de Chédiak-Higashi:
aparecen gránulos muy grandes
generados por la fusión de
lisosomas. Se asocia con el
albinismo y aparece en infecciones
piógenas.
 Células LE (Lupus eritematoso):
contienen un núcleo fagocitado. El
neutrófilo fagocita a una célula. El
núcleo hialinizado queda en el centro
celular y el núcleo del neutrófilo se
encuentra aplastado en la periferia.
 Hiperbasofilia: citoplasma con
intensa coloración azulada. Típico en
infecciones víricas.
 Alteraciones funcionales: antes vamos a recordar las funciones de los

leucocitos. Son células que circulan por sangre, pero tienen función
extravascular. Si se produce un daño en un tejido se desarrolla un proceso
infeccioso e inflamatorio, ocurriendo marginación (fijación al endotelio),
diapédesis (salida al medio dañado), quimiotaxis (atracción al foco
inflamatorio) y fagocitosis con desgranulación.
Teniendo esto en cuenta, podemos observar distintas alteraciones funcionales:
26
o Alteraciones en la adherencia: déficit de integrinas (que se unen al

endotelio). La administración de glucocorticoides y salicilatos no
favorecen la marginación leucocitaria.
o Defectos en la quimiotaxis: el leucocito se adhiere y sale al medio
dañado, pero el leucocito se mueve al azar o no se mueve. Puede estar
causado por:
 Déficit en la fracción C3 del complemento.
 Síndrome del leucocito perezoso.
 Alteraciones metabólicas: diabetes, alcoholismo…
o Fallo en la opsonización y fagocitosis: para que el patógeno sea
fagocitado debe recubrirse con opsoninas. Si no se recubre, disminuye
la fagocitosis. Ocurre en:
 Hepatopatías.
 Cetoacidosis diabética.
 Artritis reumatoide.
o Disminución de la actividad oxidativa: un déficit de NADPH oxidasa.
Esta enzima está en la membrana del neutrófilo y transforma el O2 en ión
superóxido, formándose peróxido de hidrógeno. Un déficit de esto
produce disminución de radicales libres, por lo que disminuye la actividad
oxidasa. Aparece en la enfermedad granulomatosa crónica de la infancia.
o Déficil de mieloperoxidasa: que está encargada de formar ácido
hipocloroso (HClO) a partir de H2O2 y Cl-. El ácido hipocloroso tiene
función bactericida. Un déficit de mieloperoxidasa produce disminución
de ataque a bacterias.
5.3. TRASTORNOS CUANTITATIVOS

Debemos remarcar primero los valores normales de leucocitos:
Neutrófilos 40-75%
Linfocitos 20-45%
Monocitos 2-10%
Eosinófilos 1-6%
Basófilos ≤1%
5.3.1. NEUTROPENIA
Ocurre neutropenia cuando el porcentaje de neutrófilos es menor al 40%. Puede
estar causada por:
 Disminución en la producción a nivel de la médula ósea (aplasia medular):

esto sucede en el tratamiento con quimioterápicos, déficit de B12 y ácido fólico
(necesarios para la maduración celular).
 Por aumento de su utilización: en infecciones víricas (gripe, rubeola,
sarampión, varicela) y excepcionalmente en infecciones bacterianas
(tuberculosis, brucelosis y fiebre tifoidea).
 Destrucción aumentada: en hepatopatías, hiperesplenismo y enfermedades
autoinmunes (anticuerpos contra neutrófilos): neutropenia autoinmune.
 Neutropenia transitoria: mientras se administra un fármaco solamente. Está
asociada a la administración de antidepresivos, sales de oro inyectables y
paracetamol.
27
 Neutropenia extrema: cuando el porcentaje de neutrófilos cae por debajo del

10%. Se denomina agranulocitosis. Siempre asociada a fármacos:
o Fármaco tóxico a la médula (mielotoxicidad): pirazolonas,
barbitúricos, bismuto, antimonio…
o Respuesta inmunoalérgica al fármaco: el fármaco se comporta como
un hapteno (antígeno parcial), que se convierte en antígeno al unirse a la
proteína de la membrana del neutrófilo (destruyéndose el neutrófilo).
5.3.2. LINFOPENIA
Ocurre linfopenia cuando el porcentaje de linfocitos es menor al 20%. Característico
en:
 Individuos con inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

 Secundaria a tratamiento con quimioterápicos y glucocorticoides
(antiinflamatorio e inmunosupresor).
 Infecciones graves que se prolongan en el tiempo: tuberculosis avanzadas,
hepatitis.
 Linfopenia reactiva:
o Asociada a neutrofilia: si hay mucho neutrófilo, se cuentan menos
leucocitos. Hay que observar el porcentaje del resto de leucocitos:
 Linfopenia: aumentan todas las células.
 Neutrofilia: neutrófilos muy elevados.
5.3.3. NEUTROFILIA
Ocurre cuando el porcentaje de neutrófilos supera al 75%. Puede deberse a:
 Aumento en la producción medular. Muy común. Aparecen en circulación

sanguínea muchos neutrófilos inmaduros, con el núcleo cayado. A esto se le
denomina desviación a la izquierda. En la imagen vemos un neutrófilo cayado
(inmaduro) a la izquierda, y un neutrófilo segmentado (maduro) a la derecha.
Esto es característico de:

o Infecciones bacterianas y micóticas excepto las causadas por
tuberculosis, fiebre tifoidea y brucelosis, que cursan con neutropenia.
o Procesos inflamatorios: vasculitis.
o Necrosis por infarto.
 Consecuencia de una mayor retención de neutrófilos en sangre: no salen
del tejido vascular. El tratamiento con glucocorticoides, AINEs e incluso
adrenalina provocan retención de neutrófilos. No hay desviación a la izquierda.
 Neutrofilia fisiológica: no tiene por qué ser siempre patológica. Puede ocurrir
por un desplazamiento de la reserva marginal a la reserva circulante. Muchas
veces los neutrófilos adheridos a la pared vascular pasan a circulación. Ocurre
por:
o Ejercicio físico intenso.
28
o Ansiedad, ira, miedo.

o Digestión.
o Embarazo.
5.3.4. EOSINOFILIA
Ocurre cuando el porcentaje de eosinófilos supera el 6%. Causada por:
 Procesos alérgicos: asma, hipersensibilidad a fármacos, fiebre del heno, rinitis

alérgica, vasculitis alérgica. Se llegan a valores del 15%.
 Infestación parasitaria por helmintos.
 Infecciones agudas: escarlatina, sarampión.
 Infecciones crónicas: meningitis, tuberculosis, lepra.
 Enfermedades de la piel: eccemas, psoriasis, pénfigo, urticaria.
5.3.5. BASOFILIA
Ocurre cuando el porcentaje de basófilos supera el 1%. Poco frecuente y con escaso
valor diagnóstico:
 Relacionados a trastornos alérgicos: dermatitis de contacto, hipersensibilidades.

 Enfermedades víricas: varicela y viruela.
 Endocrinopatías: hipotiroidismo y diabetes.
5.3.6. LINFOCITOSIS
Ocurre cuando el porcentaje de linfocitos supera el 45%. Puede ocurrir por:
 Linfocitosis relativa: secundaria a neutropenia. Si disminuyen los neutrófilos,

aumenta el recuento de linfocitos (en porcentaje).
 Fisiológica: en la primera infancia, desde los 5 meses a los 5 años.
 Infecciones víricas: mononucleosis infecciosa, hepatitis A, varicela, paperas,
rubeola, sarampión, gripe, etc.
 Infecciones bacterianas (en la fase de recuperación): tos ferina y sífilis.
5.3.7. MONOCITOSIS
Ocurre cuando el porcentaje de monocitos supera el 10%. Aparece en:
 Infecciones granulomatosas5: tuberculosis (muy característico) y brucelosis.

 Infecciones parasitarias: paludismo, leishmaniosis.
 Enfermedades inflamatorias: artritis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso.
5 En las que el sistema inmune forma granulomas, para evitar que avance la infección.
29
30
Tema 6
6. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE TRASTORNOS
HEMORRÁGICOS
Hay que recordar que el objetivo de la hemostasia es mantener la sangre en el circuito
sanguíneo, siguiendo tres fases:
 Fase vascular: contracción de los vasos sanguíneos. Hemostasia primaria.

 Fase plaquetaria. Hemostasia primaria.
 Fase plasmática (coagulación). Hemostasia secundaria.
6.1. EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

6.1.1. PRUEBAS QUE VALORAN LA FASE VASCULAR
6.1.1.1. ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD CAPILAR: PRUEBA DE RUMPEL LEEDE O

DEL LAZO
Se somete al capilar a una presión traumática. Se requiere el esfigmomanómetro. Se
coloca el manguito en el brazo, exactamente igual que para medir la presión, y se ejerce
un valor de presión que se encuentre entre la presión sistólica y diastólica. Esto permite
que el flujo de sangre pase hacia el brazo, pero no puede retornar. Se prolonga esta
prueba durante 5 minutos. Después, se establece una circunferencia en la cara del
antebrazo con un diámetro de 5 centímetros y se cuentan las petequias que aparecen
dentro del mismo. Si aparecen más de 10 petequias se considera que existe fragilidad
vascular.
6.1.2. PRUEBAS QUE VALORAN LA FASE PLAQUETARIA

Valoran la formación del tapón plaquetario.
6.1.2.1. RECUENTO PLAQUETARIO

Se recoge sangre y se cuentan plaquetas en una cámara de conteo. Condiciones:
 El líquido de dilución debe evitar la agregación plaquetaria.

 El líquido de dilución debe provocar hemólisis, para contar mejor las plaquetas.
 El microscopio debe tener contraste de fases, ya que las plaquetas las vemos
con un halo de refligencia.
Si hay entre 150 y 450 gigaplaquetas (x109) hay un número normal.
6.1.2.2. TIEMPO DE HEMORRAGIA O TIEMPO DE SANGRÍA

Valora la capacidad de la plaqueta para formar el tapón plaquetario. Es una prueba
cronométrica. Hay dos formas de realizarla:
 Método de Duke: incisión horizontal en el lóbulo de la oreja de 2mm. Se va

secando la sangre con papel secante sin tocar los bordes del tejido roto. Se seca
hasta que se empapa de sangre el papel. Es un método impreciso, ya que la
incisión no siempre es igual.
31
 Método de Ivy actualizado: se utiliza una lanceta especial y el corte se realiza

en la cara anterior del antebrazo. Condiciones:
o Lanceta de 5mm de largo y 1mm de profundidad.
o Se hace en el antebrazo a 3cm del pliegue del codo.
o Presión constante de 40mmHg.
o Se seca la hemorragia cada 30 segundos.
Si un tiempo de sangría diera aumentado podríamos pensar que se trata de una

trombocitopenia. Si al realizar el conteo el número de plaquetas es adecuado, podemos
afirmar que hay una alteración en la función plaquetaria.
6.1.2.3. AGREGOMETRÍA PLAQUETARIA

Se parte de plasma rico en plaquetas, que se obtiene recogiendo sangre con
anticoagulantes y centrifugando a bajas rpm, para que las plaquetas no precipiten. Una
vez que tenemos el plasma rico en plaquetas se le añade un inductor de la agregación,
como puede ser trombina, adrenalina, ADP… Se agregan las plaquetas y sedimenta el
tapón plaquetario. El plasma entonces pierde turbidez. El agregómetro mide el
aclaramiento del plasma (cuanto más claro, mayor agregación),
6.2. EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA SECUNDARIA

6.2.1. PRUEBAS QUE VALORAN LA FASE PLASMÁTICA O COAGULACIÓN
6.2.1.1. PRUEBAS GLOBALES

Debemos recordar que hay dos vías en la coagulación:
 Vía extrínseca: se activa al contacto con el factor tisular.

 Vía intrínseca: se activa al contacto con cargas negativas (por ejemplo: placa de
ateroma, vidrio del tubo de ensayo).
Ocurren una serie de reacciones en cascada que llevan a la formación del coágulo.
6.2.1.1.1. TIEMPO DE COAGULACIÓN. VÍA INTRÍNSECA

Hay que extraer sangre del individuo sin anticoagulante. 1 mL se deposita en un tubo y
medimos el tiempo que tarda en formarse el coágulo. Si estuviese alargado el tiempo
de coagulación, podrían estar afectados los factores que actúan en la vía intrínseca
(FXII, FXI, FIX, FX FVIII, FV, FII, y FI).
6.2.1.1.2. TIEMPO DE RECALCIFICACIÓN

Se debe obtener plasma descalcificado. Para ello se recoge sangre con anticoagulante
que secuestre el calcio, como el citrato sódico al 3,8% y en proporción 1:9 con la sangre.
Al centrifugar se obtiene plasma descalcificado. En él existen todos los factores salvo el
FIV (Ca+2). En el momento que se añade calcio, debe ocurrir la coagulación.
6.2.1.2. PRUEBAS ESPECÍFICAS

En todas se usa plasma descalcificado.
6.2.1.2.1. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP) O TIEMPO DE QUICK. VÍA EXTRÍNSECA

Permite explorar la vía extrínseca. Se necesita de nuevo plasma descalcificado. Se debe
añadir factor tisular (tromboplastina hística comercial) y calcio al medio. En el momento
que se añade el calcio se comienza a contar. Si el tiempo de protrombina da aumentado
32
se verían afectados los factores de la coagulación de la vía extrínseca (FVII, FX, FV,
Protrombina y fibrinógeno.
Esta prueba se utiliza para valorar la coagulación en pacientes que toman

anticoagulantes orales. El Sintrom es un anticoagulante oral que bloquea a la vitamina
K. Hay factores de la coagulación que son vitamina K dependientes:
 FII
 FVII: con vida media más corta.
 FIX
 FX
La tromboplastina hística comercial tiene un pequeño problema: dependiendo del

laboratorio que lo suministrase, los resultados eran diferentes. Se creó entonces el INR:
cociente corregido que permite relacionar los resultados obtenidos con diferentes
tromboplastinas:
𝐼𝑁𝑅 = [(𝑇𝑃 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒)/(𝑇𝑃 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)]𝐼𝑆𝐼
Donde ISI es un índice de sensibilidad internacional que compara las tromboplastinas

comerciales con una que se toma como control
Cada tromboplastina tiene su propio isi, generalmente muy próximo a la unidad. Así
pacientes con anticoagulantes orales tienen un INR comprendido entre 1,5 y 4,5. Un
INR mayor a 4,5 indica que está excesivamente anticoagulado (TP paciente mucho
mayor al del control) y menor a 1,5 muy poco anticoagulado.
El riesgo de trombosis o embolias aumenta si el INR desciende por debajo de 2.
El riesgo de hemorragias aumenta si el INR aumenta por encima de 4.
Un paciente que tiene un INR=1 es aquel que no recibe terapia anticoagulante.
6.2.1.2.2. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA ACTIVADA (TTPa) O TIEMPO DE

CEFALINA. VÍA INTRÍNSECA
Necesitamos un plasma descalcificado, al cual le vamos a adicionar unos fosfolípidos
(cefalina) que imitan la acción de los fosfolípidos plaquetarios, una sustancia cargada
negativamente (caolín) que active la formación del coágulo por la vía intrínseca y calcio.
Si nos diera alargado podríamos concluir que los factores FXII, FXI, FIX, FVIII, FV, FII
(vía intrínseca) se ven afectados.
Si previamente hemos hecho el tiempo de protrombina (vía extrínseca) y vemos que es

normal, podemos descartar la afectación de algunos factores, concluyendo que los
factores afectados son FXI, FXII, FIX y FVIII.
6.2.1.2.3. EVALUACIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN DE FIBRINÓGENO EN FIBRINA

(POR PROTROMBINA)
Podemos realizar esta evaluación por el Tiempo de Trombina (TT) o por el Tiempo de
Reptilasa (TR).
33
6.2.1.2.3.1. TIEMPO DE TROMBINA (TT)

Se usa un plasma descalcificado. Le adicionamos trombina comercial y calcio. Al
añadirlos, se forma el coágulo. Si el TT estuviera alargado, podríamos suponer:
 Hipofibrinogenia: poco fibrinógeno.

 Heparinemia: concentración de fibrinógeno normal, pero TT alargado: por culpa
de heparina, que bloquea la acción de la trombina, y por tanto la formación del
coágulo.
6.2.1.2.3.2. TIEMPO DE REPTILASA (TR)

Se usa plasma descalcificado y añadimos Reptilasa (se extrae del veneno de una
serpiente). Transforma fibrinógeno en fibrina y no es sensible a la heparina. Si el TR da
alargado, se concluye que la causa es la Hipofibrinogenia.
34
Tema 7
7. TERAPIA ANTICOAGULANTE, ANTIPLAQUETARIA Y
TROMBOLÍTICA
7.1. ANTICOAGULANTES O INHIBIDORES DE LA COAGULACIÓN
Retrasan o suprimen la coagulación. Tres grupos:
I. Circulantes: sustancias naturales, presentes en el organismo de forma natural,

que ejercen una función reguladora de la coagulación. Los más nombrados:
a. Antitrombina III: Glucoproteína sintetizada en el hígado cuya principal
acción va a ser bloquear a la trombina (FIIa), FXa, FXIIa, FIXa y FXIa.
La presencia de heparina acelera la acción de la antitrombina III. Ésta se
une a la antitrombina II provocando un cambio conformacional que
incrementa su actividad.
b. Proteínas C y S: son proteínas vitamina K dependientes. En ausencia
de vitamina K, su síntesis se ve alterada. Su principal acción es inactivar
a los cofactores FV (que forma complejo con FXa) y FVIII. Se activan por
la trombina. La trombina activa a la proteína C, que se une a la proteína
S. Ese complejo formado inactiva a los cofactores FV y FVIII.
En condiciones normales se forma un coágulo en el sitio de la lesión y estas

sustancias controlan que no se forme un coágulo donde no debe. Su déficit
predispone a la formación de tromboémbolos
II. Acción in vivo: son sustancias que impiden la formación y el crecimiento de un
coágulo. Se administran en situaciones de alto riesgo de trombosis venosas,
embolia pulmonar o ictus. Los trombos formados en circulación venosa pueden
llegar fácilmente a la circulación arterial, ya que la circulación venosa aumenta
el calibre de sus vasos a medida que se acerca al corazón, al revés que la
arterial. Se usan:
35
a. Heparina: glicosaminoglicano sulfatado (mucopolisacárido). Su

administración se realiza por vía subcutánea o intravenosa, ya que no se
absorbe por el tracto gastrointestinal. Tampoco se debe administrar por
vía intramuscular, ya que causa hematomas. Ejerce su acción uniéndose
a la antitrombina III. Se puede administrar:
i. A dosis bajas como profiláctico, para evitar la formación del
coágulo.
ii. A dosis altas, para evitar el crecimiento de un coágulo formado.
b. Anticoagulantes orales: como su propio nombre indica, se administran
por vía oral. La acción, por tanto, es más lenta, ya que hay que añadir el
proceso de absorción. Los más conocidos son los derivados de las
cumarinas, y dentro de ellos el acenocumarol, comercializado con el
nombre de Sintrom. Interfiere en la acción de la vitamina K. FII, FVII, FIX
y FX son factores dependientes de viamina K. Al administrar
acenocumarol se impide la acción de la vitamina K en la formación de los
4 factores. El factor más sensible a esto es el FVII (Vía extrínseca) ya
que tiene una vida media muy corta. Es por esto que, en los individuos
con este tratamiento, se usa el tiempo de protrombina (TP), con el índice
INR (Vía extrínseca).
III. Acción in vitro: usados en laboratorios. Evitan la coagulación fuera del
organismo. Deben tener unas características:
a. Ser solubles en sangre.
b. No alterar la morfología celular.
c. No hemolizar.
d. Impedir la agregación plaquetaria.
e. Conservar la muestra el máximo de tiempo (25h a 4ºC).
Se usan:
o EDTA: en forma de sal disódica o tripotásica. Quelata los iones de Ca+2,
generando su efecto.
o Heparina sódica6: su acción la realiza igual que la heparina.
o Citrato sódico (3,8%): se une al Ca+2, formando citrato cálcico.
o Solución CPD-A: usada en bancos de sangre. Está constituida por
citrato (anticoagulante), fosfatos (tampón), dextrosa y adenina (ambos
sustratos para que las células perduren en el tiempo). Con esta solución
se prolonga la vida de la sangre (35 días a 4ºC).
7.2. ANTIAGREGANTES
Impiden la adhesión, la activación y/o agregación plaquetaria. Inhibe pues la formación
del tapón plaquetario. Un individuo con antiagregantes tiene el tiempo de sangría
alargado. Es importante su administración para prevenir el desarrollo de trombos, sobre
todo trombos arteriales7. Se usan:
 AAS: a dosis bajas. Inhibe la COX e impide la formación de sustancias

proagregantes como los tromboxanos.
6 No confundir con heparina normal (Anticoagulantes de acción in vivo).

7 A diferencia de los anticoagulantes, que se usan para prevenir trombos venosos.
36
 Dipiridamol: disminuye la actividad fosfodiesterasa, aumentando el AMPc

celular, por lo que se bloquea la formación de A. araquidónico, y, en
consecuencia, sus metabolitos, como el tromboxano.
 Abciximab: de uso hospitalario. Antagoniza los receptores de glucoproteínas
GPIIb/IIIa de la superficie plaquetaria. Muy usado en infartos de miocardio.
En general se usan para:
 Cardiopatías isquémicas.
 Enfermedad cerebrovascular isquémica.
 Prevención y fase aguda de trombosis arteriales.
7.3. TROMBOLÍTICOS
Sustancia con capacidad para disolver el coágulo. Se usan fundamentalmente en
individuos que sufren infarto agudo de miocardio, tromboembolia pulmonar, ictus
isquémico y trombosis arterial.
En el interior del coágulo queda retenido el plasminógeno. Los trombolíticos activan el

plasminógeno, transformándose en plasmina con alta actividad enzimática (disuelve el
coágulo). Ejemplos de trombolíticos:
 Endógeno: activador del plasminógeno tisular.

 Exógenos: estreptocinasa y urocinasa.
Están contraindicados en pacientes que tienen predisposición a hemorragias. Por

ejemplo, no se debe administrar a una persona que acaba de ser operado, a una mujer
embarazada o a un paciente con traumatismo de cadera (hemorragia importante).
37
38
Tema 8
8. INMUNOHEMATOLOGÍA
La inmunohematología es una parte de la hematología que estudia las reacciones
inmunológicas relacionadas con los componentes de la sangre.
Los grupos sanguíneos eritrocitarios son componentes antigénicos presentes en la

superficie del hematíe. Están relacionados directamente con la terapéutica transfusional
y la prevención de accidentes hemolíticos graves.
8.1. GRUPOS SANGUÍNEOS. SISTEMA AB0. SISTEMA RH

Como ya dijimos, los grupos sanguíneos son estructuras químicas con capacidad
antigénica, que se ubican en la membrana de las células hemáticas. Nos centraremos
principalmente en la membrana eritrocitaria.
Se reconocen casi una treintena de grupos sanguíneos, con más de 600 estructuras
antigénicas diferentes.
Un individuo con un grupo sanguíneo va a tener la capacidad de reconocer eritrocitos

en cuya membrana existan antígenos de un grupo alogénico distinto al propio y producir
anticuerpos contra ellos.
Hay diferentes maneras o métodos de evidenciar una reacción antígeno-anticuerpo:
 Aglutinación: se forman grumos por reacción de un anticuerpo con varios

hematíes, quedando unidos.
 Hemólisis: rotura del hematíe.
 Precipitación.
 Técnicas de ligando:
o RIA: Radioinmunoensayos. Poco usado, sustituido por ELISA.
o ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ensayo por
inmunoadsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en
la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo
enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como
cambio de color o algún otro tipo.
Dado que los antígenos eritrocitarios se encuentran en la superficie celular, las

reacciones más importantes son hemólisis y aglutinación.
8.1.1. SISTEMA AB0

El gen AB0, localizado en el cromosoma 9, posee tres alelos; A, B y 0. Un individuo
(diploide) poseerá dos de estos tres alelos. Los alelos A y B son codominantes entre sí
y producen enzimas capaces de transformar la sustancia H, presente en los
hematíes, en los antígenos A y B. El alelo 0 es recesivo, y no expresa ningún antígeno.
Por combinación de estos alelos obtenemos 6 genotipos distintos (AA, AB, A0, BB, B0
y 00) y 4 fenotipos (A, B, AB y 0).
39
8.1.1.1. ANTICUERPOS DEL SISTEMA AB0

Se generan anticuerpos contra el antígeno diferente. Estos anticuerpos son naturales
(no aparecen tras una reacción inmune, nacemos con ellos) y son del tipo IgM.
Un individuo que pertenece al grupo sanguíneo A presenta el antígeno A en su

membrana, y en plasma tiene anticuerpos anti-B.
Un individuo que pertenece al grupo sanguíneo B presenta el antígeno B en su

membrana, mientras que en plasma tiene anticuerpos anti-A.
Un individuo que pertenece al grupo sanguíneo AB presenta ambos antígenos en su

membrana, por lo que en su plasma no tiene ningún anticuerpo contra ellos.
Un individuo del grupo sanguíneo 0 no presenta ningún antígeno en su membrana, por

lo que en su plasma habrá los dos tipos de anticuerpos; anti-A y anti-B.
En España, los grupos sanguíneos mayoritarios son el A y el 0, siendo el AB el

minoritario.
8.1.1.2. FENOTIPO BOMBAY

En general, un individuo normal produce 1,2-fucosiltransferasa, enzima que transforma
una sustancia precursora en sustancia H. Hay individuos que no generan este
enzima, por lo tanto, no disponen de sustancia H. Estos individuos se denominan
fenotipo Bombay.
Al no disponer de sustancia H, los alelos A y B no pueden expresarse, por lo que se

asemejan al grupo sanguíneo 0. Pero, en su plasma, presentarían anticuerpos anti-A,
anti-B y, además, anti-H, que a 37ºC es capaz de hemolizar los hematíes de cualquier
individuo que no sea fenotipo Bombay.
8.1.1.3. DETERMINACIÓN DEL SISTEMA AB0

Para determinar el grupo sanguíneo se necesita un portaobjetos en el cual colocamos
dos gotas de sangre, una en cada extremo. A continuación, añadimos anticuerpos. A
una de las gotas le añado suero anti-A y, a la otra, suero anti-B. Observamos lo que
ocurre en cada gota de sangre, de manera que podemos obtener varios resultados:
 Gota con anti-A aglutinada y con anti-B no aglutinada: la sangre es de tipo A.

Existe el antígeno A que reacciona con el suero anti-A.
40
 Gota con anti-A aglutinada y con anti-B aglutinada: la sangre es de tipo AB. Hay
ambos antígenos.
 Gota con anti-A no aglutinada y con anti-B aglutinada: la sangre es de tipo B.
Hay antígeno B que reacciona con el suero anti-B.
 Gota con anti-A no aglutinada y con anti-B no aglutinada: la sangre es de tipo 0.
No hay antígenos que reaccionen.
Existe un concepto de donante universal (0) y receptor universal (AB) que puede llevar
a confusión. Si un individuo 1 (0) dona sangre completa a un individuo 2 (A), no habrá
reacción del anti-B existente en el individuo 2 con los hematíes del individuo 1. Pero sí
que habrá reacción con los anticuerpos anti-A existentes en la sangre (en poca
proporción) del individuo 1. A la inversa, si es el individuo 2 el que dona sangre completa
al individuo 1, habrá reacción severa de interacción entre anti-A presente en el individuo
1 y los antígenos A presentes en la membrana eritrocitaria del individuo 2. Concluimos
pues, que el concepto de donante universal solo es válido para donaciones de hematíes,
no de sangre completa. Evidentemente en una situación de vida o muerte, se puede
transfundir sangre 0(-)8 a un paciente A, ya que la reacción no es muy severa (poca
concentración de antígeno anti-A).
8.1.2. SISTEMA RH
Fue descubierto más tarde. Hay muchas teorías, explicamos la más reciente:
La teoría dice que existen dos genes:
a) Gen RHD: dominante. Codifica para el antígeno “D”. Cuando está presente, se
genera el antígeno D en la membrana del hematíe. Si no está presente, no hay
antígeno D, lo que se entiende como d9.
b) Gen RHCE: codifica para los antígenos “C”, “c”, “E” y “e”.
Además, hay un tercer gen, el RHAG que produce una proteína en la membrana del
hematíe que actuaría como sustancia precursora, de tal manera que su presencia
determina la expresión o no de algún antígeno del sistema Rh.
El antígeno más inmunogénico es el antígeno D. La presencia del mismo marca el valor

absoluto del factor Rh. Si está presente, hablamos de Rh+, y si está ausente, hablamos
de Rh-.
8.1.2.1. ANTÍGENO D DÉBIL (Du)

Se trata de un antígeno incompleto. El antígeno Du, cuando se enfrenta con anti-D, no
da reacciones o éstas son muy débiles. Esto puede llevar a error, y confundir a un
paciente con Du con un Rh-. Es poco frecuente en individuos caucásicos, pero más
frecuente en raza negra (22%). Para determinarlo se usa la prueba de Coombs
indirecta, la misma que para el fenotipo Bombay:
a) Directa: se detectan anticuerpos IgG adheridos a los glóbulos rojos in vivo. Si

hay anticuerpos unidos, al echar el reactivo de coombs (anti-IgG humana) se
aglutinará.
8Hay que tener en cuenta el sistema Rh que tratamos más adelante.

9d (minúscula) indica que NO hay antígeno D (mayúscula). No es otro antígeno diferente. No
confundir.
41
b) Indirecta: se determinan los anticuerpos existentes en suero o plasma del

paciente previa incubación in vitro del suero del paciente con unos GR
apropiados. Si existe aglutinación, es porque en el suero hay anticuerpos anti-
GR.
Es especialmente la detección en los donantes de sangre, porque el antígeno Du es

inmunogénico.
8.1.2.2. ANTICUERPOS ANTI-RH

No son anticuerpos naturales, no están en nuestro organismo. Son alo-anticuerpos.
Pueden llegar al organismo en el embarazo, parto o por transfusiones.
Son de tipo IgG. Estos anticuerpos anti-Rh están relacionados con una enfermedad
hemolítica fetoneonatal y con la reacción transfusional.
8.1.2.2.1. ENFERMEDAD HEMOLÍTICA FETONEONATAL

Se genera cuando el feto en el primer embarazo es Rh+ y la madre es Rh-. En el
momento del parto hay una comunicación directa entre la sangre del feto y de la madre,
al romperse la placenta. Por tanto, se generan ancuerpos anti-D. Al primer hijo no le
ocurre nada, porque en el momento que hay anticuerpos generados, el niño ya no está
en contacto directo con la madre. El problema aparece en un segundo embarazo, donde
42
la madre tiene anticuerpos anti-D y ataca a los hematíes de su hijo, Rh+, produciendo
la muerte del feto. Podemos detectar la presencia de estos anticuerpos anti-D usando
el test de coombs indirecto.
8.2. HEMOTERAPIA
Hace referencia a las transfusiones sanguíneas. Es un proceso eficaz y deseable, pero
puede inducir problemas graves si no se realiza correctamente, siguiendo las pruebas
necesarias. Lo peor que puede pasar es que ocurra una reacción transfusional. Para
evitarlo, se controla la sangre del donante antes de realizarse la transfusión. Para ello,
se llevan a cabo pruebas de compatibilidad. Lo primero de todo, es determinar el sistema
AB0 y Rh en donante y receptor. Además:
 Realizar Prueba de Coombs para identificar anticuerpos irregulares.

 Realizar pruebas cruzadas:
o Mayor: enfrenta a los hematíes del donante con el suero del receptor. Se
determina así la reacción entre los anticuerpos del receptor y los
hematíes del donante.
o Menor: enfrenta hematíes del receptor con el suero del donante. Se
determina así la reacción entre los anticuerpos del donante y los
hematíes del receptor.
La interpretación del resultado se realiza de forma que, si en cualquiera de las pruebas

se ha producido aglutinación o hemólisis, la sangre es incompatible. La sangre es
compatible si, y solo si todos los análisis son homogéneos.
43
44
Tema 9
9. ANÁLISIS INMUNOLÓGICO
9.1. CONCEPTOS GENERALES
El análisis inmunológico es la parte práctica de la inmunología cuyo principal uso es
hacer diagnósticos. En él se estudian procedimientos analíticos en los que se emplean
moléculas de reconocimiento y/o analitos de origen inmunológico (inmunoensayos).
Se utilizan técnicas funcionales con células que participan en la respuesta inmunitaria.
9.1.1. APLICACIONES
El análisis inmunológico se usa para:
 Diagnóstico médico.
 Medicina forense.
 Antropología.
 Agricultura (infecciones por virus en plantas, por ejemplo).
 Industria alimentaria (determinación del gluten, por ejemplo).
 Otras, como determinaciones medioambientales, investigación, etc.
9.1.2. PROCEDIMIENTO GENERAL

Un análisis inmunológico consta de:
1. Demostración de unión del analito a una molécula de reconocimiento

(habitualmente un anticuerpo).
2. Medición de las respuestas celulares frente a un estímulo.
3. Alteración de parámetros normales.
9.1.3. DEFINICIONES
Se define:
 Muestra: parte representativa del material a analizar.

 Analito: especie química a determinar en el análisis:
o Analito natural fisiológico: como, por ejemplo, la TSH.
o Analito natural patológico: como, por ejemplo, marcadores tumorales y
autoanticuerpos.
o Analitos exógenos: drogas y fármacos.
o Agentes infecciosos:
 Antígenos: indican infección activa.
 Anticuerpos: indican que hubo infección, pero no sabemos en qué
momento o si todavía está presente.
 Ligando: molécula que se une específicamente a una molécula de
reconocimiento. Un ligando puede ser una molécula que se una al receptor o
un antígeno que se une al anticuerpo. Suele ser también el analito. Tiene bajo
peso molecular.
 Inmunógeno: sustancia capaz de provocar una respuesta inmunológica
adaptativa cuando se inocula. Diferenciamos antígenos y heptenos-carrier:
45
 Antígeno: sustancia que se une específicamente a un anticuerpo o a un TCR.

Pueden contener uno o varios epítopos. Se pueden clasificar de diferente
manera:
o Naturaleza química: proteínas, péptidos, glucano, glicoproteínas,
moléculas sintéticas y lipoproteínas.
 Procedencia y/o mecanismo de reconocimiento:
 Antígenos microbianos: virales, fúngicos, bacterianos,
parasitarios.
 Alérgenos.
 Aloantígenos: grupos sanguíneos, variantes del sistema
HLA10.
 Autoantígenos.
 Antígenos tumorales.
 Superantígenos: son generalmente toxinas de
Staphylococus y Streptococcus que forman un puente
entre HLA-2 y el TCR de muchos linfocitos.
o Forma de producción:
 Naturales.
 Recombinantes.
 Sintéticos.
 Haptenos: son sustancias de bajo peso molecular que pueden ser antigénicas
cuando se conjugan con un carrier. Por ejemplo: hormonas peptídicas,
esteroides, fármacos, etc. pueden actuar como haptenos y se pueden obtener
anticuerpos frente a ellos. Los lípidos también pueden actuar como haptenos.
Algunos haptenos son muy empleados en inmunoensayos para marcar
anticuerpos con carácter general (por ejemplo, digoxigenina, fluoresceína,
dinitrofenol). Pueden generar respuestas alérgicas y autoinmunes (conjugación
a proteínas propias, reconociéndose estas como antígenos y siendo atacadas).
9.1.4. TIPOS DE MUESTRAS HUMANAS

Se pueden sacar muestras de fluidos biológicos y de tejidos:
 Fluidos biológicos:
o Plasma y suero.
o LCR.
o Líquidos sinovial, pleural, pericárdico, peritoneal, vaginal…
o Saliva.
o Orina.
o Heces.
 Muestras tisulares:
o Aspirado de médula ósea o de otros órganos.
o Sangre periférica.
o Material obtenido por punciones, frotis y biopsias.
9.1.5. TIPOS DE ANÁLISIS

Se diferencian análisis “in vitro” e “in vivo”:
10 Antígenos leucocitarios humanos. Forman el MCH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad).
46
 Pruebas analíticas “in vitro”:

o Métodos que no emplean moléculas trazadoras:
 Antígenos y anticuerpos en forma soluble:
 Reacciones de inmunoprecipitación.
 Reacción de fijación del complemento.
 Detección mediante dispersión de la luz: nefelometría o
espectrometría.
 Antígenos o anticuerpos en fase sólida (particulados):
 Reacciones de aglutinación/hemaglutinación.
 Pruebas de neutralización y microtoxicidad.
o Métodos que emplean moléculas trazadoras:
 RIA/ELISA/ELISPOT.
 Dot-blot/inmunotransferencia.
 Antígenos o anticuerpos en fase sólida (tejidos):
 Inmunofluorescencia/IHQ/Citrometría de flujo.
 Pruebas analíticas “in vivo”: cualquier prueba de la alergia: introducción del
antígeno con una lanceta por vía intradérmica para ver “in vivo” si ocurre reacción
y formación de eritema.
47
48
Tema 10
10. MOLÉCULAS DE RECONOCIMIENTO
Se pueden usar en análisis inmunológico:
 Moléculas inmunológicas (anticuerpos):

o Policlonales.
o Monoclonales.
o Nanobodies o nanoanticuerpos.
 Moléculas no inmunológicas:
o Sistema avidina-biotina.
o Proteínas A/G/L.
o Lectinas: proteínas que reconocen azúcares.
o Ácidos nucleicos, denominados aptámeros.
10.1. MOLÉCULAS DE RECONOCIMIENTO INMUNOLÓGICAS

10.1.1. ANTICUERPOS
Son moléculas de reconocimiento que se emplean
típicamente en los inmunoensayos. Según las
características del inmunoensayo, los anticuerpos
pueden actúar como antígenos y, por lo tanto, deben ser
considerados como analitos o ligandos. Suelen actuar
como moléculas de reconocimiento.
Están formados por dos cadenas pesadas y dos cadenas

ligeras. Hay cinco tipos de Ig en mamíferos que se
nombran por letras griegas: α, δ, ε, γ y μ. El tipo de
cadena pesada presente define la clase del anticuerpo:
 IgM: cadena pesada µ. 8,1% de los anticuerpos. Se ocupan de la inmunidad

temprana.
 IgA: cadena pesada α. Presente en mucosas. Dos tipos:
o IgA1: 16.2%.
o IgA2: 3,2%.
 IgG: cadena pesada ᵞ. Actúan frente a antígenos proteicos y glucídicos

(polisacáridos). Cuatro subtipos:
o IgG1 e IgG4: 48% y 2,1% respectivamente. Actúan contra antígenos
proteicos.
o IgG2 e IgG3: 16,2% y 5,4% respectivamente. Actúan contra antígenos
glucídicos.
 IgE: cadena pesada ε. 0,0016%. Actúan contra alérgenos.
 IgD: 0,16%. Componente de superficie de linfocitos B.
49
La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos en los

diferentes linfocitos B, pero es idéntica para todos los anticuerpos producidos por el
mismo linfocito B o por su línea clonal.
Hay dos tipos de cadena ligera, llamados lambda (λ) y

kappa (κ).3 Una cadena ligera contiene dos dominios
sucesivos: un dominio constante y un dominio variable.
Se distinguen además dos fragmentos, el Fab

(Fragmento de unión al antígeno) y el Fc (Fragmento
cristalizable). El Fab lo forman los dos extremos de la
inmunoglobulina mientras que el Fc lo forma el fragmento
de inmunoglobulina que es reconocido por macrófagos.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.
10.1.1.1. ANTICUERPOS POLICLONALES

Los anticuerpos policlonales se obtienen de multitud de especies animales (conejo,
cabra, oveja, burro y rata/ratón  Laboratorio) por inoculación del antígeno, extracción
de sangre, obtención de plasma y purificación de anticuerpos. Contienen anticuerpos
secretados por numerosos clones de células B plasmáticas (es una mezcla de distintos
anticuerpos). Se emplean habitualmente como anticuerpos secundarios marcados
en inmunoensayos.
10.1.1.2. ANTICUERPOS MONOCLONALES

Los anticuerpos policlonales se obtienen
principalmente por técnicas de ingeniería
genética. Tienen las siguientes
características:
 Todos los anticuerpos son idénticos.

 Todos tienen la misma secuencia en
las cadenas H y L.
 Todos reconocen el mismo epítopo.
En la metodología clásica, se producen por

fusión de linfocitos B inmunizados de
animales inmunizados con el antígeno de
interés con una línea de células B tumoral
deficiente en un enzima (por ejemplo:
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa)
que les impide crecer en un medio selectivo
(HA o HAT). Las células se fusionan con
polietilenglicol (PEG) y sólo pueden crecer los
híbridos, denominados hibridomas, que
secretarán la inmunoglobulina de interés.
50
En una tabla resumen vemos las principales diferencias entre anticuerpos monoclonales
y policlonales:
Anticuerpos monoclonales Anticuerpos policlonales

 Químicamente homogéneos.  Químicamente heterogéneos.
 Son inestables:  Más estables: si una población de
o Se inactivan con más anticuerpos se ve afectada, el resto
facilidad. sigue existiendo. Esto ocurre gracias
o Son sensibles a cambios en a que los anticuerpos policlonales son
pH. una mezcla de anticuerpos
o Pueden perder reactividad al secretados por múltiples clones de
ser marcados con enzimas o células B.
radioisótopos.
 Afinidad determinada.  Afinidad: promedio de todos los
 Se suelen emplear como anticuerpos anticuerpos.
primarios.
 Se pueden obtener quiméricos o
humanizados para su uso en terapia
humana (ej: Rituximab usado para
tratar leucemia). Ver imagen inferior.
 No útiles en reacciones de  Útiles para técnicas de
inmunoprecipitación11. inmunoprecipitación.
Tipos de anticuerpos monoclonales:
10.1.1.3. ANTICUERPOS POLICLONALES EN GALLINAS

En lugar de usar los animales antes vistos, podemos usar gallinas. Tienen unas
características especiales que nos interesan. Las IgG de las aves se les denomina IgY
(Yolk=yema). La transferencia de la IgY al huevo ocurre en los folículos ováricos. En las
membranas de los ovocitos de las gallinas existen receptores específicos que captan
activamente las IgY del suero. La concentración de IgY en la yema alcanza niveles
similares a los del suero. Por tanto, si inmunizamos gallinas con el antígeno que nos
interesa, podemos obtener “huevos inmunes”.
11 Para que ocurran reacciones de inmunoprecipitación deben los anticuerpos deben reconocer
diferentes epítopos para unirse formando redes que precipitan. Los anticuerpos monoclonales
solo reconocen un epítopo, forman monómeros que no precipitan.
51
Ventajas:
 Bienestar animal: los anticuerpos se obtienen de la yema del huevo, no hay

que sacarle sangre al animal.
 Como se trata de especies distintas (con respecto a los mamíferos) se pueden
obtener anticuerpos frente a antígenos de mamífero conservados
evolutivamente. Por ejemplo, es más difícil que un organismo mamífero genere
anticuerpos frente a histonas, ya que están muy conservados filogenéticamente.
Las aves al estar muy separadas de los mamíferos, sí que pueden generar estos
anticuerpos frente a histonas de mamíferos.
 Menos problemas de reacciones cruzadas: no activan el complemento de
mamíferos ni son reconocidas por células con receptor Fc.
 Admiten más marcaje con trazadores como la Peroxidasa, ya que están muy
glicosiladas. Al estar tan glicosiladas permiten añadir más peroxidasa por unidad
de anticuerpo.
 Combinados con otros de mamíferos permiten hacer doble marcaje.
Desventajas:
 Industrialmente tienen menos aplicaciones.

 No reaccionan con la porción Fc: si bien antes era una ventaja, puede ser que
nos interese este tipo de reacción.
10.1.1.4. NANOBODIES
Los Nanobodies se descubrieron por primera vez en camellos. Se vio que existían
anticuerpos normales, pero existían otros que sólo tenían cadenas pesadas. Estos,
además, eran completamente funcionales (podían reconocer el antígeno y unirse a él).
El 50% de los anticuerpos circulantes en estas especies carecen de cadena ligera. Están
formados por 2 cadenas pesadas de 45kDa.
Los Nanobodies tienen la cadena pesada plegada sobre sí misma, haciendo a las veces
de fracción variable (Fv).
Actualmente los Nanobodies son fragmentos de anticuerpos de dominio simple (VHH)

producidos por ingeniería genética. Como solamente se usa un dominio (VHH) tienen
un tamaño muy pequeño, una décima parte de una IgG normal (15kDa). Al tener un
tamaño tan pequeño, pueden unirse a epítopos presentes en estructuras pequeñas en
las que no cabe un anticuerpo. Además, atraviesan la barrera hematoencefálica.
Son más resistentes al calor y a cambios de pH que los anticuerpos normales. Por todo
esto tienen gran potencial de aplicación en terapia humana.
52
10.2. MOLÉCULAS DE RECONOCIMIENTO NO INMUNOLÓGICAS

10.2.1. AVIDINA Y ESTREPTAVIDINA
La avidina es una glicoproteína (66kDa) estable hasta los 70ºC producida por aves,
reptiles y anfibios. Se acumula en la clara del huevo. Es un ligando de altísima afinidad
para la biotina o vitamina B7. Puede ser tetramérica o dimérica. La glicosilación puede
generar problemas, ya que esos azúcares pueden ser reconocidos y ser atacados.
Existe una forma comercial no glicosilada denominada neutravidina.
Existe una proteína con la misma función, denominada estreptavidina, producida por
la bacteria Streptomyces avidinii. Sólo tiene un 30% de homología con la avidina.
También es tetramérica. No está glicosilada. Se comercializa recombinante.
10.2.2. PROTEÍNAS A/G

Están producidas por bacterias. Se unen a inmunoglobulinas. Los microorganismos las
usan para defenderse de ser atacadas por el sistema inmune (Ig).
La proteína A es una proteína de superficie (adhesina) de 56kDa presente en la pared

celular de Staphylococcus aureus. Se une con alta afinidad a las IgGs humanas, y con
baja afinidad a otros isotipos. Se puede unir también a inmunoglobulinas de otras
especies.
La proteína G, de 65kDa, está presente en la superficie de los estreptococos. Es más

selectiva que la proteína A y se une exclusivamente a las IgGs. Se puede unir también
a inmunoglobulinas G de otras especies.
Ambas proteínas reconocen a los anticuerpos por la porción Fc. No se unen a las
cadenas ligeras. Se emplean, fundamentalmente la proteína G, para purificar IgGs y
como moléculas de reconocimiento en inmunoensayos.
Está disponible una proteína quimérica A/G que tiene dominios de ambas proteínas y
es capaz de unirse a todas las inmunoglobulinas humanas.
Tabla de afinidades por distintos anticuerpos:
Anticuerpos Proteína A Proteína G

Human IgG1 ++ ++
Human IgG2 ++ ++
Human IgG3 - ++
Human IgG4 ++ ++
Human IgA + -
Human IgD + -
Human IgE + -
Human IgM + -
Mouse IgG1 + ++
Mouse IgG2a ++ ++
Mouse IgG2b ++ ++
Mouse IgG3 + ++
Mouse IgM +/- -
Chicken IgG - +/-
53
10.2.3. PROTEÍNA L
Recibe ese nombre porque se une a las cadenas ligeras de todas las IgG (κ). Fue
aislada de Peptostreptococcus magnus. No reconoce la porción Fc de los anticuerpos
(a diferencia de proteínas A y G, que se unen por la fracción Fc).
Son muy útiles para purificar anticuerpos monoclonales y policlonales por afinidad.
10.2.4. LECTINAS
Son proteínas con capacidad aglutinante que reconocen azúcares de manera
específica. Son muy representantes en el reino vegetal. Reconocen monosacáridos u
oligosacáridos. Una vez marcadas, se pueden emplear en inmunoensayos para localizar
antígenos (glucoproteínas) que contengan el glucano que reconoce la lectina.
La más usada es la Concavalina A (Con A) que se une directamente a los glucanos de

la peroxidasa. Otra, la Jacalina, se une a IgA. Tienen aplicaciones en cromatografía,
lectin-assays y cultivo de linfocitos.
10.2.5. APTÁMEROS
Fueron descubiertos en 1990. Son oligonucleótidos de cadena sencilla, de unas 70-100
bases, capaces de reconocer de forma específica y con alta afinidad a varios tipos de
moléculas diana mediante un plegamiento de su cadena.
Tienen como ligandos a proteínas, iones metálicos, colorantes, fármacos, aminoácidos,

cofactores, tejidos, etc.
Ventajas:
 Tiene alta estabilidad a la temperatura (se trata de material genético. Los

oligonucleótidos se desnaturalizan de manera reversible).
 Se pueden utilizar en condiciones no fisiológicas. Un anticuerpo, por ejemplo,
por encima de 60ºC no se puede usar.
 Sustituyen a anticuerpos que son de difícil obtención, como toxinas o
autoantígenos: para obtener un anticuerpo de una toxina muy potente habría que
inoculársela a algún animal, que moriría al instante.
Utilidad:
 Se pueden usar como biosensores.

 ELONA.
 Citrometría de flujo.
 Terapia humana: Pegaptanib12.
No son inmunogénicos.
Obtención:
Se seleccionan por afinidad con la diana a partir de secuencias amplificadas (1013-1016

secuencias). Pasos:
12 Fijarse en la raíz -APTA- que presentan todos los fármacos que son aptómeros.
54
1. Incubación de secuencias amplificadas con una estructura que contenga nuestro

epítopo.
2. Retirada de los oligonucleótidos que no se unen.
3. Separación del RNA unido de la diana.
4. PCR para amplificar el RNA que nos interesa.
Esto se repite varias veces hasta obtener aquellos oligonucleótidos con

más afinidad.
Se puede hacer en vez de con una estructura con epítopos, con células que
contengan el receptor.
Las estructuras formadas tienen doble cadena en realidad, porque la

cadena simple tiene regiones de bases complementarias que se unen,
dejando al descubierto zonas de reconocimiento.
55
56
Tema 11
11. VALIDACIÓN DE LOS INMUNOENSAYOS
11.1. AFINIDAD Y AVIDEZ
La afinidad es la fuerza de unión entre un anticuerpo y un único epítopo. La fuerza de
unión entre un anticuerpo multivalente (policlonal) a un antígeno multivalente se
denomina avidez. Por lo tanto, la afinidad se aplica a anticuerpos monoclonales,
mientras que la avidez se aplica a anticuerpos policlonales.
La unión antígeno-anticuerpo es reversible. La interacción está definida por la

constante de asociación (Ka) o su inversa (Kd):
𝐴𝑐 + 𝐴𝑔 ↔ 𝐴𝑐𝐴𝑔
[𝐴𝑐𝐴𝑔]
𝐾𝑎 =
[𝐴𝑐][𝐴𝑔]
11.2. OTROS CONCEPTOS

Especificidad (índice de detectabilidad de negativos): es la capacidad de un
inmunoensayo para detectar un resultado negativo entre muestras verdaderamente
negativas. Se define como:
𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜𝑠
𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 = [ ] 𝑥100
𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 + 𝑓𝑎𝑙𝑠𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
Sensibilidad (índice de detectabilidad de positivos): es la capacidad de un

inmunoensayo para detectar un resultado positivo entre muestras verdaderamente
positivas. Se define como:
𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜𝑠
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = [ ] 𝑥100
𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 + 𝑓𝑎𝑙𝑠𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
También se entiende por sensibilidad la capacidad de un inmunoensayo para responder

a pequeños cambios en la concentración de los componentes que intervienen en la
reacción.
Detectabilidad (límite de detección del

ensayo): capacidad del ensayo para
detectar pequeñas concentraciones del
analito.
Robustez: mide la capacidad del

método para no ser afectado por
pequeños cambios deliberados en sus
parámetros y provee una indicación de
su contabilidad durante su uso normal.
57
En la gráfica de la página anterior se muestran diferentes inmunoensayos. El 2 tiene

mayor capacidad de detección (menos concentración necesaria). La sensibilidad, en
cambio, la da la pendiente (como 2 y 3 son paralelos, tendrán la misma sensibilidad,
entendida como capacidad de diferenciar pequeños cambios). 1 tendrá la sensibilidad y
la detectabilidad altas.
11.3. PRECISIÓN Y EXACTITUD

Se definen:
 Exactitud (accuracy): significa que el inmunoensayo está determinando la

concentración correcta del analito en la muestra.
 Precisión: mide la reproducibilidad del ensayo. Se determina el coeficiente de
variación (CV) interensayo o intraensayo:
[𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟]
𝐶𝑉 = ×100
𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎
El CV nos indica en qué medida se agrupan los valores alrededor de un punto.
La sensibilidad y especificidad son subconjuntos de exactitud y precisión. Un ensayo

que tiene la capacidad para producir resultados exactos y precisos y no produce falsos
positivos se considera específico. Un ensayo que tiene la capacidad para producir
resultados exactos y precisos y no produce falsos negativos se dice que es sensible.
Un ensayo puede ser preciso (reproducible) y no exacto (la cantidad no se corresponde

con la real).
11.4. CALIBRADORES Y CONTROLES

Los calibradores son soluciones con concentraciones conocidas de analito con los que
se puede realizar una recta de calibrado. Sirven para hacer una recta de calibrado.
Los controles son muestras que contienen concentraciones conocidas de analito que
se emplean para monitorizar la precisión y la exactitud del ensayo. Se emplean para
saber si ha salido bien el ensayo.
NSB (Non-specific binding): es el ruido de fondo o señal que se obtiene cuando la

concentración de analito es cero, o cuando se omite alguno de los componentes del
inmunoensayo.
Calibradores y controles son diferentes en cuanto a finalidad. Ambos son soluciones de

analito de concentración conocida. En la gráfica de la derecha observamos que, si los
58
puntos están en la media o en el intervalo entre ambas desviaciones estándar, el

inmunoensayo es correcto. Si no, habría que calibrar el aparato.
Veamos un ejemplo con una tabla:
Prevalencia 50% 10% 1%

Enfermos/Sanos 1000/1000 200/1800 20/1980
Vp (test) 900 180 18
Fp (test) 100 180 198
Vn (test) 900 1620 1782
Fn (test) 100 20 2
VP(+) (Vp/Vp+Fp) 90% 50% 8,3%
VP(-) (Vn/Vn+Fn) 90% 98,7% 99,8%
Observamos que a medida que baja la prevalencia el valor predictivo positivo (capacidad
de diferenciar entre verdadero y falso positivo) disminuye, mientras que el valor
predictivo negativo (capacidad de diferenciar entre verdadero y falso negativo) aumenta.
59
60
Tema 12
12. INMUNOENSAYOS SIN MOLÉCULAS TRAZADORAS
Recordemos la clasificación de los inmunoensayos:
 Pruebas analíticas “in vitro”:

o Métodos que no emplean moléculas trazadoras:
 Reacciones de inmunoprecipitación.
 Reacción de fijación del complemento.
 Detección mediante dispersión de la luz: nefelometría o
espectrometría.
 Antígenos o anticuerpos en fase sólida (particulados):
 Reacciones de aglutinación/hemaglutinación.
 Pruebas de neutralización y microtoxicidad.
o Métodos que emplean moléculas trazadoras:
 RIA/ELISA/ELISPOT.
 Dot-blot/inmunotransferencia.
 Antígenos o anticuerpos en fase sólida (tejidos):
 Inmunofluorescencia/IHQ/Citrometría de flujo.
 Pruebas analíticas “in vivo”: cualquier prueba de la alergia: introducción del
antígeno con una lanceta por vía intradérmica para ver “in vivo” si ocurre reacción
y formación de eritema.
En este tema vamos a tratar los métodos que no emplean moléculas trazadoras:
reacciones de inmunoprecipitación, aglutinación y hemólisis.
En estos métodos se producen interacciones antígeno-anticuerpo. En estas

interacciones intervienen enlaces electrostáticos (los más fuertes), puentes de
hidrógeno (débiles pero numerosos), enlaces hidrofóbicos (intermedios), Van der
Waals (los más débiles). NO HAY ENLACES COVALENTES.
Las superficies de unión antígeno-anticuerpo se denominan epítopo (lugar del antígeno

que es reconocido por el anticuerpo) y paratopo (l lugar específico de unión del
anticuerpo al epítopo de su antígeno correspondiente). Se define idiotipo determinante
individual que diferencia una molécula de otra.
12.1. REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACIÓN

Fue de las primeras técnicas empleadas para observas la reacción Ag-Ab. Es la menos
sensible, por lo que se necesita mucha cantidad de analito. Cuando un antígeno soluble
interacciona con un anticuerpo específicos se generan interacciones que generan un
enrejado insoluble (precipitado visible). Los antígenos y los anticuerpos deben ser
multivalentes13.
13 Si son monovalentes se forman dímeros (no se pueden unir unos a otros).
61
En estas reacciones influyen muchos factores:
 Fenómeno de zona: Afecta muchísimo. El precipitado formado por los

complejos antígeno-anticuerpo sólo es visible cuando las concentraciones de
antígeno y anticuerpo son equivalentes.
Si hay un exceso de anticuerpos (izquierda del gráfico) los epítopos de un

mismo antígeno. están unidos a muchos anticuerpos diferentes, normalmente,
que tendrán puntos de unión libres. Esto es soluble ya que no se forma el
enrejado que precipita. En cambio, si hay exceso de antígeno (derecha del
gráfico), los antígenos tendrán epítopos libres. Esto es soluble también.
 Temperatura: la velocidad de reacción se incrementa con la temperatura hasta

un punto en el que cae la velocidad. Temperaturas de 56ºC inactivan los
anticuerpos reversiblemente14 (IgG) o irreversiblemente15 (IgE). El complemento
también se inactiva a 56ºC (2h).
 PH: los complejos antígeno-anticuerpo se alteran a pH extremos (<6 y >8,5). Si
se sube o se baja demasiado el pH, el anticuerpo deja de funcionar y libera al
antígeno. Muchas veces esto es reversible (por eso son posibles algunas
técnicas de cromatografía)
 Carga de los inmunocomplejos.
 Afinidad y avidez: al aumentar la avidez, aumenta la velocidad de la reacción
Ag-Ab.
 Agitación mecánica.
Diferenciamos dos tipos de reacción de inmunoprecipitación:
 Reacciones en medio líquido (reacciones de floculación).

 Reacciones en medio semisólido (precipitación en geles o inmunodifusión).
Dentro de las reacciones en medio semisólido se diferencian:
 Difusión doble en agarosa (Ouchterlony): se pone una capa de agarosa en

un portaobjetos o en una placa de Petri y taladrar los agujeros según el esquema.
Se depositan los antígenos y el suero en los pocillos (generalmente el suero en
14 Que sean reversibles quiere decir que al calentarlos a 56ºC y enfriarlos, vuelven a funcionar.
15 Las IgE se destruyen al pasar de 56ºC.
62
el medio, con anticuerpos, y el antígeno en los pocillos exteriores). Se incuban a

37ºC durante una noche en cámara húmeda para que difundan, y se puede leer
el resultado.
Este análisis da información sobre la naturaleza del antígeno, concentración

relativa del antígeno respecto al anticuerpo y estimación del peso molecular
del antígeno con respecto al anticuerpo.
Reacción I: de identidad. Hay reacción con ambos antígenos, pues hay dos
líneas de precipitación y además las líneas confluyen. Esto indica que los
antígenos de los dos pocillos son el mismo. Los antígenos y los anticuerpos
difunden radialmente, al ser iguales, difunden igual y la zona de equivalencia de
Ab y Ag es la misma en ambos casos.
Reacción II: de no identidad. Son antígenos distintos (con velocidades de

difusión diferentes). El anticuerpo es mutuo (reacciona con ambos antígenos).
Reacción III: de identidad parcial. Hay una identidad parcial. En los geles de
agarosa, si hay mezcla de antígenos, lo más probable es que uno esté encima
del otro (que se solapen). Así hay dos antígenos: hacia el agujero en el gel de
agarosa en el que se forma el espolón es donde se encuentra el antígeno
diferente (en la imagen, A).
63
Se deben realizar una serie de aclaraciones en este método:
o Si hay una alta concentración de antígeno, el anticuerpo tendrá que

moverse menos para alcanzar la equivalencia (avanza menos). Imagen
de la izquierda.
o La forma de la línea de equivalencia indica el peso molecular de ambas
sustancias, si es una línea recta, ambas tienen el mismo peso molecular.
De ser una línea curva, la parte cóncava apunta hacia la de mayor peso
molecular (KLH). Imagen de la derecha.
 Inmunodifusión radial (Mancini): es igual que la Ouchterlony, pero el suero se

incorpora directamente a la agarosa. Es importante hacerlo cuando la agarosa
esté a menos de 56ºC, ya que los anticuerpos rompen si se pasa esa
temperatura. Se forman halos proporcionales a la concentración del antígeno.
Es un método cuantitativo: se puede hacer una recta de calibrado poniendo el
diámetro en función de la concentración del antígeno. Por tanto, se puede
estimar la concentración midiendo el diámetro del halo.
Uno de los problemas que tienen los dos métodos anteriores es que los antígenos no
se separan bien, se superponen. Para mejorar eso se utilizaron los siguientes métodos:
 Inmunoelectroforesis: se fundamenta en la separación de los antígenos en un

gel de agarosa y posterior revelado de los antígenos mediante anticuerpos
específicos. El método consiste en situar agarosa en un portaobjetos y hacer un
agujero central en ella. Se separan los antígenos mediante corriente eléctrica y
se hace una ranura a lo largo del gel. En esa ranura se añaden los anticuerpos
y se dejan difundir. El método se realiza a pH alcalino para que la mayoría de los
antígenos se encuentren cargados negativamente y migren al polo positivo16. A
16 Polo positivo: ánodo. Polo negativo: cátodo.
64
las inmunoglobulinas17 no les ocurre esto, ya que poseen muchos aminoácidos

básicos (lisinas) y compensan el efecto del tampón, quedándose con carga
positiva, y migran al polo negativo.
Esta técnica se usa principalmente para estudiar las gammapatías clonales: un

clon de célula plasmática produce concentraciones elevadas de una clase de Ig.
Esta situación se produce en la macroglobulinemia de Waldenström.
A veces se puede hacer una Inmunoelectroforesis doble, haciendo dos agujeros
para antígenos. En uno colocamos el suero problema y en el otro un suero de
paciente normal. Podemos observar ambos dibujos generados y deducir si el
paciente del suero problema tiene o no la enfermedad.
 Contrainmunoelectroforesis: aprovecha la propiedad de que la mayoría de los
antígenos migran hacia el polo positivo, mientras que los anticuerpos en el
sentido contrario. Se puede acelerar la reacción de inmunodifusión:
El método se puede hacer cuantitativo, incorporando anticuerpos a la agarosa.

Se realiza entonces electroinmunodifusión cuantitativa.
Se modificó la técnica de Mancini.

Se usa un gel de agarosa que
contiene anticuerpos y se
introduce el antígeno en los
pocillos a diferentes
concentraciones, obteniéndose
una altura de difusión al hacer
pasar la corriente eléctrica.
Utilizando esta altura, podemos
hacer una recta de calibrado. Esto
sería equivalente a lo que
hacíamos con el diámetro en el
Mancini, pero es más sensible.
17 Excepto IgA de ratón.
65
12.2. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Cuando se añade suero que contiene anticuerpos específicos a una suspensión de
partículas (el antígeno está en fase sólida, no disuelto) se producen cúmulos de
partículas (las partículas se unen unas a otras). Consumen menos antígeno que las
reacciones de precipitación y les afecta menos el fenómeno de zona. Son pruebas más
sensibles.
Distinguimos tres tipos de reacciones de aglutinación:
 (Hemo)aglutinación directa: el antígeno forma parte de la partícula que se

aglutina, por ejemplo, un antígeno de superficie de una bacteria, antígeno de
hematíe, etc.
 (Hemo)aglutinación indirecta: el antígeno se pega artificialmente a la partícula
que se aglutina.
 Inhibición de la (hemo)aglutinación: se bloquea la actividad aglutinante de un
antígeno o un anticuerpo.
Se pueden usar diferentes tipos de partículas:
 Bacterias.
 Látex.
 Hematíes (hemoaglutinación).
12.2.1. (HEMO)AGLUTINACIÓN DIRECTA

Permite determinar antígenos en suero. Se coloca una suspensión de partículas o
hematíes sobre un portaobjetos, se le añade un anticuerpo específico (anti-antígeno a
determinar) y ocurre la aglutinación. Así se determina el grupo sanguíneo (usando suero
anti-A, anti-B o ambos) y los serotipos bacterianos.
La aglutinación directa con Látex se utiliza mucho como diagnóstico ya que se trata de
métodos homogéneos (no se separan los componentes de la reacción) y son test muy
rápidos. Además, esta prueba no solo nos permite conocer un resultado positivo o no,
sino que también podemos calcular de forma estimada si hay muchos o pocos
anticuerpos obteniendo el título tras realizar disoluciones seriadas. Para realizarlas, se
debe:
1. Añadir una suspensión de partículas (hematíes 2% sensibilizados con el

antígeno).
2. Echar anticuerpo y resuspender bien las partículas, en este caso hematíes, en
cada pocillo y dejar la placa en posición horizontal 2 horas.
3. Leer el título:
1
𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 =
[𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎]
4. Los eritrocitos aglutinados quedan retenidos en las paredes del pocillo de la

placa mientras que los no aglutinados se concentran formando un botón en el
fondo del pocillo. Para poder ver la reacción de aglutinación de forma correcta
se deben usar pocillos con fondo en curvatura o en punta, no planos, ya que no
permiten diferenciar correctamente el botón de patrículas no aglutinadas.
66
12.2.2. (HEMO)AGLUTINACIÓN INDIRECTA

Es exactamente igual que la anterior, pero se le añade un proceso previo de
sensibilización de una partícula sin antígenos con el antígeno que queramos.
12.2.3. INHIBICIÓN DE LA (HEMO)AGLUTINACIÓN

Es una técnica en la que primero se hacen reaccionar un anticuerpo conocido con el
suero problema (que no sabemos si posee o no antígenos(X)). De poseer antígenos(X),
estos reaccionarán con el anticuerpo (A=Artificial). Si el suero con los anticuerpos (A)
ocupados se hace reaccionar con otra partícula que posea el antígeno (X) no veremos
aglutinación, por el mero hecho de que los anticuerpos (A) ya están unidos a un antígeno
(X). En el caso de que en el suero problema no existieran antígenos, los anticuerpos (A)
estarían libres y podrían reaccionar con la partícula que posee el antígeno (X).
Estas pruebas se basan en la capacidad de algunos patógenos (p.ej. el virus de la

influenza) para causar la aglutinación de los eritrocitos. La inhibición de la aglutinación
de los eritrocitos es un método sensible y específico para la identificación de pequeñas
cantidades de antígeno soluble en la sangre o en otros líquidos de los tejidos. Esta
técnica es utilizada para identificar virus con capacidad hemoaglutinante presentes en
una muestra dada (virus influenza), que, al unirse a los anticuerpos específicos, pierden
esta propiedad. Esto se demuestra haciendo reaccionar la mezcla de antígeno con
anticuerpo (suero del paciente) con glóbulos rojos, que no se unen y sedimentan
formando un botón.
Esta prueba se aplica al Test de embarazo:
En el test de embarazo hay un hapteno conjugado (látex) con Gonadotrofina coriónica

humana y además hay anticuerpos anti-GCh. El procedimiento es:
1. Orina+Anti-GCh. Incubación.
2. Adición del carrier con GCh.
3. Observar posibles resultados:
La orina de una mujer embarazada tiene los antígenos (Gonadotrofina coriónica

humana) por lo que se une a los anticuerpos anti-GCh y no se produce la reacción de
aglutinación entre el anticuerpo y las partículas de látex rodeadas de la GCh. En una
mujer no embarazada no hay antígeno en orina, por lo que los anticuerpos se unirán a
la partícula de látex formando aglutinación.
67
A los tres tipos de reacciones de aglutinación dadas les afecta el fenómeno de prozona
(con exceso de anticuerpos se solubiliza, no habiendo precipitado. Explicación en la
página 58) y el potencial Z: fuerza de repulsión causada por las cargas negativas (ácido
siálico) que envuelven a los hematíes y que se repelen entre sí, dificultando la
hemaglutinación.
Si con el eritrocito ponemos un anticuerpo antieritrocito y éste es una IgG, no aglutina

debido al potencial Z, porque el brazo de la IgG es más corto que la distancia entre
eritrocitos. Las IgG, por tanto, no aglutinan eritrocitos, pero los IgM sí (tienen el brazo
más largo). Una IgG no puede enganchar 2 eritrocitos a la vez, y por tanto no aglutina.
El potencial Z puede evitarse empleando el test de Coombs, que trataremos a

continuación.
TEST DE COOMBS
En este test se utiliza un doble anticuerpo. Diferenciamos entre test de Coombs directo
e indirecto:
 Test de Coombs directo: detecta anticuerpos ya unidos a la superficie. Se

utiliza para ver si el niño tiene anticuerpos anti-RH que la madre le pasó por la
placenta.
 Test de Coombs indirecto: detecta anticuerpos en sangre que se pueden
unirse a glóbulos rojos “in vitro” que tienen antígenos específicos. Se usa para
ver si la madre tiene anticuerpos anti-RH circulantes.
68
12.3. REACCIONES DE HEMÓLISIS

Estas reacciones se basan en que al reaccionar un antígeno de la membrana del glóbulo
rojo con un anticuerpo contra él y el complemento se produce la hemólisis del glóbulo
rojo.
Hay diferentes tipos, la Reacción de fijación del complemento, la Reacción de

inhibición de la hemólisis y el CFP (tratada en prácticas).
12.3.1. REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO

Se mide consumo de complemento si tuvo lugar la reacción antígeno-anticuerpo. Se
acoplan dos reacciones en el mismo tubo:
 Antígeno + suero (anticuerpos) + complemento (limitado) = Consumo de

Complemento (C’) (1).
 GR + anti-GR + C’ (reacción anterior, es decir, añadimos el tubo anterior) (2).
Si vemos que se consume el complemento vemos que la reacción antígeno-anticuerpo

tuvo lugar. Necesitamos algo que nos permita ver si se gastó el complemento. Tenemos
anticuerpos que se pegan a un antígeno y añadimos el complemento, que se va
gastando. En un tubo aparte ponemos glóbulos rojos y anticuerpo anti-GR. Si añadimos
complemento, se produce hemólisis, pero si lo que añadimos es la reacción del tubo
69
anterior, si se gasta el complemento no ocurre hemólisis (persona enferma, tiene

anticuerpos). Si no se gasta, no hay hemólisis. Este sistema consta del Sistema de
prueba (1) y sistema indicador (2).
Por lo tanto, si no hay hemólisis (A) el paciente tiene anticuerpos (está enfermo) y, si
hay hemólisis (B), el paciente no tiene anticuerpos contra ese antígeno.
Esta reacción tenía grandes problemas porque el paciente tiene complemento en el

suero y habrá que poner C limitado (sólo para esta reacción, si lo ponemos en exceso
habrá hemólisis siempre). Hay que ajustar también la cantidad de anticuerpo, probar la
cantidad de complemento que habría que poner y elegir un antígeno que no sea anti-C
(que no reaccione con el complemento).
Consideraciones:
a) Ajustar el título de los anticuerpos anti-GR y del complemento.

b) Elegir un antígeno soluble específico y que no consuma el complemento. Se
debe titular la concentración óptima del antígeno en presencia de los reactivos.
c) Volver a titular el complemento en presencia del antígeno (poder
anticomplementario).
d) El suero también puede consumir complemento (poder anticomplementario del
suero). Inactivar los sueros de los pacientes a probar (contienen complemento).
Realización de la prueba:
 Tubos con diluciones de suero problema (con antígeno). Distintas disoluciones

para poder ver el título.
 Tubo control con suero problema (sin antígeno).
 Tubo control con suero positivo (con antígeno): Inhibe la hemólisis.
 Tubo control con suero negativo (con antígeno): Siempre da hemólisis.
 Tubo control con suero positivo (o del paciente) y antígeno “irrelevante” (mismo
proceso de obtención que el antígeno específico). Esto sólo se hace cuando se
diseña la técnica.
70
Interpretación de los resultados:
 Incubar componentes a baño maría (37ºC) durante 10-30 minutos.

 Comprobar que no hay lisis en el tubo con el suero control positivo.
 Determinar el título de los sueros problema (1: dilución máxima que produce
inhibición de la hemólisis).
Propiedades:
 Más sensible que hemaglutinación y técnicas de precipitación.

 Laboriosa y difícil ajustar los componentes.
12.3.2. REACCIÓN DE INHIBICIÓN DE LA HEMÓLISIS

La reacción típica tiene que ver con las hemolisinas presentes en muchas bacterias. Si
hay anticuerpos que bloqueen esta toxina (hemolisina), no hay hemólisis.
La técnica se basa en:
 Hemolisinas + suero con anticuerpos anti-hemolisinas + GR = No lisis.

 Hemolisinas + suero negativo + GR= Lisis.
Algunas bacterias producen hemolisinas que inducen la formación de anticuerpos. Los

anticuerpos presentes en el suero del paciente neutralizan las hemolisinas, pero el
suero normal (sujeto no enfermo) no posee esa propiedad.
Se calcula el título del suero probando varias diluciones seriadas del mismo. También
se puede poner una cantidad fija de suero y cantidades crecientes de hemolisina.
12.3.3. TÉCNICA DE CÉLULAS FORMADORAS DE PLACAS HEMOLÍTICAS (CFP)

Los linfocitos B activados van a estar emitiendo Ig siguiendo un gradiente de
concentración. Con ayuda del complemento, se van lisando los glóbulos rojos alrededor
de la célula esplénica. La circunferencia que se ve es una placa hemolítica (no son
calvas puras; hay otras células a las que no les afecta el anticuerpo).
Pueden usarse métodos directos o indirectos. Para ello hay que tener en cuenta el tipo
de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas de tipo M se detectan mediante un método
directo ya que son pentaméricas (se agrupan de cinco en cinco). Fijan fácilmente el
complemento, abriéndose poros en la membrana de los glóbulos rojos. Las
71
inmunoglobulinas de tipo G se detectan mediante un método indirecto ya que son

diméricas (se agrupan de dos en dos), por lo que no hay un complejo antígeno-
anticuerpo muy voluminoso, requiriéndose el uso de anti-IgG.
No tenemos forma de eliminar las placas formadas por el método directo. Hay que
preparar dos cámaras de Cunninghan:
A. Con anti-IgG: detectamos placas totales.

B. Sin anti-IgG: detectamos placas directas.
De tal manera que las placas indirectas serían la diferencia entre las placas totales y las
directas.
12.4. DETECCIÓN DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO

MEDIANTE TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Cuando un rayo de luz colimada18 atraviesa una suspensión de partículas, una parte se
absorbe, otra atraviesa la muestra (luz transmitida) y otra se dispersa en todas las
direcciones. Cuando se produce una reacción antígeno-anticuerpo en medio líquido los
inmunocomplejos en suspensión producen varios efectos sobre la luz: disminuye la
transmitancia y se produce dispersión de la luz. Si no hay reacción antígeno-
anticuerpo, la luz transmitida será diferente que si se forma un inmunocomplejo. El
inmunocomplejo, además, absorbe luz, por lo que la transmitancia será menor (y la
absorbancia mayor, ya que es la inversa de la transmitancia).
En inmunoturbidimetría se mide la absorbancia de la muestra:
𝐴 = −log10 𝑇
18Un colimador es un sistema que a partir de un haz (de luz, de electrones, etc.) divergente
obtiene un "haz" paralelo
72
En inmunonefelometría se mide la luz dispersada en un ángulo entre 30º y 90º

respecto a la dirección del rayo incidente.
Se suelen usar para hacer determinaciones cinéticas o de punto final de la reacción.

Es sensible, pero no tanto como ELISA. A esta prueba le condicionan varios factores:
 Cuanto menor sea λ (longitud de onda) mayor es la intensidad de la luz

dispersada.
 Es preferible el uso de luz fluorescente o láser.
 Se puede añadir PEG (polietilenglicol) para aumentar la velocidad de formación
y estabilidad de los inmunocomplejos.
 Con exceso de tiempo, los inmunocomplejos pueden sedimentar, afectando al
resultado.
Muchas de las proteínas que aparecen recogidas en las analíticas se detectan por estos
métodos. Ejemplos:
 Albúmina.
 CRP (proteína C reactiva).
 Factor reumatoide.
 Inmunoglobulinas séricas (IgG, IgA, IgM).
 Transferrina.
 Ceruloplasmina.
73
74
Tema 13
13. INMUNOENSAYOS CON MOLÉCULAS TRAZADORAS
La molécula trazadora permite conocer si se ha producido o no la reacción.
Dependiendo del ensayo, se pueden obtener resultados cualitativos (+/-),
semicuantitativos (título del suero) o cuantitativos (unidades de masa).
Se usan diferentes moléculas como trazadores:
 Radiactivas.
 Emisoras de luz (fluorescentes, quimioluminiscentes).
 Enzimas (ensayos cromatogénicos, fluorescentes, quimioluminiscentes). Los
enzimas se combinan con emisoras de luz o con moléculas que cambien de color
para que se genere una reacción que podamos detectar.
 Ácidos nucleicos: para posterior PCR.
 Coloides y microesferas coloreadas: látex.
Es importante tener claro si lo que queremos determinar está en forma soluble, por
ejemplo, un antígeno circulante, o en forma sólida, por ejemplo, en un tejido:
A. Técnicas que detectan antígenos o anticuerpos en forma soluble:

a. Inmunocromatografía.
b. RIAs (RadioInmunoEnsayos).
c. EIAs (ELISA/CELISA/ELISASPOT/INMUNODOT/ELONA).
d. Inmunotransferencia (Westernblot).
e. Microarrays.
B. Técnicas que detectan antígenos o anticuerpos presentes en tejidos o
células:
a. Inmunofluorescencia.
b. Inmunohistoquímica: requiere un microscopio óptico o electrónico que
nos permita ver el antígeno/anticuerpo en el tejido.
13.1. INMUNOENSAYOS QUE EMPLEAN MOLÉCULAS TRAZADORAS

COLOREADAS. INMUNOCROMATOGRAFÍA (LDS19)
Es un inmunoensayo en el cual un antígeno o un anticuerpo (cuya presencia queremos
detectar) reconocen (o son reconocidos por) un ligando o una molécula de
reconocimiento (MR) marcados con oro coloidal20 (también partículas coloreadas de
látex) migran por capilaridad sobre un papel de nitrocelulosa hasta una ventana
(positiva) en la cual otro ligando específico atrapa dicho antígeno o anticuerpo. El
excedente de reactivo marcado con oro coloidal migra hacia una ventana control donde
es capturado por otro ligando, indicando que la prueba ha finalizado.
Las posibilidades del test son:
19 Sistema de difusión lateral.

20 Partículas de oro suspendidas en una solución.
75
 Ventana test (+) y ventana control (+): analito presente.

 Ventana test (-) y ventana control (+): analito no presente.
 Ventana test (+) y ventana control (-): análisis no válido o todavía sin acabar.
Veamos un esquema:
A: papel de filtro donde

depositamos la muestra. Hay veces
en las que se dispone de un pocillo
donde los ingredientes están
liofilizados dentro y al añadir líquido
y tapar se absorbe por capilaridad.
En estos casos no existe zona B, ya
que el conjugado está en el pocillo.
B: otro dispositivo (fibra de vidrio) donde se desposita el conjugado. El conjugado son

antígenos, anticuerpos, otros ligandos o MRs (proteína A, avidina, Lectinas, etc),
marcadas con oro coloidal o látex coloreado.
C: B está montado sobre un papel de nitrocelulosa. C es la línea test. Otro ligando

específico (anticuerpos u otra MRs, como proteína A, avidina, antígeno, etc.) atrapa a la
molécula que queremos reconocer (unida ya a la molécula de reconocimiento
coloreada).
D: Nos indica que ya ha pasado el tiempo suficiente. Tiene que dar siempre positivo.
Tiene MRs que atrapan el exceso de reactivo de la ventana B (anti-Conjugado). El
segundo papel de filtro absorbe por capilaridad el exceso.
Son ensayos muy útiles porque son muy rápidos (un solo paso, 10-20min) para la
detección de antígenos o anticuerpos. Existen adaptaciones de esta metodología para
un gran número de enfermedades infecciosas (ej. VIH) y también para detectar
antígenos en alimentos (PSA, Troponina I).
13.1.1. EJEMPLOS DE INMUNOCROMATOGRAFÍA
13.1.1.1. DETERMINACIÓN DE LOS ANTICUERPOS CIRCULANTES FRENTE A UN

ANTÍGENO “X”.
En la zona A se coloca el suero
problema para determinar los
anticuerpos circulantes (Igs solubles).
En la zona B hay antígenos
específicos para la Ig que queremos
detectar, marcados con oro coloidal.
Al llegar a la zona C donde hay un
ligando para la Ig (ej. Proteína A, que
une la Ig por la cola) quedará retenido
el complejo MR(marcada)-Antígeno.
Aparece el color que indica el test
positivo. En D habrá una
76
inmunoglobulina (por ejemplo, la misma que queremos determinar), que fije al sobrante
del conjugado (B).
13.1.1.2. DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS EN UNA MUESTRA “X”

(GONADOTROFINA CORIÓNICA HUMANA EN ORINATEST DE EMBARAZO)
En la zona A colocamos el antígeno,
es decir, orina a determinar si posee
GCh. En B se colocan anticuerpos
anti-GCh marcados con oro coloidal.
En C hay un segundo anticuerpo
(monoclonal) anti-GCh (sin marcar).
En D se coloca proteína A o
anticuerpos anti-Ig obtenidos en
ratón. Al llegar a la zona B los
antígenos se unen a los anticuerpos.
En la zona C no podríamos poner
proteína A, porque ligarían a todos los
anticuerpos, estuvieran unidos o no al antígeno. Podemos poner un segundo anticuerpo
que reconoce al antígeno en otro sitio de unión diferente, generalmente este anticuerpo
(C) es monoclonal. Ahora quedan fijados los complejos antígeno-anticuerpo (marcado)
y aparece color en la línea test.
13.1.2. ENSAYOS DE INMUNOCROMATOGRAFÍA COMPETITIVOS

Sirve para detectar haptenos (moléculas pequeñas). Al tener bajo peso molecular no se
puede hacer la técnica 13.1.1.2 ya que no se pueden unir dos anticuerpos a la misma
molécula.
En la zona B (conjugado) hay bolas de látex coloreadas con anticuerpos frente al

hapteno.
En la zona C colocamos el mismo antígeno a detectar, de manera que, si la muestra

contiene el antígeno, el anti-hapteno se habrá gastado uniéndose a la muestra,
habiendo competición:
 Sin antibiótico: resultado positivo: al no haber hapteno, el anti-hapteno del

conjugado reacciona con el hapteno existente en la línea test.
 Con antibiótico: resultado negativo: se gasta el anti-hapteno y para cuando llega
a C la mezcla, todo el anti-
hapteno está gastado (no hay
reacción).
La señal obtenida es inversamente

proporcional a la concentración del
hapteno en la muestra. Se pueden
incluir juntos 2-3 anticuerpos marcados
para haptenos diferentes.
Se puede usar este método para

determinar la presencia de antibióticos
en orina o leche.
77
En la zona D colocamos proteína A que fija los anticuerpos sobrantes del conjugado,
obteniéndose siempre un resultado positivo.
13.2. INMUNOENSAYOS QUE EMPLEAN MOLÉCULAS TRAZADORAS

RADIACTIVAS
Son métodos de inmunodetección de antígenos, anticuerpos o analitos en general,
donde alguno de los componentes del ensayo está marcado con una molécula radiactiva
(RIAs=Radioinmunoensayos) o un enzima (EIAs=Enzimainmunoensayos).
Se pueden clasificar de diferentes maneras:
 Clasificación según soporte:

o Medio líquido.
o Soporte sólido.
 Clasificación según procedimiento de separación:
o Heterogéneos: se separan los componentes de reacción. Un ejemplo de
inmunoensayo heterogéneo es la Inmunocromatografía (los
componentes están separados).
 Directo.
 Indirecto.
 Captura (Sándwich).
 Competitivos.
o Homogéneos: sólo EIAs. No hay separación de componentes. Tiene
una fácil automatización. Un ejemplo de inmunoensayo homogéneo ya
visto es la hemaglutinación (todo está mezclado).
13.2.1. INMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS. RADIOINMUNOENSAYO

Inmunoensayo donde la molécula trazadora es un átomo radiactivo (beta o gamma). Se
miden los destellos radiológicos. Fue desarrollado en la década de 1950 por Rosalyn
Yalow y Solomon Aaron Berson para medir la concentración de insulina. Esto mejoró
mucho los diagnósticos.
Se empleó mucho para la determinación cuantitativa de analitos de bajo peso molecular

(ej. Hormonas). Suelen ser de tipo competitivo. Ahora mismo ha sido desplazado por
técnicas como la ELISA.
Según el medio empleado, pueden ser en medio líquido o en fase sólida. Inicialmente
se hacía en medio líquido. Al igual que los ELISA heterogéneos, pueden ser directos,
indirectos, Sándwich o competitivos.
Como ventajas destacamos que es un método muy sensible y preciso. Detecta analitos
de pequeño tamaño. Como desventajas hay que decir que es un método peligroso para
la salud, y conlleva problemas de eliminación de residuos. Se necesita equipo caro y
personal especializado.
Vamos a ver un ejemplo de un radioinmunoensayo (RIA) en fase líquida, donde

buscamos cuantificar la muestra:
78
Queremos cuantificar un Hapteno H (ej. hormona) en un fluido corporal. Disponemos de

un anticuerpo anti-H, hapteno radiactivo (H*) y hapteno no radiactivo (H) a
concentración inicial conocida (queremos realizar la curva patrón).
Procedemos a hacer una dilución seriada con concentraciones decrecientes de H.

Añadimos a todos los tubos una concentración conocida de H*. Con esto conseguimos
que la relación entre H y H* en cada tubo sea diferente, siendo la proporción de H con
respecto a la de H* mayor en el primer tubo (mayor concentración de H). Añadimos a
todos los tubos una cantidad fija del anticuerpo (se vio empíricamente que era mejor
usar una dilución que capture el 70% de los H*). Al echar el anticuerpo, no diferencia
del hapteno radiactivo al no radiactivo. Se va a unir preferentemente a uno de los dos
dependiendo de la proporción. Si separamos la radiactividad unida al anticuerpo frente
a la radiactividad libre (ya veremos cómo) podemos hacer la recta de calibrado. Una vez
hecha la curva patrón, se repite el proceso con el tubo que contiene una concentración
de H desconocida, extrapolamos a la curva patrón y ya conocemos la concentración.
Para hacer la curva de calibrado debemos conocer, como ya dijimos, las cuentas por
minuto (cpm) ligadas y las cuentas por minuto totales. A medida que disminuye H,
aumenta la unión con el radiactivo, aumentando el % de ligamientos (de ahí que, a la
menor cantidad de H, haya un valor de % de ligamiento tan alto).
79
Para conseguir una separación del hapteno radiactivo ligado y del hapteno radiactivo
libre podemos utilizar diferentes métodos:
 PEG (inmunocomplejos).
 Carbón activo + PEG: los anticuerpos se quedaban unidos a huecos grandes
del carbón activo pero los haptenos libres no podían unirse, de manera que
separando por centrifugación haptenos*-ligados (precipitan) y haptenos libres
(sobrenadante).
 Fase sólida + Proteína-A: una partícula de dextrano con proteína A fija las colas
de los anticuerpos y precipitan. Tenemos separados los anticuerpos de lo
demás, de manera que también tenemos separados los haptenos*-ligados de
los que no lo están.
 Anticuerpos fijos a fase sólida: si en vez de añadir los anticuerpos, los
tenemos en fase sólida, sólo habrá que lavar y tendremos el valor de Hapteno*-
ligado (el hapteno libre se elimina al lavar).
80
Tema 14
14. ENSAYOS POR INMUNOABSORCIÓN LIGADA A ENZIMAS
(ELISA)
Seguimos con el estudio de inmunoensayos heterogéneos. El ELISA es un ensayo
por inmunoabsorción ligado a enzimas (Enzime-Linked ImunoSorbent Assay). Es una
técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un
anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable. Los
enzimas habituales son:
 Peroxidasa del rábano (HRP=Horseradish peroxidase).

 Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
 Fosfatasa alcalina (AP=Alkaline phosphatase).
 β-D-galactosidasa.
 Las colinesterasas eran las que mejor funcionaban para esta prueba, pero tenían
patente, lo que dificultó su uso, quedando subordinadas al resto de enzimas (que
si se podían usar).
De esta lista, los más usados son HRP y AP porque tienen alta velocidad de reacción,
alta sensibilidad, son fáciles de detectar y, en el caso de HRP, se inactiva por protones21.
14.1. SOPORTES Y SUPERFICIES

En la ELISA se usan diferentes soportes y superficies:
Las microplacas son las más usadas:
 Tamaños: 96, 384, 1536 pocillos.

 Material: poliestireno o polivinilo.
 Superficies (absorción):
o Pasiva:
 Interacciones hidrofóbicas: poliestireno normal (media
capacidad).
 Interacciones hidrofóbicas e iónicas: poliestireno tratado (alta
capacidad).
o Covalente: poliestireno activado (N-oxisuccinimida, maleimida,
hidrazida…).
También se puede usar:
 Papel: polifluoruro de vinilo (PVDF) o NC.

 Tubos.
 Partículas magnéticas: así la separación antígeno-anticuerpo se hace
colocando un imán.
 Portaobjetos: Inmunohistoquímica (IHQ) y arrays.
21 A medida que la reacción avanza y se forman protones, el enzima se inactiva.
81
14.1.1. POLIESTIRENO
El poliestireno nativo tiene una adsorción media por interacciones hidrofóbicas. Si
irradiamos la superficie del poliestireno nativo se forman ácidos carboxílicos. Por tanto,
un poliestireno irradiado tiene una alta adsorción por interacciones hidrofóbicas e
iónicas.
Asimismo, existe el poliestireno aminado, que tiene una alta adsorción por
interacciones iónicas.
Este puede modificarse para obtener poliestireno activado. El poliestireno activado

tiene una capacidad de unión alta por enlaces covalentes. La superficie debe ser
activada previamente para fijar el poliestireno aminado (biomolécula aminada).
Por último, también hay un poliestireno hidrofílico que no tiene unión, pero se usa en
cultivos celulares:
14.2. VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL ELISA

Si colocamos la proteína suspendida en un gel (difusión), tendrá una orientación al azar,
pero seguirán siendo activas. Si la fijamos a la superficie, algunas de las proteínas
quedarán fijadas en una orientación y otras en otra, habiendo algunas inactivas. Si
hacemos uniones covalentes (PE activado) algunas proteínas quedarán inactivas.
82
Lo bueno es que si fijamos por afinidad (ELISA captura) obtenemos una fijación con la
orientación controlada de manera precisa. Se obtiene mucha más señal con menos
proteínas fijadas. Cuando ponemos en la superficie un anticuerpo que una a las
moléculas por un epitopo determinado, todas las proteínas quedan orientadas hacia el
mismo lado. También podríamos poner en la superficie de la proteína un anticuerpo que
detectase un antígeno fijado a la superficie.
En la adsorción y covalente, se ven dos proteínas cuyo epítopo (en amarillo) está
bloqueado.
En el caso de afinidad, hay espacios entre las proteínas que pueden ser ocupados por
moléculas de forma inespecífica, por interacciones hidrofóbicas y demás. Esto se
soluciona usando agentes bloqueantes.
14.3. AGENTES BLOQUEANTES

La misión de los agentes bloqueantes es inhibir la unión no especifica (NSB) sin
disminuir en lo posible la sensibilidad y especificidad del ensayo.
Actúan bloqueando lugares no ocupados de la placa ELISA. Reducen el impedimento

estérico espaciando las moléculas.
Destacamos:
 Detergentes no iónicos: Tween-20, Triton X-100.

 Proteínas: BSA (Bovine serum albumin), caseína/caseinato, gelatina de
pescado, leche descremada en polvo (NFDM), suero completo (bovino o bovino
fetal).
 Polímeros: Polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidina
(PVP), ácido poliacrílico (PAA), ácido maleico poliacrílico (PAMA).
VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL USO DE AGENTES BLOQUEANTES:
 Detergentes: No se usan solos. No producen un bloqueo permanente. Se

emplean en soluciones de lavado. Bloquean solo las interacciones hidrofóbicas.
Se usan 0,01-0,2%.
 BSA (Seroalbúmina de vaca): Muy usado. Relativamente barata. Compatible
con proteína-A y sistema avidina-biotina. Se usan en 1-3%. Reactividad cruzada
con anticuerpos BSA-hapteno (al inmunizar un conejo con antígenos unidos a
BSA, no se puede utilizar BSA como agente bloqueante). Carece de
heterogeneidad.
 Gelatina de pescado: Poco usado. Carece de reactividad con anticuerpos de
mamíferos y proteína-A (por ser de peces, no hay reactividad cruzada).
 NFDM (Leche descremada en polvo): es un excelente bloqueante. Tiene
diversidad molecular (la caseína es muy heterogénea) y características
83
anfipáticas. Es el bloqueante de elección en superficies covalentes. Otra

alternativa es el caseinato (digerido de caseína con NaOH). La leche contiene
fosfotirosina, que reacciona con anticuerpos anti-fosfotirosina y biotina, por lo
que no se recomienda para el uso en sistemas biotina-avidina.
 Suero: empleado en casos de bloqueo difícil. Recomendado con proteína-A y
anticuerpos anti-IgG. Se usa poco. Es relativamente caro.
 Polímeros: pueden recubrir superficies hidrofóbicas haciéndolas más
hidrofílicas. Útiles en ensayos de difusión lateral.
Los agentes bloqueantes subrayados son los más utilizados.
14.4. SUSTRATOS ENZIMÁTICOS

No siempre son los sustratos del enzima, sino los cromóforos (sustancias que cambian
de color por acción del enzima). Por ejemplo, el sustrato de la peroxidasa es el peróxido
de hidrógeno, pero para el ELISA se usa OPD que genera color.
Hay que destacar que para la realización del ELISA y posterior medida de los resultados
es necesario que el sustrato esté en forma soluble tras ser modificado por el enzima, de
tal manera que podamos medir la concentración y la presencia del analito.
Distinguimos diferentes tipos de “sustratos” enzimáticos:
 Cromogénicos: se genera un producto visible que puede permanecer soluble

(ELISA) o precipitar (otras técnicas, como dotplot) en el lugar donde ocurre la
reacción. Puede ser necesario un espectrofotómetro. Clasificamos los sustratos
según se usen con la fosfatasa alcalina o la peroxidasa:
o Fosfatasa alcalina:
 2,4-Nitrofenol
o Peroxidasa:
 O-fenilendiamina (OPD).
 Tetrametilbencidina (TMB) y Diaminobencidina (DAB).
 4-Cloronaftol (4CN).
 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazolina-6-sulphonic acid) (ABTS).
 Fluoresecentes: se requiere un fluorímetro. Se genera un producto fluorescente
por acción enzimática:
o 2,4-Metilumbeliferona (Fosfatasa alcalina).
 Quimioluminiscentes: se requiere un luminómetro. La emisión de luz varía
desde un flash o permanece bastante tiempo.
o Luminol
 Otros sustratos: usados en reacciones de amplificación.
En rojo marcados los sustratos que precipitan.
14.5. PROCEDIMIENTO GENERAL

El procedimiento general de un ELISA se lleva a cabo siguiendo 12 etapas:
1. Acoplamiento del antígeno diana, anticuerpo o molécula de reconocimiento a la

fase sólida durante el tiempo necesario (variable según el tipo de superficie, en
general 2h a 37ºC o una noche a 4ºC cuando se trata de adsorción pasiva).
2. Incubar 1-2 horas.
84
3. Lavado (tampón + detergente): se realiza un lavado de la placa para eliminar las

moléculas que se unieron débilmente y pueden alterar la respuesta.
4. Bloqueo 1-2h para reducir NSB (tampón, proteína y detergente): por si quedaron
sitios libres que pudieran reaccionar.
5. Vaciado y escurrido.
Hasta este punto suele venir preparado el kit comercial.
6. Incubación con molécula de reconocimiento primaria o el analito, según el

tipo de ensayo.
7. Lavado del exceso de la sustancia añadida en el paso 6.
8. Incubación con molécula de reconocimiento secundaria marcada con enzima.
9. Lavado del exceso de la sustancia añadida en el paso 8.
10. Incubación con sustrato.
11. Parar reacción, generalmente por cambios de pH.
12. Leer resultados.
Para hacer un ELISA necesitamos ajustar la concentrar la concentración de los tubos.

Colocamos diferentes concentraciones del marcador primario y secundario para ver la
mínima concentración de ambos reactivos en la cual la reacción es visible:
14.6. TIPOS DE ELISA

Diferenciamos cuatro tipos de ELISA:
A. Directo: es la forma más sencilla de realizar un ELISA. Una molécula de

reconocimiento (en este caso, un anticuerpo) marcada con un enzima se une a
un analito, en este caso, antígeno, fijado al pocillo de ELISA o portaobjetos. Al
añadir el sustrato se genera reacción y aparece un producto visible. Una variante
del ELISA directo, la inmunhistoquímica, se usa mucho para ver antígenos en
tejidos: se pega el tejido al portaobjetos y se le añade anticuerpos. En este caso,
nos interesaría usar DAB o 4CN como sustratos, ya que precipitan, marcando la
célula que posee el antígeno. La señal obtenida es directamente proporcional
a la concentración de analito.
85
B. Indirecto: se añade un anticuerpo anti-Ig y el sustrato, produciéndose color.

Determinamos de esta forma anticuerpos en el suero. La señal obtenida es
directamente proporcional a la concentración de analito.
C. Captura: la señal obtenida es directamente proporcional a la concentración
de analito.
a. En el primer caso, usamos el ELISA captura y no el ELISA indirecto
porque se supone que tenemos un anticuerpo monoclonal capaz de
distinguir antígenos de una mezcla. Si nos interesa pegar un solo
antígeno, primero incubamos los anticuerpos de captura (monoclonales)
en la placa para que se fijen a la misma. Al echar una mezcla de
antígenos, los anticuerpos monoclonales reaccionarán con un solo tipo
de antígeno, de manera que los otros se pierden tras el lavado. Ponemos
el suero del paciente, lavamos y colocamos anticuerpos anti-Ig que nos
interese, marcado con el enzima. Al añadir sustrato se genera un
producto visible. Detectamos así anticuerpos en suero.
b. La segunda opción se usa para determinar la presencia de antígenos.
Tenemos fijado anticuerpos anti-antígenos y luego echamos el suero
(con antígeno), por lo que reaccionarán antígeno-anticuerpo. Tenemos el
antígeno unido. Al añadir el segundo anticuerpo, marcado, y el sustrato,
aparece un producto visible.
D. Competitivos: la señal obtenida es inversamente proporcional a la
concentración de analito. Cuanto más analito, menos señal. Diferenciamos
tres tipos de competitivo:
a. Detección de antígeno en suero: Si ponemos anticuerpos marcados en
placa de ELISA con antígeno fijado se obtendrá señal, pero si antes de
añadir los anticuerpos los incubamos frente al antígeno (muestra), se
unirán (si el antígeno existe). Ahora, si lo echamos en la placa:
i. Si hay analito: Los anticuerpos ya reaccionaron con la muestra y
no reaccionan ahora con el antígeno de la placa de ELISA.
ii. Si no hay analito: se unen todos los anticuerpos a la placa,
obteniéndose mucha señal.
b. Detección de anticuerpos en suero empleando anticuerpo marcado:
primero incubamos anticuerpos marcados con el suero del paciente (con
anticuerpos). Al colocarlos en la placa de ELISA, competirán por unirse
al antígeno ligado, por lo que cuanta más señal (más anticuerpos
marcados unidos al antígeno), menos anticuerpos en el suero del
paciente.
c. Detección de anticuerpos en suero empleando antígeno marcado:
tenemos anticuerpos en la placa. Si incubamos el suero del paciente con
el antígeno marcado, reaccionarán, de manera que al depositar la mezcla
en la placa de ELISA:
i. Si hay anticuerpos en el suero del paciente, se unen al antígeno
marcado, impidiendo que se una a los anticuerpos de la placa, no
obteniéndose señal.
ii. Si no hay anticuerpos en el suero del paciente, el antígeno
marcado reacciona con los anticuerpos de la placa, dando señal.
86
14.7. SISTEMAS DE AMPLIFICACIÓN

Tenemos diferentes formas de hacer cadenas de reacciones o amplificar la señal. Los
sistemas de amplificación se usan cuando el analito está en muy baja concentración.
Hay varios tipos:
87
 Anticuerpos/Proteína-A/Lectinas:
A. Si el anticuerpo primario y el anticuerpo anti-enzima son de la misma
naturaleza, por ejemplo, de conejo, podríamos usar un anticuerpo de
unión (anti-Ig de conejo) para unirlos (la región constante es igual). Este
método se usa mucho en anatomía patológica. Usando anticuerpos anti-
enzima se consiguen muchas unidades de enzima por cada anticuerpo
que se une.
B. Otra opción es igual que la anterior, pero en lugar de usar un anticuerpo
de unión, usamos proteína A (reconoce colas de Ig, uniéndolas). No
necesitamos que los anticuerpos sean de la misma especie.
C. Otra posibilidad es usar lectina. La lectina reconoce de manera específica
secuencias de azúcares. La peroxidasa es una glucoproteína. Si el
anticuerpo secundario se marca con Concavalina-A (lectina con cuatro
sitios de unión), reconoce a la peroxidasa en varios sitios, uniéndola y
consiguiendo muchas más unidades de enzima por anticuerpo.
 Complejos avidina-biotina/enzima: la avidina y la estreptavidina (SA) unen

biotina. Marcamos el anticuerpo con biotina, y usamos enzima biotinizado, por lo
que añadir avidina al medio, se unen avidina y biotina, obteniendo muchas
unidades de enzima por anticuerpo unido.
 Soportes multienzimáticos con sistemas dextrano-enzima/molécula de

reconocimiento: en este caso existe una hebra de dextrano (polímero)
modificada químicamente. En ella se pegan enzimas y moléculas de
reconocimiento, que puede ser anticuerpo, avidina, biotina, etc. Si tenemos un
88
antígeno pegado, se va a unir todo el polímero con sus múltiples unidades de

peroxidasa (100 aproximadamente).
 SA-PolyHRP: se usa Estreptavidina unida a la PolyHRP, que es un polímero de

la peroxidasa. Para que la SA reconozca a la molécula de reconocimiento, debe
estar marcada con biotina.
 Aptámeros: recordemos que los aptámeros son moléculas pequeñas que por
su plegamiento actúan como moléculas de reconocimiento. Pueden usarse de
diversas formas mostradas en el esquema inferior.
Antígeno Aptámero
suero marcado
Antígeno Aptámero
suero marcado
Antígeno
Anticuerpo
suero
marcado
 Reamplificación del producto (sistema REDOX): en este caso la amplificación

se lleva a cabo después de realizar el ELISA. No existen muchos casos donde
se pueda hacer, pero uno en el que sí es usando fosfatasa alcalina. El sustrato
para la fosfatasa alcalina es el NADP. El NAD producido en la primera reacción
89
por acción del enzima sirve de cebador para una segunda reacción, un ciclo
REDOX, donde se amplifica la señal de manera que cada molécula de NAD
generada produce 500 de formazán.
 Inmuno-PCR: se pueden combinar las pruebas de ELISA con las PCR. No es

un ELISA, ya que no se usan enzimas. Es una técnica derivada del ELISA. El
anticuerpo de detección está unido covalentemente a un fragmento de DNA.
Utilizando PCR en tiempo real se forman muchísimas moléculas de DNA. Si este
DNA está marcado con nucleótidos fluorescentes, podemos cuantificar la
reacción y se amplifica el resultado. Es un sistema muy sensible, capaz de
detectar incluso una sola molécula en una muestra. Se necesita disponer de
equipos sofisticados.
La cadena de DNA se puede unir mediante enlaces covalentes, enlaces con

biotina o con estreptavidina unida a proteína A, formando quimeras (la proteína
A se une a la cola de IgG y la estreptavidina al DNA biotinizado).
90
Realizando una comparativa entre la sensibilidad de un ELISA normal y un

ELISA amplificado por PCR para la detección de TNFα, obtenemos este gráfico
siguiente. Observamos que a menor concentración de analito, obtenemos
señales en Inmuno-PCR. Es, como ya dijimos, un método muy sensible.
91
92
Tema 15
15. OTROS INMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS
15.1. INMUNODOT (DOT-ELISA O DOT-PLOT)
Es una variante del método ELISA (heterogéneo) en donde el soporte sólido es un papel
de nitrocelulosa o PVDF (polyvinylidene fluoride). El antígeno se deposita por filtración
a través de un papel o depositando una pequeña gota. El sustrato debe generar un
producto insoluble que quede depositado sobre el papel. Dos sustratos ya vistos que
precipitan son el 4CN (4-Cloronaftol) y el DAB (Diaminobencidina).
Se realiza igual que ELISA y los pocillos se lavan mediante un proceso de filtración o
manualmente. Presenta la ventaja de no necesitar espectrofotómetro. También se
pueden observar varios antígenos en una misma tira diagnóstica. Como inconveniente
podemos decir que se trata de un test semicuantitativo que proporciona un resultado
positivo o negativo y un título si se emplean diluciones.
Esta técnica se usa mucho en análisis en tiras. Las tiras constan de un control negativo,
antígenos colocados (puede haber más de un antígeno por tira) y un control positivo. El
procedimiento es el siguiente:
A. Se colocan las tiras y el tampón de lavado, incubándose 10 minutos y

eliminándose la disolución.
B. Se añaden 1,5 ml de tampón de muestra.
C. Se añaden 10µl de las muestras del paciente. Se incuban 30 minutos. Posterior
lavado.
D. Se añade 1,5 ml del conjugado (molécula de reconocimiento marcada). Se
incuban 30 minutos. Posterior lavado.
E. Se añaden 1,5 ml del sustrato. Se incuban 10 minutos. Posterior lavado.
F. Secar tiras y leer resultados con ayuda de la plantilla de interpretación.
Un ejemplo de una tira, donde observamos un resultado positivo y otros negativos (de
C a H también son negativos):
93
15.2. INMUNOTRANSFERENCIA (WESTERN BLOT)

El Western blot es un enzimoinmunoensayo heterogéneo para detectar antígenos en
mezclas complejas o los anticuerpos que los reconocen. Se diferencia del ELISA o
Inmunodot en que en este caso se usa una mezcla de antígenos, en los otros dos
usábamos un antígeno específico. Tiene gran capacidad de discriminación. Se realiza
en dos etapas:
 Separación de los antígenos en un gel de SDS-PAGE (se separan por peso

molecular). La separación se realiza igual que en Inmunoelectroforesis.
 Transferencia a papel de nitrocelulosa y revelado como en inmunodot.
El Western blot se usa para:
 Diagnóstico: permite discriminar la respuesta de anticuerpos frente a los

distintos antígenos presentes en la muestra (por ejemplo, en el VIH).
 Caracterización de antígenos: para discriminar que antígenos de una
preparación son alérgenos (son unidos por IgE), por ejemplo.
 Proteómica: al usar geles bidimensionales (1-SDS-PAGE/2-isoelectroenfoque).
Aislamiento e identificación de proteínas.
15.2.1. PROCEDIMIENTO DE LA INMUNOTRANSFERENCIA

La inmunotransferencia se realiza por
etapas:
1. Preparación de las muestras: se

calientan en presencia de DTT o de
mercaptoetanol (ME) con Lauril sulfato
(SDS), que actúa como detergente. Al hacer
esto, ME y DTT reducen los puentes
disulfuro. El SDS se une a las proteínas y
las lineariza, ya que deshace las estructuras
secundarias y terciarias. Además, el
detergente tiene carga negativa, y se une a
las proteínas con independencia de la
secuencia de aminoácidos (se une a todas
las proteínas). Todas las proteínas
migrarán al polo positivo al realizar la
electroforesis22.
Con esto conseguimos tener las proteínas
linearizadas y con carga negativa, como se
ve en la imagen de la derecha.
22Si recordamos, en la Inmunoelectroforesis, había Ig que migraban al polo negativo porque,

aunque la prueba se realizara en pH alcalino, éstas tenían suficientes aminoácidos básicos que
estabilizaban una carga positiva, migrando al polo negativo. En este caso no ocurre esto, ya
que el detergente se une a todas las proteínas dándoles carga negativa.
94
2. Hacer gel de Poliacrilamida (PAGE):

a. Los geles de poliacrilamida se forman por entrecruzamiento entre
monómeros de acrilamida y pequeñas cantidades de bis-acrilamida.
b. La polimerización se inicia por la
adicción de persulfato amónico y una
base, que cataliza la descomposición
del persulfato y proporciona radicales
libres.
c. Se forman poros de distinto tamaño
que retienen más o menos las
proteínas al pasar a través de ellos.
Los geles pueden ser lineales
(generalmente con un 10% de
concentración) o a gradiente
(habiendo un gradiente de 5-20% en
la concentración). Haciéndolo a
gradiente conseguimos que los poros
vayan haciéndose menos gruesos a
medida que la concentración
aumenta, pudiendo separar las
proteínas por peso molecular.
3. Separar las proteínas en función de su peso molecular: los geles de SDS-
PAGE que se emplean para inmunotransferencia tienen un espesor de 0,5-1mm
y forma rectangular. Se hacen dejando polimerizar la mezcla de acrilamida y bis-
acrilamida en un casete que tiene dos vidrios entre los que se coloca un
separador. En la parte superior se coloca un peine antes de que polimericen las
muestras (como se ve en la imagen superior), en cuyos huecos (almenas) se
depositan las muestras. Al pasar la corriente, las moléculas se separan según
su peso molecular.
95
4. Transferencia de los antígenos a una membrana de nitrocelulosa (NC) o

nailon (PVDF) y revelado: los anticuerpos no pueden entrar en el gel de
poliacrilamida23 para reaccionar con los antígenos. Se transfieren a otro soporte
sin que se modifique su posición. Inicialmente la transferencia se realizaba
poniendo la poliacrilamida pegada a la nitrocelulosa y estos entre dos papeles
de filtro, con un peso encima. Actualmente se realiza por electroforesis (imagen
inferior).
Una vez transferidos, se bloquea y se revela como se ha descrito en la técnica
de inmunodot. El sustrato debe generar un producto que precipite. Podemos usar
4CN (4-Cloronaftol) o DAB (Diaminobencidina). Con esto conseguimos una
banda de precipitado en el lugar donde haya reacción antígeno-anticuerpo.
15.2.2. GELES 2D
La inmunotransferencia se puede mejorar todavía más usando geles en 2D. En el gel
anteriormente usado puede haber proteínas de peso molecular semejante, por lo que
una banda no correspondería a un solo tipo de proteína. Para evitarlo:
1. Los antígenos se separan primero por isoelectroenfoque, usando una tira de

plástico con gel con bolas pegadas que tienen la capacidad de mantener un pH
determinado en sus inmediaciones. Se separan los antígenos por punto
isoeléctrico24.
2. La tira de plástico se coloca sobre el gel de Poliacrilamida, separándose
mediante SDS-PAGE. Las manchas de interés se pueden cortar y secuenciar la
proteína para su identificación, o se puede realizar inmunotransferencia,
identificando los perfiles antigénicos.
Ahora tenemos una cámara donde las proteínas están separadas por peso molecular
de arriba abajo y por punto isoeléctrico de izquierda a derecha.
23Para penetrar por ese gel deberían estar desnaturalizados, por lo que ya no serían anticuerpos.
24El punto isoeléctrico es el pH en el cual la carga neta de la proteína es 0. En este punto las
proteínas no avanzan.
96
15.2.3. APLICACIONES CLÍNICAS DEL WESTERN BLOT

Una aplicación para el cual se usa mucho el WB es el diagnóstico de infección por VIH.
Para esta prueba, se realizan dos test: uno de detección inicial (test IC o ELISA) y un
test de confirmación (ELISA con proteínas recombinantes o WB).
Para realizar esta prueba se infectan células con el virus VIH. La mezcla de células se
machaca y se realiza el western blot. Las proteínas en banda son transferidas a un papel
de nitrocelulosa con objeto de realizar pruebas de reactividad antigénica. Para confirmar
una infección por VIH, debe existir reactividad frente a diferentes antígenos
(dependiendo de la organización, FDA, CDC u OMS, los antígenos a reconocer son
distintos).
15.3. ELISPOT
La base sigue siendo la técnica del ELISA. En lugar de
cuantificar el analito, se cuantifican células que
produce el analito que nos interesa. Son técnicas muy
variables. Se emplea un sustrato para el enzima que
genere un producto coloreado insoluble.
Con esta técnica podemos detectar linfocitos B o T. Si

queremos detectar los T debemos incubar los linfocitos
con antígenos y después ver si se produce la reacción.
Se usa en clínica para diagnosticar tuberculosis (TB) y
monitorización de pacientes.
En este método tenemos pegados anticuerpos contra

la citoquina que queremos detectar. Se siembran
células estimuladas en el pocillo con los anticuerpos.
Incubamos. Tras lavar tenemos los anticuerpos
inmovilizados con citoquinas (solo tienen citoquinas los
anticuerpos que estaban donde la célula productora de
citoquinas). Ahora añadimos un anticuerpo anti-
citoquina marcado con un enzima y un sustrato que
precipite. Sólo precipitarán en el lugar donde antes
había células productoras de antígenos (en este caso,
citoquinas). Si contamos las manchas sabremos
cuantas células producen citoquinas en ese volumen
añadido.
Además, esta técnica se puede realizar recubriendo la membrana de antígeno. Así

reconocemos células productoras de anticuerpos (linfocitos B). Los anticuerpos se
liberan de la célula y se unen a los antígenos. Ponemos un antígeno secundario
marcado con un enzima. Al añadir sustrato, aparecen manchas que indican cuantas
células productoras de anticuerpos había.
97
En ambos casos se detectan puntos donde había las células productoras de

anticuerpos:
15.4. APLICACIONES ELISA (EJEMPLOS)

15.4.1. CUANTIFICACIÓN DE BIOTINIL-E EN EXTRACTOS PARASITARIOS
Se trata de un ELISA competitivo y cuantitativo.
Las BEs son carboxilasas biotinilenzimas. Son enzimas que usan biotina como grupo
prostético (lo tienen unido). Si se cuantifica la cantidad de biotina, indirectamente se
cuantifica la cantidad de carboxilasa.
Tenemos diferentes nematodos y queremos saber si unos tienen más BEs que otros.
Como las BEs tienen biotina podemos emplear la unión biotina-BSA para cuantificar
mediante ELISA. El procedimiento es el siguiente:
1. Preparar una recta patrón. Para ello pesamos la biotina y hacemos una solución.
A partir de ella realizamos diluciones seriadas. Empleamos avidina-peroxidasa.
Le echamos la misma cantidad a todos los tubos. La relación entre biotina libre
y biotina unida a avidina será diferente en cada tubo. Por eso, cuanto mayor es
la concentración de biotina, menor absorbancia existe.
2. Añadir a todos los pocillos una misma cantidad de avidina-POasa.
3. Acoplar el antígeno a la placa de ELISA (biotina-BSA). Incubar, lavar y bloquear.
4. Transferir el contenido de los pocillos preparados en 1 a la placa ELISA que
contiene el antígeno. Después, incubar y lavar la placa. Con el lavado se
eliminan todas las moléculas de avidina-POasa que se unieron anteriormente a
la biotina en el tubo de ensayo. De ahí que, a mayor concentración de biotina,
menor absorbancia (se lava la biotina unida a avidina que no se une al antígeno
fijado en la placa).
5. Añadir el sustrato, incubar 20 minutos, parar la reacción y leer el resultado.
6. Interpolar el resultado a la curva patrón.
98
15.4.2. DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS IgM/IgA SIN INTERFERENCIA DE IgG

Para detectar si una infección por toxoplasmosis es pasada o reincidente. Las IgG al ser
pequeñas y numerosas tienen más probabilidad de unirse al antígeno. Si la cantidad de
antígeno es limitada puede ser que las IgG ocupen los lugares de unión de las IgM.
Para eliminar las IgG y que solo queden las IgM, en la placa de ELISA se pone un
anticuerpo anti-IgM. Cuando se lava el suero del paciente (o recién nacido si hablamos
de toxoplasma) solo se pegan las IgM, el resto se van al realizar el lavado de la placa.
Las IgM no son específicas. Al añadir el antígeno de toxoplasma marcado solo se pega
a IgM que tengan especificidad por ese antígeno. Si el ensayo es positivo, hay IgM frente
al antígeno que nos interesa.
99
100
Tema 16
16. INMUNOENSAYOS AUTOMATIZADOS
Son los inmunoensayos utilizados en hospitales, porque son capaces de realizar
muchos análisis al día. Son fáciles de automatizar. Se pueden emplear muestras de
suero y orina. Están especialmente indicados para detectar sustancias de bajo peso
molecular como:
 Hormonas.
 Fármacos.
 Drogas de abuso.
Algunos sistemas automatizados se basan en que la formación del complejo antígeno-

anticuerpo modula la actividad enzimática: cuando se genera la reacción antígeno-
anticuerpo se altera la funcionalidad de la enzima. Otros interpretan cambios en la
velocidad de rotación de las moléculas (FPIA). Suelen tener un formato competitivo.
Son técnicas homogéneas (no separan los componentes). Las técnicas de aglutinación
(hemaglutinación y aglutinación del látex) también son IAs homogéneos, pero no EIAs.
Además, hay técnicas heterogéneas.
16.1. ENZIMOINMUNOENSAYOS HOMOGÉNEOS

16.1.1. EMIT (ENZYME MULTIPLIED IMMUNOASSAY TECHNIQUE O TÉCNICA DE
INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO MULTIPLICADO)
El enzima se pega al analito que queremos determinar después en la muestra. Se pegan
químicamente. Esta unión no debe alterar la funcionalidad del enzima. Se necesita un
anticuerpo anti-hapteno. Al mezclar el enzima unido al hapteno con Ab anti-Hapteno, el
anticuerpo se une al hapteno y el enzima deja de funcionar. Si en el tubo se pone
anticuerpo anti-hapteno, enzima unido al hapteno y en la muestra hay hapteno libre,
algún hapteno libre se unirá al anticuerpo anti-hapteno, por lo que no habrá tanto
anticuerpo libre para bloquear el enzima, por lo que éste actuará dando una señal.
La señal es directamente proporcional a la concentración de enzima-hapteno libre y,

por lo tanto, a la cantidad de hapteno libre25. Si en el tubo solo hay anti-H y enzima unido
a hapteno, el enzima se bloquea completamente y la señal es 0. No hay que separar
nada, el enzima funciona o no dependiendo de que haya o no hapteno en la muestra.
El enzima usado es la Glucosa-6P DH, que cataliza la reacción del paso de Glucosa-6P
(+ NADP+) a 6-Fosfogluconolactona (+ NADPH).
25 Cuanto más hapteno haya, más enzima-hapteno hay libre.
101
16.1.2. EMIA (ENZYME MEMBRANE IMMUNOASSAY)

En este método se usa un liposoma26 con el que se engloban unidades de enzima. Por
la parte externa el liposoma tiene el analito, fijado a la membrana. Este método, pues,
requiere que todos los analitos sean anfifílicos para así poderlos fijar a la membrana
lipídica. Esto no suele ocurrir, de manera que se usan proteínas que sí que lo son y se
unen al analito a determinar, quedando ya en la superficie del liposoma.
Al añadirle anticuerpos y el complemento, se produce lisis del liposoma, liberándose el

enzima. Si posteriormente se añade sustrato, se producirá una señal.
Para que se pueda usar con fines de diagnóstico, hay que incubar los anticuerpos con
la muestra. Si se pegan al analito, disminuyen los anticuerpos para unirse al liposoma.
La señal obtenida, pues, es inversamente proporcional a la cantidad de analito en
la muestra.
16.1.3. CEDIA (COMBINED ENZYME DONOR IMMUNOASSAY

Es un ensayo semejante al EMIT, pero en este caso se usa un enzima que tiene dos
subunidades. De esta manera podemos tenerlas separadas, y solo funcionarán cuando
estén unidas. Se suelen usar subunidades de la β-D-galactosidasa, que al juntarse
tienen actividad enzimática.
Necesitamos:
 Anticuerpo contra el analito a determinar.

 Subunidad A del enzima a la cual le pegamos el hapteno sin que altere la
capacidad de la subunidad A de unirse a la subunidad B.
 Subunidad B libre.
Si incubamos la subunidad A unida al hapteno (analito) a determinar con anticuerpos

previamente incubados con la muestra, se unen y se impide la unión de las dos
subunidades (se bloquea A), impidiendo la formación de la galactosidasa. Si en la
muestra a determinar tenemos el hapteno, al incubarlo con los anticuerpos, se unen y
se impide la posterior unión del anticuerpo con la subunidad A, por lo que se formaría la
26 Bicapa lipídica.
102
galactosidasa al añadir la subunidad B. De esta manera obtenemos un ensayo cuya

señal es directamente proporcional a la cantidad de hapteno en la muestra.
16.1.4. INMUNOENSAYO POR POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA (FPIA)

No es un enzimoinmunoensayo, ya que no se usa ningún enzima. Sólo se puede
usar con analitos de bajo peso molecular.
La luz ordinaria (a) son ondas que se desplazan en muchos planos del espacio. Una luz
polarizada (b) va solo por un plano:
Al enviar un haz de luz fluorescente polarizado a un analito con una luz fluorescente se
excita el marcador, que emite fluorescencia con una polarización determinada
primariamente por el movimiento rotacional de la molécula. Dado que la velocidad
de rotación molecular es inversamente proporcional al volumen de la molécula, la
polarización se relaciona con el tamaño de la misma:
103
 Molécula pequeña: rota muy rápido. Emite luz despolarizada.

 Molécula grande: rota lentamente. Emite luz polarizada.
Así, los cambios en la polarización de la fluorescencia reflejan la asociación o

disociación entre las moléculas de interés.
Si se emite luz polarizada, tenemos complejo antígeno-anticuerpo. Si se emite luz

despolarizada, tenemos el analito libre.
Para llevar este procedimiento a la automatización:
Tenemos el tubo con la muestra para determinar si existe o no analito en ella y lo

mezclamos con haptenos marcados con fluorescencia. Ambos haptenos compiten al
añadir anticuerpo: Si hay mucho analito en la muestra, se une mucho el anticuerpo a
ellos, de manera que los ligandos marcados estarán libres, girarán rápido y por tanto
emitirán luz despolarizada. Si hay poco analito en la muestra, la luz permanece
polarizada. De esta manera, la concentración de analito presente es inversamente
proporcional a la intensidad de la señal medida.
104
Cuanto mayor sea la despolarización de la luz, más analito en la muestra.
Es importante remarcar que en este método no se podrían marcar anticuerpos con

fluorescencia, puesto que los anticuerpos son moléculas muy grandes y siempre girarían
más lento, produciendo luz polarizada esté o no unido al antígeno.
16.2. ENZIMOINMUNOENSAYOS HETEROGÉNEOS

16.2.1. ENZIMOINMUNOENSAYO POR MICROPARTÍCULA (MEIA)
Es una técnica semejante al ELISA captura, pero en lugar de usar un soporte, las
moléculas de reconocimiento se pegan sobre partículas de látex.
1. La muestra a analizar se mezcla con las micropartículas de látex recubiertas con

el anticuerpo frente al analito de interés.
2. Una alícuota de la mezcla de reacción se transfiere a la matriz de fibra de vidrio.
3. Se añaden anticuerpos anti-analito marcados con fosfatasa alcalina que
formarán un sándwich con el anticuerpo inmovilizado.
4. Se incuba y se lava.
5. Posteriormente se agrega el sustrato Fosfato 4-metilumbeliferona (MUP) a la
mezcla.
6. Se mide el producto fluorescente, metilumbeliferona.
Esta prueba tiene un formato sándwich no competitivo que produce resultados que son
directamente proporcionales a la cantidad de analito presente. Esta prueba tiene
un amplio uso para medir marcadores asociados a daño cardíaco, fertilidad, cáncer,
metabólico, de hepatitis y de tiroides.
Tras añadir el MUP, se formaría el producto fluorescente medible, que nos daría
directamente la cantidad de analito.
16.2.2. INMUNOENSYO MAGNÉTICO QUIMIOLUMINISCENTE (CMIA)

Muy semejante al anterior. En lugar de usar micropartículas de látex se usan
micropartículas magnéticas. De esta manera, para lavar, simplemente hay que
encender un electroimán.
Puede realizarse también con un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina,
añadiendo de fosfato MUP. Otra opción es usar un anticuerpo secundario marcado con
un compuesto quimioluminiscente que produce luz al combinarlo con hidróxido de sodio
(NaOH) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Esta técnica es más sensible y con una mayor
105
facilidad de medición que en MEIA. Un formato sándwich no competitivo produce

resultados que son directamente proporcionales a la cantidad de analito presente.
Aquí vemos una tabla comparativa entre el MEIA y el CMIA.
Etapa de Tecnología de
Tecnología Fase sólida Marca
separación detección
MEIA Micropartículas Matriz de Enzima fosfatasa Detector de
de látex fibra de alcalina fluorescencia
vidrio
CMIA Micropartícula Imán Compuesto Tubo
magnética quimioluminiscente fotomultiplicador de
quimioluminiscencia
16.3. TECNOLOGÍA DE MICROARRAYS

Si queremos determinar la presencia de un analito, tenemos que hacer un ELISA para
cada antígeno. Se trata de un método heterogéneo. Son ensayos interesantes ya que
así podemos ver diferentes reacciones en distintos pocillos. Veamos un esquema:
Al igual que se hace este ensayo fijando anticuerpos a la placa, se podría realizar de
manera directa la determinación de anticuerpos en una muestra, fijando los antígenos a
la placa y usando como moléculas de reconocimiento secundarias otro anticuerpo
marcado con molécula fluorescente.
Es importante destacar que los anticuerpos primarios son anticuerpos monoclonales

frente al antígeno. De esta manera se pueden detectar diferentes moléculas en una
mezcla en el mismo ELISA. Un buen ejemplo sería la determinación de diferentes
citoquinas. Pondríamos en cada pocillo un anticuerpo monoclonal frente a cada tipo de
citoquina (IL-6, TNFα, IL-4, IL-12, IL-8, etc).
El procedimiento a seguir es el mismo que durante un

ELISA normal.
Se obtienen resultados semejantes al mostrado en la

imagen de la derecha. Como vemos, hay pocillos donde
se detecta fluorescencia (existe el analito), otros en los
que no se detecta con mucha fuerza (poco analito) y otros
en los que directamente no hay analito.
106
Tema 17
17. INMUNOENSAYOS SOBRE CÉLULAS O TEJIDOS
En este tema se tratan técnicas para inmunoensayos que nos permiten localizar
topográficamente lo que buscamos dentro de una célula o un tejido. Por tanto, estas
pruebas nos permiten:
 Detectar la presencia de antígenos en células o tejidos y su localización

dentro de los mismos.
 Detectar anticuerpos en el suero de pacientes que reaccionan contra
antígenos tisulares.
 Pruebas funcionales con linfocitos T, B, NK y células fagocíticas.
Para este tipo de técnicas se usan diferentes metodologías:
 Técnicas de Inmunofluorescencia.
 Citometría de flujo.
 Técnicas de Inmunohistoquímica.
 Fagocitosis.
 Cultivo de linfocitos.
17.1. INMUNOFLUORESCENCIA
17.1.1. APLICACIONES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA
La Inmunofluorescencia se utiliza principalmente con dos objetivos:
1. Diagnóstico:
a. Localización de antígenos en tejidos o células (habitualmente en cortes
histológicos mediante criostato27).
i. Análisis de antígenos (ej. tumorales, virales, parasitarios) en
tejidos, células o microorganismos frescos, congelados o fijados.
b. Detección de anticuerpos en el suero de un paciente mediante reacción
con antígenos en tejidos o células de mamíferos u otros organismos (ej.
autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes. Esta metodología es la
inversa al anterior. Se usan tejidos externos para comprobar que existen
anticuerpos en suero.
2. Investigación:
a. Investigación de tráfico y reposición de moléculas de la membrana celular
o intracelulares.
b. Determinar la expresión de genes en células y tejidos.
c. Localizar secuencias específicas de ADN en cromosomas.
d. Las moléculas fluorescentes unidas a antígenos o anticuerpos también
se pueden emplear como haptenos frente a las cuales se pueden generar
27Un criostato es un aparato que permite congelar la muestra y realizar cortes mediante un
micrótomo.
107
anticuerpos. Estos anticuerpos tienen la ventaja de no estar presentes de

forma natural.
17.1.2. METODOLOGÍA DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

En la Inmunofluorescencia se usan moléculas fluorescentes como trazadoras de
antígenos o anticuerpos sin que pierdan sus propiedades antigénicas. Moléculas
fluorescentes (fluorocromos) muy utilizadas son la fluoresceína, rodamina y faloidina).
Las muestras se observan con un microscopio de fluorescencia (UV). Se pueden
emplear varios fluorocromos simultáneamente (microscopía confocal).
17.1.3. TIPOS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Diferenciamos tres tipos: Inmunofluorescencia directa (IFD), Inmunofluorescencia
indirecta (IFI) y Tinción del complemento (TC):
Aunque aquí se usan anticuerpos como moléculas de reconocimiento, se pueden usar

todas las moléculas de reconocimiento antes vistas (marcadas con fluorocromo).
En la Inmunofluorescencia directa se usa un anticuerpo marcado contra el antígeno

de interés.
La Inmunofluorescencia indirecta funciona igual, pero usando dos anticuerpos para

reconocer y marcar el lugar. Esta se usa para ver si el paciente tiene anticuerpos frente
a un antígeno localizado en un tejido. A veces, en este caso, no necesitamos el suero
del paciente. Se podría hacer una biopsia del tejido. Si hay un anticuerpo fijado, con el
secundario se vuelve fluorescente.
108
La tinción del complemento se realiza usando un anticuerpo secundario anti-

complemento marcado con fluoresceína para que, tras unirse el complemento, se una y
de señal. Realmente es una técnica de amplificación, ya que se une más de una
molécula de complemento por antígeno localizado. Por ello, es una técnica más
sensible.
17.1.4. VENTAJAS E INCOVENIENTES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

Como ventajas se destaca que se permite localizar antígenos de manera fiable,
específica, rápida y sencilla. Además, permite realizar tinciones simultáneas con
varios fluorocromos.
Como inconvenientes se destaca que algunos tejidos tienen autofluorescencia.

Además, puede ocurrir superposición de la fluorescencia si usamos varios fluorocromos
y también puede ocurrir una destrucción fotoquímica.
17.1.4.1. MARCAJE MÚLTIPLE

Podemos ver simultáneamente, en el mismo ensayo, donde están dos moléculas
distintas. Por ejemplo, para detectar receptores en un tejido nervioso. Colocamos dos
anticuerpos primarios contra el receptor que queramos detectar. Ambos anticuerpos
deben estar marcados de forma diferente, para que dos anticuerpos secundarios tengan
capacidad de diferenciar ambos anticuerpos primarios. Por ejemplo, si se usan
anticuerpos de ratón anti-D1 y anti-D2, no podemos usar simplemente como anticuerpo
secundario uno de conejo anti-ratón, ya que no diferenciaría los anti-D1 de los anti-D2.
Por ello, una solución sería marcar el anti-D1 con biotina, por ejemplo, poniendo avidina
marcada con fluoresceína para detectarlo.
También se puede usar en microorganismos.
17.1.4.2. MICROSCOPÍA CONFOCAL

Esta técnica todavía se puede mejorar más si usamos un microscopio confocal. El
microscopio confocal es un microscopio óptico que incluye como fuente de luz un láser
y un sistema electrónico que ayuda a la captación de imágenes. Se puede emplear para
hacer inmunofluorescencia. El microscopio confocal obtiene imágenes de secciones
ópticas muy finas, consiguiendo que el enfoque se realice sobre un único plano
(confocal). Sólo la luz que está dentro de ese plano puede ser detectada, de modo que
la calidad de imagen es mucho superior que las de campo amplio. Puesto que solo se
ilumina un punto cada vez, se requiere un escáner de la muestra para obtener imágenes
tridimensionales.
109
A la izquierda, un microscopio confocal. A la derecha, una imagen obtenida mediante

microscopía confocal de células endoteliales. En azul, el núcleo; en verde, los
microtúbulos y; en rojo, los filamentos de actina.
17.2. CITOMETRÍA DE FLUJO

El citómetro de flujo está compuesto por
un tubo capilar muy fijo por el cual pasa
una suspensión de células. Sobre esta
suspensión de células atraviesa un
delgado haz de luz láser. La luz
transmitida y dispersada al pasar por las
células es medida por unos dispositivos
que detectan o bien dispersión de luz o
fluorescencia, permitiendo clasificar las
células por tamaño y por marcaje.
La citometría de flujo se emplea de rutina en hospitales para el diagnóstico y

seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias. Además, se usa para
el recuento de poblaciones de linfocitos e inmunofenotipado.
17.2.1. INMUNOFENOTIPADO
La citometría de flujo es el método de elección para realizar el inmunofenotipado. Se
emplean anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos frente a distintos
marcadores de CD. El inmunofenotipado se emplea para identificar poblaciones de
células normales y tumorales (por ejemplo, en leucemias). Se pueden emplear
muestras de sangre, médula ósea o LCR. Con esta técnica se analizan varios miles de
células por segundo.
17.3. INMUNOHISTOQUÍMICA
Es una técnica muy similar a la inmunofluorescencia, pero, en este caso, la molécula
trazadora es un enzima. Las enzimas empleadas en microscopía óptica son la
peroxidasa y la fosfatasa alcalina, mientras que se usan anticuerpos con oro coloidal
para microscopía electrónica28.
28Se usa oro coloidal porque es opaco para la ME, de manera que se ven bolas donde hay
antígeno.
110
Tiene utilidad para localizar antígenos, estructuras celulares o patógenos en tejidos.
Marcaje: para microscopía óptica se realizan cortes con el micrótomo, con una molécula
de reconocimiento con enzima y un sustrato precipitable. Para microscopía electrónica
se realiza un corte con ultramicrotomo y se usan anticuerpos marcados con oro coloidal.
En este caso es más complicado usar enzimas que den diferente color, por lo que se
suele hacer para un solo antígeno. En microscopía electrónica podemos hacerlo para
más de un antígeno usando nanopartículas de distintos tamaños para diferenciar
estructuras.
17.3.1. PROCEDIMIENTO GENERAL DE INMUNOHISTOQUÍMICA

El proceso se realiza en 8 etapas:
1. Fijación, inclusión del tejido.

2. Corte histológico.
3. Desparafinar e hidratar.
4. Bloqueo de la actividad o afinidad endógena: hay que tener cuidado porque los
tejidos pueden tener actividad peroxidasa intrínseca. Para bloquearla, se añade
exceso de peróxido de hidrógeno (sustrato de la peroxidasa).
5. Anticuerpo primario: por ejemplo, anticuerpo monoclonal. Sólo en el caso del
método indirecto.
6. Anticuerpo secundario marcado: por ejemplo, anti-ratón.
7. Sustrato que genere un producto precipitado visible: por ejemplo 4-CN.
8. Contratinción (si se requiere). Se ven de forma precisa las estructuras marcadas.
9. Montaje: base acuosa o resina (deshidratado).
Es importante diferenciar entre el ELISA y la Inmunohistoquímica: en la

Inmunohistoquímica podemos ver la localización del antígeno a determinar. Con un
ELISA solo sabemos si está o no presente en la muestra.
17.4. FAGOCITOSIS
La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es una enfermedad hereditaria ligada al
cromosoma X:
 Deficiencia en el sistema NADPH oxidasa.
111
 No se generan radicales Superóxido y otros intermediarios del oxígeno y, como

consecuencia, hay alta susceptibilidad a infecciones recurrentes de bacterias y
hongos.
Para ver la funcionalidad de las células se usan dos técnicas:
A. Reducción del Nitroblue Tetrazolium (NBT): se extrae la sangre del paciente

y se separan las células nucleadas. Estas son incubadas con PMA (Phorbol
miristate acetate) que estimula la fagocitosis. Al echar NBT (amarillo) se fagocita
por las células y queda almacenado en vesículas. Si el enzima es funcional, el
NBT se reduce a formazán de color violeta (se ven manchas de este color en la
muestra). Si el enzima no es funcional se ven manchas rojas.
B. Reducción de dihidrorodamina (DHR): se forma un compuesto fluorescente

que puede ser medido por Citrometría de flujo.
112
Tema 18
18. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN ALERGIA
Vamos a tratar técnicas específicas usadas en alergias, autoinmunidad y trasplante.
18.1. CONCEPTOS GENERALES

El sistema inmune también puede producirnos daño tisular y enfermedades. Ocurren
por reacciones exageradas:
 Reacción o respuesta excesiva y descontrolada contra un antígeno externo:

enfermedades por hipersensibilidad: alergia.
 Reacción por falta de autotolerancia y respuesta inmune contra antígenos
propios o autólogos: enfermedades autoinmunes.
18.1.1. ALERGIAS
Podemos diferenciar varios tipos de hipersensibilidad mostradas en la tabla adjunta. Se
destacan las hipersensibilidades de tipo I, IVa y IVc.
Antes de pasar al estudio de las técnicas vamos a estudiar a fondo las

hipersensibilidades de tipo I y tipo IVa y IVc.
18.1.1.1. HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO I

Los linfocitos B se transforman en células plasmáticas que liberan IgE. Estas IgE se
pueden unir al basófilo/mastocito activándolo. Podemos separarla en dos fases:
113
 Fase temprana: la primera hora.

o El antígeno se presenta a las células Th2. Estas provocan la activación
de linfocitos B para convertirse en células plasmáticas (productoras de
IgE). Las IgE liberadas por las células plasmáticas se unen al mastocito
dando lugar al mastocito armado. El alérgeno agrega el receptor FcεRI
(receptor de alta afinidad), provocando la movilización de iones Ca+2,
migración de gránulos hacia la membrana y liberación de factores de
inflamación preformados (histamina, serotonina, heparina y otros).
o Activación de la fosfolipasa A2 que actúa sobre la fosfatidilcolina de la
membrana liberando ácido araquidónico (precursor de prostaglandinas y
leucotrienos) y lisofosfatidilcolina (precursor del PAF, factor activador de
plaquetas).
 Fase tardía: 4-8h. Los factores quimiotácticos liberados por basófilos y células
B atraen eosinófilos que liberan PBP (proteína básica principal), PCE (proteína
catiónica de eosinófilos). Estas, junto con LTs y PAF, generan daño tisular.
En clínica:
 Pulmón: asma.
 Mucosa nasal: rinitis.
 Piel y mucosas: urticaria, angioedema, urticaria de contacto.
 Sistémico: shock anafiláctico.
18.1.1.2. HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO IVA/IVC

Mediado por macrófagos (IVA) y linfocitos activados (IVC).
114
 Mecanismo inductor:
o Presentación del antígeno a los linfocitos Th0, que se activan a Th1.
o Liberación de citoquinas que activan macrófagos.
o Liberación de nuevas citoquinas con acción tóxica/apoptótica o que
atraen otras células.
 Mecanismos citotóxicos:
o Linfocinas: hipersecreción (IF-ᵞ, TNF-α, LT).
o Linfocitos Tc (antígenos intracelulares).
o Células NK: activadas por IL-12 e IL-2.
En clínica: tiroiditis de Hashimoto, dermatitis/fotodermatitis de contacto29.
18.1.2. PREVALENCIA DE ALERGIAS EN ESPAÑA

En España un 21,6% de la población tiene alergia. Dentro de este grupo de alérgicos,
se separan:
 Rinoconjuntivitis: 45,4%
 Asma bronquial: 24,9%
 Urticaria: 24,6%
 Dermatitis: 21,5%
 Angioedema: 6%
 Alergia alimentaria: 0,6% (poco común: el tubo digestivo está preparado para
resistir antígenos).
29La alergia a metales como el Ni se produce por la formación de un complejo con las proteínas
de la piel.
115
Podemos separar los alérgenos en:
 Pólenes: 31,5%
 Medicamentos: 29,4%
 Ácaros del polvo: 25,3%
 Animales, metales, alimentos, hongos, picaduras de insectos, látex y sol30:
menor del 10%.
18.2. ALÉRGENOS
Son antígenos que causan la alergia: proteínas y glicoproteínas, glicanos, productos
químicos, metales, etc. No hay lípidos alergénicos.
Siguen la siguiente nomenclatura: tres primeras letras del género, la primera letra de la
especie y un número:
Podemos clasificar los alérgenos en:
 Inhalación (2-60 µm): se clasifican por intramuros

(polvo doméstico, dentro de casa) o extramuros
(pólenes u hongos, fuera de casa).
 Ingestión.
 Contacto (piel):
o Eccema de contacto.
o Urticaria de contacto.
 Inoculación (vía percutánea).
18.2.1. ALÉRGENOS POR INHALACIÓN
18.2.1.1. POLVO DOMÉSTICO

Está compuesto de material inerte (partículas de arena y fibras textiles), restos de
comida, bacterias, algas, hongos, escamas humanas y animales, ácaros (de media hay
12 ácaros/gramo de polvo en una casa limpia) y antígenos de otros artrópodos como
cucarachas.
18.2.1.2. ÁCAROS ALERGÉNICOS

Las especies que causan alergia son:
 Dermatophagoides pteronyssinus.
 D. farinae.
80%
 D. microceras.
 Euroglyphus mainei
 Tarnosemus spp.
30
La hipersensibilidad al sol se produce cuando los mastocitos son muy sensibles y por acción
UV se genera liberación de histamina.
116
Cuando la concentración de ácaros supera los 100ácaros/g existe riesgo de asma

bronquial.
Los alérgenos que intervienen son:
 Heces: alérgenos mayores (Grupo I): Der p 1, Der f 1 y Der m 1.

 Saliva, secreciones, enzimas, mudas…
Con máxima prevalencia en el norte de España y Canarias (donde las condiciones son
idóneas para el desarrollo de ácaros: humedad relativa >55% y temperaturas suaves).
Además, crecen mejor en superficies como moquetas, alfombras, tapizados, etc.
18.2.1.3. PÓLENES
Los podemos clasificar en:
 Anemófilos (alergénicos): transportados por el viento, pueden causar

Rinoconjuntivitis y/o asma.
 Entomófilos: transportados por insectos. No son alergénicos.
Los factores que determinan la alergenicidad de un polen son:
 Capacidad de flotación: cuanto más flote más fácil va por el viento.

 Tasa de producción y distribución: con sucesión de días lluviosos y soleados se
produce más polen.
 Potencia del alérgeno.
Pólenes relevantes:
 Cipreses (enero-marzo).
 Abedul (macizo galaico; abril).
 Gramíneas (centro y norte peninsular; abril-julio).
 Olivo (Jaén, Sevilla, Granada, Córdoba; abril-junio).
 Parietaria (costa mediterránea, Barcelona, Murcia; abril-julio).
 Chenopodium (julio-septiembre).
 Platanus hispánica (Madrid).
18.2.2. ALÉRGENOS POR INGESTIÓN
18.2.2.1. ALIMENTOS
Son alérgenos que penetran por vía digestiva. Más frecuentes en niños. Se denominan
intolerancias (no IgE).
Alimentos:
 Huevos: ovoalbúmina, lisozima, conalbúmina.

 Leche: β-lactoglobulina, BSA, caseína, α-lactoalbúmina.
 Pescado: cualquier especie. Contienen proteínas del sarcoplasma:
parvoalbúminas, que presentan reactividad cruzada con otros peces.
 Crustáceos y moluscos: tropomiosina, con reactividad cruzada con insectos
y ácaros.
117
Existen raciones cruzadas entre alergias respiratorias y alimentarias. Se denominan

síndromes orales-respiratorios:
Alérgeno inhalado Alimento

Polen de abedul. Avellana, manzana, pera, frutas con
hueso (melocotones, ciruelas y cerezas).
Polen de la ambrosía. Melón, plátano.
Ácaros del polvo doméstico. Caracoles.
Látex Plátano, castañas, aguacate, kiwi,
grosella.
18.2.3. OTROS ALÉRGENOS

Diferenciamos:
 Alérgenos por contacto:

o Pueden producir alergia tipo I o tipo IVa-IVc.
o Principales alérgenos:
 Metales (cromo, níquel, cobalto).
 Tintes capilares y cosméticos.
 Adhesivos (resinas epoxi) y reactivos químicos (dicromato
potásico, formaldehído, etc.).
 Látex (alergia tipo I y tipo IVa-IVc).
 Alérgenos por inoculación: penetración por vía percutánea. Destacan los
venenos de himenópteros31.
 Alergia a medicamentos: reacciones alérgicas y pseudoalérgicas
(anafilactoides32).
18.3. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN ALERGIA

Las diferenciamos por si son pruebas in vitro o in vivo.
 Pruebas in vitro:
o Determinación de IgE total: las reacciones alérgicas aumentan la
cantidad de IgE.
o Determinación de IgE específica (CAP, ELISA, Microarrays de
alérgenos33): así sabemos frente a que antígeno es la alergia.
o Determinación de mediadores liberados por mastocito.
o Test de activación de basófilos.
 Pruebas in vivo:
o Prick test (tipo I): pinchar diferentes alérgenos en la piel y ver la
reactividad.
o Pruebas cutáneas o prueba del parche (tipo IV): intraepidérmica.
o Intradermorreacciones: tuberculina. Se provoca pinchazo dentro de la
dermis.
31 Es uno de los mayores órdenes de insectos, que engloba a las hormigas, abejorros, abejas y
avispas entre otros. El nombre proviene de sus alas membranosas.
32 Desencadenadas por mecanismos no inmunológicos, por ejemplo, un aumento de histamina
por un fármaco.
33 Con una gota de suero se ve la reactividad frente a muchos alérgenos.
118
18.3.1. TEST DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS

Se obtienen los basófilos de sangre periférica del paciente mediante centrifugación en
gradiente. Los basófilos son estimulados con el alérgeno in vitro. Se detectan,
posteriormente, los basófilos activados mediante el marcaje con anticuerpos anti CD123
y anti CD63: las células en reposo expresan el CD123, pero no expresan el marcador
CD63, que se empieza a producir cuando se entrecruzan las IgE pegadas al receptor
de alta afinidad (FcεRI) en la membrana mediante un anticuerpo anti-IgE (señal máxima)
o por el alérgeno sólo34. El CD63 se produce en las vesículas, por tanto, al haber
exocitosis, se fija el CD63 a la superficie del basófilo. La respuesta se mide por
citometría de flujo.
Si al basófilo A le añadimos anti CD63 no se produce reacción ya que no existe ese

marcador en su superficie. Sin embargo, al añadir anti CD123 sí que hay reacción, de
tal manera que podemos contabilizar el total de basófilos. Añadiendo anti-CD63 se
calcula la cantidad de basófilos activados.
34El alérgeno puede entrecruzar también FcεRI sin necesidad de que estén unidas IgE al FcεRI
previamente. La señal obtenida es más pequeña.
119
120
Tema 19
19. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN TRASPLANTES
19.1. TIPOS DE TRASPLANTES
Un trasplante es un procedimiento clínico que consiste en reemplazar células, tejidos u
órganos de un individuo receptor por el de un donante. Según el donante podemos
clasificar los trasplantes en:
 Autotrasplante: el donante es el receptor. Pueden hacerse con piel, médula

ósea y sangre. El injerto es aceptado sin tratamiento.
 Isotrasplante: el donante y el receptor son gemelos univitelinos. Se realiza, por
ejemplo, en médula ósea. Al igual que en caso anterior, el injerto es aceptado
sin tratamiento.
 Alotrasplante: el donante y el receptor son individuos de la misma especie. Se
realiza con todo tipo de tejidos, órganos y células, como por ejemplo huesos,
médula ósea, sangre, corazón, riñón, hígado, córnea, páncreas, pulmón. En este
caso es necesaria el tratamiento inmunosupresor para evitar el rechazo. En
ausencia de tratamiento pueden ocurrir cuatro cosas:
o Aceptado: sitio inmunoprivilegiados: en ellos es posible realizar un
Alotrasplante sin rechazo. Un sitio inmunoprivilegiado es la córnea, por
ejemplo.
o Rechazado en horas: por anticuerpos preformados.
o Rechazado en semanas: por activación de linfocitos T.
o Rechazado en meses: por activación de linfocitos T.
 Xenotrasplante: el donante y el receptor son de diferente especie. Puede
usarse en trasplante de corazón de cerdo a hombre. Sin medicación
inmunosupresora es rechazado en minutos por anticuerpos naturales y
complemento (diferentes especies).
121
Debido a que el riesgo de rechazo es elevado, hay que realizar pruebas inmunológicas.
19.2. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN TRASPLANTES

19.2.1. SELECCIÓN DE DONANTES Y RECEPTORES
Para realizar un trasplante se debe comprobar:
1. El sistema de grupos sanguíneos del donante y del receptor.

2. Los antígenos de histocompatibilidad del donante y del receptor.
3. Presencia de anticuerpos citotóxicos del receptor dirigidos contra el donante:
anti-donante.
4. Serología para patógenos (Citomegalovirus, Hepatitis B, C, VIH, etc.).
19.2.2. TIPADO HLA

Todas las células tienen en su superficie una serie de proteínas denominados antígenos
leucocitarios humanos (HLA) que las diferencian de las células de otro organismo.
Para reconocer que tipo de HLA tiene un paciente, se deben realizar diferentes pruebas:
 Moléculas de clase I (HLA-A, HLA-B, HLA-C):

o Antes se realizaba el test de microcitotoxicidad donde en una placa de
Terasaki que contiene en cada pocillo una alícuota de anticuerpos
monoclonales anti-HLA (cada tipo) de clase I además de complemento y
colorante vital, eosina, que permite ver el daño tisular. A cada pocillo se
le añade suero del donante con linfocitos. Si el HLA es positivo para ese
anticuerpo monoclonal, se producirá rotura del linfocito, coloreándose la
eosina y dando un resultado en rojo. Si la prueba da negativo, el resultado
será azul.
o Hoy en día se realiza por técnicas de PCR.
 Moléculas de clase II (HLA-DR, HLA-DQ):
o Test de microcitotoxicidad (linfocitos B del donante + batería de sueros
anti-HLA de clase II + complemento + colorante vital), exactamente igual
al anterior.
o Cultivo mixto de linfocitos (CML). Sólo inter vivos. La proliferación
celular (una vía o dos vías) se hace añadiendo 3H-Timidina. Cultivo de
las células linfomonocitarias de un individuo con las de otro
genéticamente distinto. Usualmente se practica el cultivo unidireccional,
en el que las células del donante son tratadas con mitomicina o
irradiación para impedir su proliferación, actuando solo como células
122
estimuladoras de la respuesta proliferativa de los linfocitos T del otro

individuo, que se determina por medio de la cuantificación de la captación
de timidina tritiada.
o Biología molecular: PCR (actual).
19.2.3. PRUEBAS CRUZADAS

Las pruebas cruzadas se realizan para saber si el receptor tiene anticuerpos anti-
donante. Los anticuerpos anti-donante se pueden generar por:
 Trasplantes previos con alguna disparidad HLA con el donante.

 Pacientes que han recibido transfusiones.
 Mujeres que han tenido hijos (se generan anticuerpos en la madre que
reaccionan con el injerto).
Se pueden usar diferentes métodos para realizar las pruebas cruzadas:
123
 Microcitotoxicidad (linfocitos totales del donante + suero del receptor +

complemento + colorante vital). Si hay en el suero del receptor anticuerpos anti-
donante, se generará reacción que será visible.
 ELISA indirecto: se detectan todos los anticuerpos anti-HLA, tanto fijadores del
complemento como no fijadores. Se realiza un ELISA con pocillos con antígenos
HLA, como molécula de reconocimiento primaria se usa el suero del receptor y
como posteriormente una molécula de reconocimiento marcada. En el lugar que
obtengamos respuesta, habrá interacción entre ese HLA y el suero del receptor.
 Detección de anticuerpos por citometría de flujo: se pegan un conjunto de
moléculas HLA de 1 individuo a bolas de látex con colores distintos. Al incubar
estas bolas de látex con el suero del receptor habrá reacción entre anticuerpos
del receptor y la bola de látex con el HLA reconocido por esos anticuerpos. Ahora
se añade una segunda molécula de reconocimiento que se una al primer
anticuerpo (anti-humano) marcado con fluoresceína, de tal manera que al hacer
citometría de flujo el aparato reconozca el color de la bola de látex y si lleva o no
fluoresceína. Por lo que sabremos para que HLA tiene anticuerpos preformados.
124
Tema 20
20. ENFERMEDADES AUTOINMUNES
20.1. AUTOINMUNIDAD
La autoinmunidad es una respuesta inmunitaria adaptativa específica frente a un
antígeno propio (autoantígeno). Están provocadas por linfocitos T y B. Ocurren por
fallos en los mecanismos de mantenimiento de autotolerancia:
 Fallos en la eliminación clonal: órganos linfoides centrales. Fallos en

apoptosis, quedando linfocitos autorreactivos.
 Rotura de la anergia clonal35: los superantígenos unen el HLA de tipo II con el
TCR de linfocitos T, provocando respuesta equivocada.
 Regulación defectuosa de la respuesta inmunitaria: defectos en las células
supresoras, regulación idiotípica36, etc.
 Alteraciones en la presentación antigénica: creación de neoantígenos por
virus o fármacos, mimetismo molecular, exposición a autoantígenos ocultos.
Antígenos que no lo eran los van a mimetizar. Por ejemplo, una infección vírica
provoca la síntesis de anticuerpos frente a su antígeno X. El paciente tiene en la
superficie de un tejido antígeno Y, con una secuencia aminoacídica muy
semejante a la del antígeno X. Aparece una respuesta autoinmune frente al
antígeno Y (autoantígeno) por semejanza con el antígeno externo X.
20.2. CARACTERÍSTICAS DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por:
 Afectan alrededor del 5% de la población.

 Presencia de anticuerpos frente a antígenos comunes o específicos de tejido.
 Infiltración tisular, por células mononucleares, en los tejidos afectados.
 Asociación con determinados HLA.
 Agregación familiar.
 Asociación de varias enfermedades autoinmunes en el mismo sujeto.
 Carácter crónico, pero remitente e intermitente.
 Predominio en el sexo femenino y en la edad media de la vida.
 Manifestaciones clínicas propias del órgano afectado (generalmente
hipofunción) o manifestaciones sistémicas (riñón, articulaciones, pulmón, piel y
serosas).
35 Es la inactivación funcional prolongada o irreversible de los linfocitos. Es inducida por el

encuentro con antígenos en ciertas condiciones.
36 El idiotipo le confiere al anticuerpo su especificidad antigénica. Fallos en el idiotipo pueden
provocar que se reconozcan autoantígenos.
125
20.3. ENFERMEDADES AUTOINMUNES

20.3.1. ENFERMEDADES AUTOINMUNES SISTÉMICAS
Se caracterizan por presentarse anticuerpos anti-nucleares. Si en un paciente no hay
anticuerpos antinucleares podemos descartar casi al 100% las enfermedades
autoinmunes sistémicas. Tipos de anticuerpos anti-nucleares:
 Núcleo:
o Nucleosoma:
 Anti ADN.
 Antihistona.
 Anticentrómero.
o Nucléolo:
 Anti-PM/Scl.
 Anti-P ribosomal.
o Nucleoplasma:
 Anti-Scl 70.
 Anti-Sm. Anti-ENA: anticuerpos anti-antígenos
 Anti-U1RNP. nucleares extraíbles (solubles). Si se
 Anti-La/SS-B machaca la muestra quedan en el
 Anti-Ro/SS-A sobrenadante. Incluyen también los
 Citoplasma: anticentrómeros.
o Anti-Jo1.
o Anti-SRP.
En la preparación se deben tener células en interfase y en fase mitótica para ver las
diferentes estructuras: en interfase tenemos citoplasma, carioplasma, cromatina,
nucléolos y envuelta nuclear; durante la fase mitótica tenemos cromosomas,
carioplasma y citoplasma, pero no envuelta nuclear ni nucléolo.
20.3.2. ENFERMEDADES AUTOINMUNES ÓRGANO-ESPECÍFICAS

Son enfermedades en las que la afectación es de un órgano o sistema. Se suelen
producir acumulaciones de inmunoglobulinas en ese tejido (imágenes inferiores) que se
pueden ver por técnicas histológicas. Los síntomas suelen derivar de una hipofunción
del órgano afectado.
A la izquierda, un depósito de IgG entre las células del epitelio de la piel en un paciente
con pénfigo, con forma de panal de abejas. A la derecha, deposito lineal en un paciente
con penfigoide ampolloso. Puede observarse una línea más fluorescente que atraviesa
la biopsia.
126
20.4. CRITERIO DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

AUTOINMUNES. ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS
Cuando se sospecha de una enfermedad autoinmune, hay que comenzar por saber si
es sistémica, vasculitis o enfermedad autoinmune órgano-específica. Para ello se
utilizan algoritmos diagnósticos:
(1) Si se sospecha de EA sistémica se usa inmunofluorescencia indirecta. Se usan como

diana Hep-2 (célula tumoral epidermoide humana). Si colocamos estas células con el
suero del paciente y luego anti-IgG humana o proteína A marcada con fluoresceína
veremos resultados: si no hay tinción, se descarga la EA sistémica. Si da positiva, se
determina el patrón de fluorescencia y el título de anticuerpos (un título bajo puede
producirse de manera inespecífica). Dependiendo del patrón se determina el tipo de EA
sistémica. Aclaración: CREST es una variante de esclerodermia. Patrones nucleolares,
moteados y nuclear periférico/homogéneo son típicos de LES.
(2) Si se sospecha de vasculitis haremos prueba de detección de anticuerpos frente

antígenos de neutrófilos citoplasmáticos (ANCAs).
(3) Si se sospecha de EA órgano-específica la técnica es diferente dependiendo del

órgano.
127
20.5. CLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES

ÓRGANO-ESPECÍFICAS
Sistema endocrino Aparato genitourinario
Tiroiditis de Hashimoto Síndrome de Goodpasture
Enfermedad de Graves Ooforitis autoinmune
Enfermedad de Addison Aparato digestivo
Diabetes tipo I Enfermedad celíaca
Sistema hematopoyético Anemia perniciosa y gastritis autoinmune
Anemia hemolítica autoinmune (AHAI) Colitis ulcerosa
Púrpura trombocitopénica autoinmune Enfermedad de Crohn
Sistema neuromuscular Hígado
Miastenia gravis Hepatitis autoinmune
Esclerosis múltiple Cirrosis billiar primaria
SISTÉMICAS
Dermatomiositis Lupus discoide
Esclerodermia/CREST Síndrome de Sjögren
Enfermedad mixta del tejido conectivo Síndrome antifosfolípido (vasculitis)
LES Artritis reumatoide
128

Análisis Inmunológico y Hematológico

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CURSO 2015-2016

Tema 2. Control de calidad y expresión de los resultados en hematología. Concepto de

Tema 3. Recuento celular sanguíneo. Recuento mediante cámara cuenta glóbulos.

Tema 4. Hemograma. Índices hemáticos. Síntomas clínicos de la anemia. Tipos de anemia.

Tema 5. Recuento diferencial de leucocitos. Aspectos generales en el diagnóstico de las

Tema 6. Métodos diagnósticos de trastornos hemorrágicos. Exploración analítica de la

Tema 7. Terapia anticoagulante, antiplaquetaria y trombolítica. Control de laboratorio de la

Tema 8. Inmunohematología. Grupos sanguíneos: Sistema ABO y Sistema Rh.

Tema 10. Moléculas de reconocimiento inmunológicas. Anticuerpos policlonales.

Tema 11. Validación de los inmunoensayos. Afinidad y avidez. Sensibilidad, especificidad y

Tema 13. Inmunoensayos que emplean partículas trazadoras coloreadas. Inmunoensayos

Tema 15. Otros inmunoensayos heterogéneos. Inmunodot (dot-blot). Fundamento.

Tema 16. Inmunoensayos automatizados: Sistemas homogéneos. Concepto. Tipos.

Tema 17. Inmunoensayos sobre células o tejidos. Inmunofluorescencia. Fundamento. Tipos.

Tema 18. Pruebas inmunológicas en alergia. Concepto de alergia. Reacciones de

Tema 19. Pruebas inmunológicas en trasplantes. Tipos de trasplantes. Procedimientos para

Tema 20. Pruebas inmunológicas en autoinmunidad. Concepto de autoinmunidad.

1. Métodos de extracción de sangre.

1.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE SANGRE

 Plasma sanguíneo: formado mayoritariamente por agua, en la que hay

En la práctica, al centrifugar, se obtiene también precipitado

Generalmente la sangre se extrae con un anticoagulante

 Plasma: sangre completa excepto células.

El dejar o no coagular la sangre dependerá del análisis que

 Pruebas químicas/bioquímicas: suero o plasma

 Determinar el grupo sanguíneo.

Hay que tener en cuenta que no sólo va a salir sangre capilar,

Lo más frecuente es obtener sangre venosa de la fosa

La razón de usar venas es que al poner el compresor se dificulta

1.2. ANTICOAGULANTES DE RECOLECCIÓN (ADITIVOS)

V.H.S: Velocidad de sedimentación, se usa citrato (anticoagulante) en proporciones 1:4.

2 Ácido cítrico citrato dextrosa.

c) Gel separador: se sitúa entre la capa líquida y sólida para facilitar su

1.2.1. ORDEN DE EXTRACCIÓN DE LOS TUBOS

1. Frascos para hemocultivos.

1.2.2. NORMAS BÁSICAS EN LA EXTRACCIÓN

Los tubos que no contengan anticoagulante no moverlos, para evitar la hemólisis.

1.3. FRACCIONAMIENTO DE LA SANGRE

Como vemos, por ejemplo, para

1.5. APLICACIONES A LOS BANCOS DE SANGRE

En la donación se puede realizar este fraccionamiento directamente, realizando una

El fraccionamiento post-donación se realiza siguiendo el siguiente esquema:

 Exactitud: similitud entre el valor obtenido y el real.

2.1. CONTROL DE CALIDAD EN LAS DISTINTAS FASES DE ANÁLISIS

Para mantener una garantía de calidad se deben ajustar:

 Condiciones del paciente: hora, posición, alimentación, fármacos, ejercicio físico,

2.1.2. FASE ANALÍTICA

 Reactivos (incluyendo agua):

Por ejemplo, si un resultado nos

Para preservar la garantía de calidad en la fase analítica se debe mantener:

 Equipos en buen estado de mantenimiento.

2.1.3. FASE POST-ANALÍTICA

 Validación de los resultados.

2.2. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

2.2.1. VALORES HEMATOLÓGICOS DE REFERENCIA

 Grupo poblacional: recién nacidos, niños, jóvenes adultos, adultos, ancianos.

Se pueden obtener también valores de referencia para determinadas patologías, que

Hay unos criterios de exclusión para elaborar una población de referencia:

El hematocrito va a depender de la cantidad de hematíes y del volumen corpuscular

3.2. RECUENTO CELULAR

3.2.1. RECUENTO MANUAL

Cuando se tiene preparada la dilución se coloca la muestra en una cámara de recuento,

3.2.2. RECUENTO AUTOMÁTICO

3.2.2.1. IMPEDANCIA O RESISTENCIA ELÉCTRICA