La Señalización de Protección del receptor de metabotrópicos de glutamato 1 está mediada por la

sostenida, de β-Arrestin-1-dependiente de la fosforilación ERK

Receptores metabotrópicos de glutamato 1 (mGlu1) es un receptor acoplado de proteína G que mejora la hidrólisis de fosfoinosítidos
de la membrana. Además de su papel en la transmisión sináptica y la plasticidad, mGlu1 ha demostrado estar involucrados en neuro-
protección y la neurodegeneración. En esta capacidad, que han informado anteriormente de que en las células neuronales,
exposiciones de mGlu1 a las propiedades de un receptor de la dependencia, apoptosis induciendo en la ausencia de glutamato,
mientras que promueve la supervivencia neuronal en su presencia (Pshenichkin, S., Dolin'ska, M., Klauzin'ska, M., Luchenko, V.,
Grajkowska, E., y Wroblewski, JT (2008) La neuro-farmacología 55, 500-508). Aquí, el uso de los receptores de células CHO que expresan
un mGlu1, nos muestran que el efecto protector de glutamato no se basa en la transducción de señales clásicas de mGlu1. En su lugar,
la señalización protectora de la mGlu1 está mediada por una nueva, T proteína-independiente, vía que implica la activación de la vía
MAPK y la fosforilación sostenido de ERK, que es distinta de la proteína G-mediada por fosforilación transitoria de ERK. Además, la
fosforilación sostenido de la señalización protectora de ERK y a través de receptores mGlu1 requiere de la expresión de β-arrestina-1,
lo que sugiere un posible papel de la internalización de los receptores en este proceso. Nuestros datos revelan la existencia de una
novela, la vía de señalización no canónica asociada con los receptores del glutamato de mGlu1, que media inducida de protección
señalización.

Los receptores metabotrópicos de glutamato (mGlu) 3 son una familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) que han sido
catalogadas en tres grupos basados en homología de secuencia y la farmacología (2, 3). Las características estructurales de estos
receptores incluyen un gran dominio extracelular que contiene un sitio agonista de unión (4), siete transmembrana que abarcan
dominios, y una longitud variable intracelular dominio C-terminal. El segundo bucle intracelular y porciones de la terminal C son
responsables de la unión de las proteínas T y por lo tanto, para el acoplamiento de los receptores de mGlu los diferentes sistemas de
segundos mensajeros (5, 6). Grupo I los receptores de mGlu estimulan la fosfolipasa C (PLC) a través de acoplamiento a Gq/11 (7, 8),
que da lugar a la hidrólisis de membrana de fosfoinosítidos (PI), seguido por Ca2+ aumento liberar desde los depósitos intracelulares.
Además, la estimulación agonista de grupo Yo de receptores mGlu más recientemente se ha demostrado que causa una fosforilación
transitoria de la señal extracelular de la quinasa regulada (ERK) (9, 10).

Varios estudios indican que la activación del grupo I de receptores mGlu promueve la muerte neuronal. Estos resultados han sido
demostrado en un modelo in vivo de lesión traumática de cerebro de rata y en un modelo in vitro de la lesión traumática de las
neuronas corticales de rata (11). Los efectos tóxicos de los receptores del grupo I mGlu parecen ser mediada a través de mecanismos,
incluyendo la activación de la proteína quinasa C (12) y la potenciación de NMDA y AMPA corrientes (13-16). Por el contrario, otros
estudios indican que en la presencia de glutamato, mGlu1 induce señalización que facilita crecimiento y desarrollo en oposición a la
neurotoxicidad. Cuando se estimula con glutamato, se ha demostrado que mGlu1estimula la migración axonal en el SNC en desarrollo
(17) y el crecimiento de las espinas dendríticas en el hipocampo en desarrollo (18). Hemos descrito recientemente que mGlu1 produce
dos neuroprotectores y la señalización neurotóxica en cerebelo y la corteza neuronal (1). Así, mGlu1 exhibe las propiedades de un
receptor dependencia (19, 20), induciendo apoptosis en ausencia de glutamato, mientras que promueve la supervivencia neuronal en
su presencia. Sin embargo, los mecanismos de esta señalización son neuroprotectores desconocidos.

Al igual que otros receptores acoplados a proteínas G, mGlu1 se internaliza tanto constitutivamente y en respuesta a la estimulación
agonista (21). En presencia de agonistas, mGlu1 sufre una rápida homóloga desensibilización y puede ser internalizado en una forma
dependiente de β-arrestina (21, 22). En el proceso medido de β-Arrestin- endocitosis, mGlu1 puede ser fosforilada por varias quinasas
de receptores acoplados a proteínas G (23). La asociación de receptores con β-arrestina también se ha demostrado que induce la
fosforilación medida por el receptor transitorio de ERK (23). Las funciones de ERK en las aguas abajo de la vía MAPK MEK 1/2 y la
fosforilación de ERK es un paso crítico en la transducción de señales desde la membrana hasta el núcleo y-USU aliado provoca
respuestas celulares protectores o mitogénica (24). Aunque una transducción de vía de señal relativa recientemente descrito,
numerosos GPCRs han demostrado acoplamiento de la fosforilación de ERK de una manera dependiente de β-Arrestin (25). Sin
embargo, ERK puede ser activado por tanto β-Arrestin-dependiente y Vías de señalización dependiente de Gq/11(26). En varios
sistemas, incluyendo PAC1 y receptores VPAC, estas vías paralelas se han descrito en la fosforilación de ERK debido a proteína a la
activación transitorio de G, mientras que la fosforilación de ERK se mantiene con el tiempo cuando está obligado a β-Arrestin (27).

El objetivo de este estudio fue determinar la transducción de señales vía por la que el glutamato provoca la señalización de protección
en células que expresan los receptores de mGlu1. Hemos determinado que el glutamato, pero no quisqualato, estimula una
fosforilación sostenida de ERK a través de receptores mGlu1. Este fenómeno era único para mGlu1 y requiere la expresión de β-
arrestina-1. Además, la inhibición de la fosforilación de ERK y silenciamiento de β-arrestina-1 de expresión abolió la protección de los
efectos de glutamato. Llegamos a la conclusión de que la señalización de protección de los receptores de mGlu1 no se basa en la
clásica, proteína inmediata G, como mecanismo de transducción de señales, pero, en lugar implica una internalización del receptores β-
Arrestin- dependiente y fosforilación de ERK.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Materiales-DMEM y suero fetal bovino para los cultivos celulares fueron adquiridos de Invitrogen. Los agonistas de receptores de
glutamato y quisqualato, CPCCOEt antagonistas, YM 298198, y JNJ16259685, y los inhibidores de U73122, U0126, PD98059, y dynasore
se obtuvieron a partir Tocris Cookson (Ellisville, MO). Todos los otros productos químicos se adquirieron de Sigma. Las culturas de
células CHO células fueron transfectadas establemente con mGlu ADN del receptor en pcDNA-3.1 vector (Invitrogen), utilizando
Effectene reactivo de transfección (Qiagen, Hilden, Alemania). Celda individual líneas se aislaron y cultivaron en DMEM suplementado
con 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM, y 0,8 mg / ml de G-418 para la selección (Invitrogen). Para los ensayos de viabilidad,
células confluentes Se trataron en medios que no contienen suero o L-glutamina.

El tratamiento de células con el β-arrestina-1 shRNA-SureSilencing shRNA dirigido contra la rataβ-arrestina-1 (secuencia de inserción,
ATGGAGGAAGC-TGATGATACT) y revueltos de control estaban contenidas en el vector pGeneClip higromicina (SABiosciences, Frederick,
MD). Las células CHO que expresan establemente mGlu1 fueron transfectadas con el plásmido basado ARNhc y seleccionado en 0,8
mg / ml de higromicina Derribo B.β-arrestina-1 fue confirmada por Western Blot. Refractaria a los efectos de ARNhc dirigida contra la
rataβ-arrestina-1, humanaβ-arrestina-1, que Se sub-clonó en pcDNA 6,2, se utilizó en los experimentos de rescate.

Western blots de las células de cultivo y tratamiento en 35 mm platos Se recogieron en 25 mM de tampón Tris-HCl, pH 7,5, que
contiene Detener la proteasa y el inhibidor de fosfatasa cócteles con 1 mM EDTA (Pierce). Las proteínas se solubilizaron en tampón de
Laemmli que contiene ditiotreitol 50 mM, y la misma cantidad de la muestra de proteína se resolvieron en geles de poliacrilamida al 8%
(Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P PVDF (Millipore, Billerica, MA) y se probaron con anticuerpos
contra la mGlu1 (BD Biosciences), β-arrestina 1-(Abcam, Inc., Cambridge, MA), phospho-p44/42 MAPK (ERK1 / 2) (Thr202 / Tyr204), y el
total de MAPK p44/42 (ERK1 / 2) (Señalización Celular Tecnología, Danvers, MA). Las proteínas se visualizaron por incubación con la
cabra anti-conejo anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante (Pierce), seguido por la exposición a quimio
luminiscente HRP sustrato SuperSignal West Femto (Pierce). Las películas se cuantificaron por densitometría utilizando el software
Image J (Rasband, Image J).

La internalización de los ensayos del receptor-receptor de endocitosis fue ensayada como se ha descrito anteriormente (28). Las células
cultivadas en 35-mm platos se lavaron en PBS y etiquetados durante 30 minutos con escindible Sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce). Durante
20 minutos, el exceso de biotina se inactivó con 100 mM de glicina. Las células marcadas fueron entonces incubadas durante 30 min en
la ausencia o presencia de glutamato en 37 ° C. La estimulación se detuvo por lavado y refrigeración de las células en PBS frío. Biotina
extracelular se escindió luego por dos lavados con 50 mM de glutatión, 75 mM de NaCl, 5 mM de NaOH, y 10% FBS en agua durante 15
min. El exceso de glutatión se inactivó durante 30 minutos en PBS que contenía 50 mM de yodoacetamida y 1% BSA. Las células fueron
lisadas entonces en el ensayo de precipitación radioinmune tampón (0,5% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 120 mM NaCl, 25 mM
KCl, y mezclas de los inhibidores de la proteasa Halt) y aclaró, y la igualdad de las proteínas se precipitaron con biotina Neutravidin-
agarosa (Pierce). Las proteínas se enjuagaron cuatro veces con tampón de ensayo radioinmune precipitación, solubilizado en Tampón
de Laemmli, y se resolvieron por SDS-PAGE.

Medición de la fosforilación de ERK se midió utilizando basado en células ELISA de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente
(29). Las células se cultivaron y se trató con agonistas en placas de 96 pocillos. Después de la incubación con agonista, Las células fueron
fijadas en formaldehído al 4% / PBS durante 20 min a habitación temperatura. Después de tres lavados en 0,1% de Triton X-100 en PBS
(PBST) para permeabilización de la membrana, la peroxidasa endógena actividad se inactivó mediante una incubación de 20 minutos en
PBS que contenía 0,5% de H2O2 y 0,2% de NaN3. Después de más de tres lavados en PBST, las células se bloquearon con BSA al 2%
durante 1 h, y se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario contra phospho-p44/42 MAPK (ERK1 / 2) (Thr202/Tyr204)
(Señalización Cell Technology). Las células se lavaron a continuación durante 5 minutos tres veces con PBST y dos veces en PBS. Un HRP-
acoplado de cabra anti-conejo anticuerpo secundario (Pierce) se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y, a continuación Las
células se lavaron de nuevo cinco veces. Las células fueron expuestas a la colorimétrico HRP sustrato de un solo paso de ultra TMB
(Pierce). Después de 10 min de desarrollo, se detuvo la reacción en 4 M H2SO4, y la absorbencia se leyó a 450 nm.

Evaluación de la viabilidad celular, la viabilidad de las células cultivadas en 96-pocillos se midió por incubación durante 1 hora a 37°C
con 0,2 mg / ml de 3 - [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio bromuro, que fue adquirido de Invitrogen. La formación del producto
formazano, proporcional al número de células viables, se midió colorimétricamente a 570 nm después extracción con 70µ l de DMSO
(30).

Las mediciones de la PI La hidrólisis-Celulas, cultivadas en 96 pozos placas, se incubaron durante la noche con 0,625µ Ci / pocillo de
myo- [3H] inositol (PerkinElmer Life Sciences) para marcar la membrana celular fosfoinosítidos. Después de dos lavados con 0,1 ml de
Tampón de Locke (156 mM NaCl, 5,6 mM de KCl, 3,6 mM NaHCO3, 1 mM de MgCl2, 1,3 mM de CaCl2, 5,6 mM de glucosa, y Hepes 20
mM, incubaciones pH 7,4) con ligandos de los receptores se llevaron a cabo para 45 min a 37 ° C en tampón de Locke contiene
20mMLiCl para bloquear degradación fosfato de inositol. La reacción se terminó por la aspiración de los medios de comunicación y los
fosfatos de inositol se extrajeron con 60 µ l de ácido fórmico (0,1 M) durante 30 min. 40 -µ Muestras fueron l transferido a opaco de
paredes placas y se incubaron con 60 µl polilisina recubiertos con itrio centelleo perlas proximidad de ensayo (PerkinElmer Life
Sciences) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h con agitación vigorosa. Después de 8 horas de incubación con Perlas SPA,
fosfatos de inositol fueron detectados por centelleo contando.

Los cálculos y las estadísticas-Por los datos de dosis-respuesta, las curvas fueron ajustados por regresión no lineal a los puntos de datos
utilizando cuatro parámetros de ecuación logística. Pruebas de significación se realizó mediante pruebas de t de Student cuando se
comparan dos grupos o de Bonferroni corregido las pruebas de t al comparar múltiples grupos. La significación estadística se consideró
por p <0,01.

RESULTADOS

Efectos protectores de glutamato Nuestros estudios anteriores en la enseñanza primaria cultivos de neuronas corticales y del cerebelo
han mostrado que el glutamato, que actúa selectivamente sobre los receptores mGlu1, rescatado estas neuronas de la muerte celular
por apoptosis inducida por las condiciones de la privación trófica (1). Este efecto protector de glutamato se reveló en presencia de
antagonistas de glutamato ionotrópicos receptores, que suprimieron las acciones de excitotóxicos glutamato. Además, en estas células,
el efecto protector fue provocada por altas concentraciones de glutamato, ~10 veces mayor que las necesarias para activar mGlu1
mediada por hidrólisis PI.

Para estudiar las propiedades farmacológicas y de protección de mGlu1 sin la interferencia de otros receptores de glutamato, hemos
utilizado con los receptores de las células CHO mGlu1 estable expresadas a evaluar la potencia de los agonistas mGlu1 en la producción
del protector efecto. Las células se transfirieron a medio de cultivo libre de suero para inducir la apoptosis (31), y su viabilidad fue
supervisada por el 3 - [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio ensayo. Bajo estas condiciones, después de 3 días, las células
expuestas ~Viabilidad 35-50% en relación a los controles crecidos en el suero que contiene medio. Las células expuestas a glutamato
mM 3 estaban completamente protegidos de la privación de suero inducida por la apoptosis durante un máximo de 6 día, teniendo
viabilidad similar al control de las células cultivadas en serum conteniendo medios de crecimiento, mientras que concentraciones más
bajas de glutamato (0,3 mm) produce una protección parcial de la privación de suero (Fig. 1A). El efecto protector de glutamato
requiere la presencia de mGlu1 como células CHO transfectadas no eran protegida de la privación de suero (Fig. 1B). Además, entre los
receptores de PLC en mGlu sólo es acoplado en mGlu1, pero no mGlu5, fue eficaz en la protección de la toxicidad inducida por
privación de suero (Fig. 1B).

La adición de glutamato al medio de cultivo libre de suero produjo un aumento dosis-dependiente de la viabilidad con una CE50 de 153
+ 31 µM; Sin embargo, quisqualato, la mGlu1 más potenteagonista, no era eficaz en concentraciones de hasta 3 mm (Fig. 1C). Para
comprobar además que el efecto protector es, de hecho, debido a la activación de mGlu1, y no a un efecto no específicos relacionados
con los transportadores de glutamato, glutamato inducida por la protección, se ensayó en presencia de tres distinta no competitivos
mGlu1-antagonistas selectivos. Aplicación de 100 µM CPCCOEt (32), 10µ M YM-298 198 (33), o 30µ M JNJ16259685 (34)
completamente inhibió la actividad de glutamato 1 mM (Fig. 1D). El análisis más detallado mostró que YM-298198 fue inhibida por la
protección inducida del glutamato de una manera no competitiva con concentraciones crecientes del antagonista del glutamato
disminuyendo eficacia, pero no tiene efecto sobre su potencia como se muestra por similares glutamato valores EC50 en presencia de
diferentes concentraciones de antagonista (Fig. 1E y Tabla 1).

FIGURA 1. Propiedades farmacológicas de mGlu1 mediada por la protección de Células CHO. A, tiempo de evolución de la privación de
suero inducida por la toxicidad y la protección por glutamato en las células CHO que expresan receptores mGlu1. B, el efecto de un mM
de glutamato en la privación de suero toxicidad inducida por 3 días en células CHO expresando mGlu1, mGlu5a, o células CHO
transfectadas. C, la potencia de glutamato para proteger las células CHO que expresan receptores mGlu1 de toxicidad debido a
privación de suero (CE50= 154± 31µ M). D, el efecto protector de glutamato bloqueada por tres selectiva no competitiva mGlu1
antagonistas CPCCOEt (CP; 100 µM), YM-298198 (YM; 10 µM), y JNJ16259685 (JNJ; 30 µM)). E, dosis-respuesta Las curvas de glutamato
mediada por la protección en la presencia de diferentes concentraciones de YM-298198. La viabilidad celular se midió por 3 - [4,5-
dimetiltiazol- 2-il] -2,5-difeniltetrazolio después de 72 h de incubación con los agonistas en condiciones libres de suero y se expresa
como un porcentaje de las células viables en cultivos paralelos cultivada en presencia de suero. Todos los puntos de datos Se entiende a
partir de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado con barras de error representan S.E. **, P<0,001 en
comparación con los controles no tratados utilizando la prueba t de Student.

Propiedades Farmacológicas de mGlu1-El observado farmacológica propiedades de mGlu1 en la inducción de la protección efectos eran
incompatibles con las propiedades conocidas en la estimulación de la proteina G- mediada por hidrólisis PI (7). Para estudiar esta
discrepancia, hemos determinado la potencia de los agonistas para estimular la hidrólisis PI en las celulas CHO expresando un mGlu1
que se utilizaron en estos experimentos. Como se muestra en la fig. 2A, tanto glutamato y quisqualato estimulado la hidrólisis PI en una
forma dosis-dependiente con quisqualato siendo más potente (CE50= 0,63± 0,13 µ M) que el glutamato (CE50= 16± 1.2µ M). Por lo tanto,
la potencia de glutamato para inducir protección era~10 veces inferior a su potencia para estimular la hidrólisis PI.

Una posible explicación de estas diferencias sería que las potencias observadas en la protección de reflejar un artefacto disminución de
las concentraciones de agonista que ocurren durante el día 3- incubación que no aparecen en la incubación 45-min utilizado en la
medición de la hidrólisis PI. En experimentos de control agonista pruebas de estabilidad, glutamato y quisqualato se incubaron con
células CHO durante 3 días y luego utilizarse para estimular la hidrólisis de PI. Como se muestra en la fig. 2B, tanto acondicionado y
recién agonistas preparados estimulada hidrólisis PI en la misma medida, demostrar que estos compuestos permanecen intactos para
el todo el de 3 días de incubación y que las discrepancias observadas hacer no el resultado de una disminución en la concentración de
agonista.

Como era de esperar, el glutamato estimulada hidrólisis PI se suprimió por el antagonista no competitivo selectivo mGlu1 YM-298198
(33), y el antagonismo no competitivo aparecieron como se ve por la disminución del efecto máximo de glutamato con concentraciones
crecientes del antagonista (Fig. 2C). Sin embargo, en contraste con los datos obtenidos para el glutamato protectora señalización, la
potencia calculada de glutamato en PI experimentos de hidrólisis disminuye con el aumento antagonista concentraciones (Tabla 1). Por
lo general, estos cambios de agonista de la derecha potencia en presencia de un antagonista no competitivo indican la existencia de
receptores de reserva (también conocido como repuesto receptores) y se ven con frecuencia en el sistema de expresión heteróloga.
Esto nos permite concluir que la aparente diferencia en la potencia de glutamato para producir dos resultados los efectos de la
presencia de una reserva de receptor de alta para la hidrólisis PI, pero sin receptor de reserva para la señalización de protección. El uso
de los más altos concentración de YM-298 198 en experimentos de hidrólisis PI aumenta la CE50 de glutamato a los niveles observados
en la protección experimentos. Por lo tanto, una vez que esta reserva del receptor se suprime por el uso de un antagonista no
competitivo, la potencia de glutamato para producir ambos efectos es el mismo. Aunque nuestros resultados farmacológicos confirman
que la protección señalización y la hidrólisis PI están mediadas por la misma del receptor, sino que también indican la existencia de un
sesgo en la producción de ligando los dos efectos. Ligando sesgo se define como la capacidad de los algunos agonistas, como el
quiscualato, para activar sólo se seleccionan mecanismos de transducción de señales, mientras que otros agonistas, como glutamato,
puede activar todas las señales asociado con este receptor (25). Nuestros datos también sugieren que el efecto protector mediada por
receptores mGlu1 no está relacionado con su capacidad para estimular la hidrólisis PI sino, más bien, está mediada por una diferente
mecanismo de transducción de señal.

TABLA 1

Comparación de la potencia y la eficacia de glutamato para inducir protección y estimular la hidrólisis PI en ausencia y presencia del
antagonista no competitivo YM-289198 en células receptoras de CHO expresadas en una mGlu1. La potencia (CE 50) se refiere a la
concentración de glutamato producido en un efecto medio-máximo. La eficacia (E max) representa en el efecto máximo de glutamato
expresado como un por ciento de viabilidad celular en el control de la presencia de suero para los experimentos de toxicidad y como un
porcentaje de la actividad basal para las mediciones de hidrólisis PI. Los datos son los medio s± S.E. calculado a partir de curvas de las
dosis-respuesta obtenidas en tres a seis experimentos.

FIGURA 2. Las propiedades farmacológicas de la transducción de señales mediada por mGlu1 en las células CHO que expresan
receptores mGlu1. Una hidrólisis, PI se activa de una manera dosis-dependiente por el glutamato (Glu, CE 50 =11 ± 1,2 µM) y quisquilato
(Quis; CE50 =0,63 ± 0,13 µM). B, la estimulación de la hidrólisis PI por agonistas frescas y agonistas acondicionados en la presencia de
células CHO para 3 días. CE50 para agonistas frescas y acondicionado fue el siguiente: glutamato (19± 3.2µ M y 12± 2.6µ M) y
quiscualato (0,23± 0,11µ M y 0,24± 0,13µ M). C, curvas dosis-respuesta de glutamato inducida por hidrólisis PI en la presencia de
concentraciones variables de mGlu1-antagonista selectivo no competitivo YM-298198. Con concentraciones crecientes de YM, de la
CE50 para el glutamato aumenta (ver Tabla 1), lo que indica la presencia de receptores de reserva. Todos los datos puntos son medios de
al menos tres experimentos independientes realizados en por triplicado, se representan con barras de error S.E.

Transducción de señales a través de la señalización de protección mGlu1- Para identificar el mecanismo por el cual mGlu1 provoca
protectora de señalización, se utilizó un inhibidor selectivo de la señalización, que se produce aguas abajo de la activación de la
proteína G. Porque mGlu1 por lo general las parejas a través de PLC Gq/11 (7, 8), transfectadas Las células CHO fueron tratados con el
inhibidor de PLC U73122 (35). En condiciones de privación de suero durante 3 días, U73122 (30 µ M) falló para bloquear el efecto
protector de glutamato (fig. 3A). En experimentos de control, de 30 µ M cultura acondicionado U73122 bloqueado inducida por el
glutamato hidrólisis PI (Fig. 3B), lo que indica que este compuesto es estable en estas condiciones de cultivo y es eficaz en el bloqueo de
hidrólisis PI en este modelo. Estos datos, por lo tanto, indican que el efecto protector no es mediado por el acoplamiento de los
receptores mGlu1 a PLC.
Debido mGlu1 también se ha informado para activar el MAP cinasa (23, 36), se determinó la participación de esta vía en el efecto
protector de glutamato. En efecto, tratamiento de mGlu1-que expresan las células CHO con inhibidor de MEK1 PD98059 (37) o con el
inhibidor de MEK 1/2 U0126 (38) abolió la eficacia de la señalización del glutamato para causar protección (Fig. 3A). Además, dynasore,
un inhibidor de dinamin, un proteínas en la vía para endocitótica mGlu1 (21, 39), también abolió la protección inducida por el
glutamato. En experimentos de control, vigilar el tráfico del receptor, dynasore (100µM) bloqueado inducida por glutamato
internalización de los receptores mGlu1 (Fig. 3, C y d). Estos datos sugieren que el efecto protector del glutamato no está mediado por
la proteína G clásica de mecanismo, pero en su lugar, esta una proteína G-independiente de la activación MAPK, lo más probable es que
implica la internalización del receptor y la fosforilación de ERK.

Lapso de tiempo y Farmacología de ERK mediada por fosforilación mGlu1- Informes previos han demostrado que el la estimulación de
los receptores del grupo I mGlu causa transitoria ERK fosforilación que se produce debido a la activación de proteínas G y disminuye en
30 minutos de aplicación agonista (10). Como se muestra por Western blot (Fig. 4, A y B), en células CHO que expresan mGlu1, el
glutamato y quisqualato aumenta la fosforilación de ERK en 5 min después de la aplicación agonista. Además, cuando los agonistas
fueron añadió durante las 24 h, el glutamato, pero no quisqualato, produjo una fosforilación sostenida de ERK. Como se muestra en la
fig. 4A, ambas isoformas de ERK fueron igualmente fosforilada.

FIGURA 3. La señalización de protección a través de mGlu1 es independiente de la hidrolisis de PI, sino que requiere la fosforilación de
ERK. A, las células CHO que expresan mGlu1 fueron sometidos a la privación de suero durante 72 h en presencia de glutamato y los
inhibidores de U73122 (30µ M), PD98059 (10µ M), U0126 (10µ M), o dynasore (100µ M). El inhibidor de la fosfolipasa C U73122 no
para bloquear la protección por el glutamato, mientras que la protección está bloqueada por inhibidores de MEK1 PD98059, MEK 1/2
inhibidor U0126, y el inhibidor de la dinamin, dynasore. B, la inhibición de glutamato inducida por hidrólisis PI en mGlu1-expresión de
células CHO por U73122 (30µ M) que está recién preparado (U73) o preacondicionado (U73-C) por la exposición a las células CHO
durante 3 días. C, la inhibición de glutamato inducida por la internalización de los mGlu1 receptores de dynasore (100µ M). Las células
fueron marcadas con escindible biotina y se estimularon con glutamato durante 1 h. Biotina extracelular fue eliminado e internalizado
los receptores mGlu1 fueron derribadas en neutravidin. P, pellet (interiorizado durante la incubación); S, el sobrenadante (que queda
receptores); Con el control. D, la cuantificación de Western blot de la figura. 2C. Valores Se entiende a partir de al menos tres
experimentos independientes realizados por triplicado con barras de error representan S.E. **, P< 0,001 en comparación con serum
careció de controles mediante Bonferroni ajustado de la prueba de la t.

FIGURA 4. Efecto de mGlu1 agonistas sobre la fosforilación de ERK en células CHO. Una mancha, representante occidental de
fosforilado ERK (Perk) y ERK total de (ERK) en 5 min y 24 h después de la aplicación de glutamato o quisqualato. B, la cuantificación de
Western blot de A, expresado como la relación de medida intensidades de la suma de las bandas de PERK dividido por total ERK. ELISA
basado en la cuantificación fosforilación de ERK en células CHO que expresan mGlu1 (C) o mGlu5a (D) tratados con agonistas de
receptores de 5 min, 30 min, y 24 h. Agonista perfiles de fosforilación de ERK en células CHO que expresan receptores mGlu1 después
de 5 minutos (E) y h 24 (F) de tratamiento. Glu, glutamato; Quis, quisqualato; YM, YM-298 198 (10µ M). Todos los valores son medias
de al menos tres experimentos realizó por triplicado con barras de error representan SE y se expresan como el porcentaje de la
fosforilación de ERK midió en células no tratadas con agonistas. *, P < 0,01 y **, p< 0,001 en comparación con los controles no tratados
utilizando Bonferroni ajustado prueba de la t.

Estos efectos fueron cuantificados adicionalmente utilizando un ELISA basado ensayo para comparar los niveles de fosforilación de ERK
en células CHO células que expresan receptores o mGlu1 mGlu5a. En las células expresando mGlu5a, tanto glutamato y quisqualato
provocó una fosforilación de ERK transitoria, que fue elevado a los 5 minutos después de la adición de los agonistas y disminuyó
después de 30 min (fig. 4D). Sin embargo, en las células que expresan mGlu1, mientras que ambos agonistas indujo un aumento
transitorio en la fosforilación de ERK, después de la Además de glutamato ERK fosforilación se elevó hasta 24 h (Fig. 4C). Una mirada
más cercana a la farmacología de la fosforilación de ERK reveló que el transitorio, 5-min fosforilación fue inducida por glutamato y
tanto quisqualato (Fig. 4E), con un perfil farmacológico y potencias similares a los agonistas observado para la hidrólisis PI (Fig. 2A).
Además, como la hidrólisis PI, agonista inducida por la fosforilación de ERK fue abolida por la mGlu1 selectivo YM-298198 antagonista
no competitivo (fig. 4E). En contraste, la sostenida 24-h ERK fosforilación fue sólo inducida por glutamato, pero no por quisqualato, y
fue bloqueado por YM-298 198 (Fig. 4F). Las potencias agonistas observados fueron inferiores a los de la hidrólisis PI y ERK transitorios
fosforilación, pero acercadas potencias agonistas observado para la señalización de protección a través de mGlu1 (Fig. 1C).

En conjunto, estos datos indican que transitoria (5 min) ERK fosforilación se activa por tanto mGlu1 y mGlu5a receptores y tiene un
perfil farmacológico similar a la activación de hidrólisis PI, por lo tanto, está mediada por una proteína G-mediada mecanismo. En
contraste, la fosforilación de ERK sostenido, una duración de hasta 24 horas, sólo se activa por mGlu1, y sólo glutamato es capaz de
producir protectores de señalización mGlu1. Estos resultados apoyan aún más la existencia de un sesgo de ligando, que se extiende a
ERK fosforilación y revela la existencia de dos mecanismos diferentes de transducción de señales. La clásica mecanismo, activado por
tanto glutamato y quisqualato, mGlu1 agonistas con una alta potencia aparente, implica un G proteína mediada por hidrólisis PI y la
fosforilación de ERK transitoria. El segundo mecanismo, que se correlaciona bien con protector mGlu1 de señalización, se activa con
una aparente menor potencia por el glutamato y está mediada por una proteína G-independiente mecanismo, que conduce a la
activación prolongada de MAPK por vía de la fosforilación de ERK y sostenido.

El papel de la β-arrestina-1 en la fosforilación sostenido de ERK y el de Señalización de Protección de mGlu1-Sobre la base de similitudes
con otros GPCRs (40), la hipótesis de que el mGlu1 inducida fosforilación de ERK puede implicar una β-arrestina-1-dependienteside
internalización de los receptores y la formación de mGlu1 como un complejo de señalización mediante esta señalización de protección.
Al investigar esta hipótesis, la expresión de β-arrestina-1 en Las células CHO que expresan mGlu1 fue silenciado con shRNA dirigido
contra la rata β-arrestina-1. La transfección con un plásmido de codificación ARNhc causó una disminución sustancial en la proteína de
niveles de expresión de β-Arrestin-1 como un seguimiento por Western borrones, mientras que un revuelto ARNhc utilizado en los
experimentos de control no tuvo ningún efecto (Fig. 5, A y B). En los experimentos, las células de rescate ARNhc expresar dirigidos
fueron transfectadas con ADN para humanoβ-arrestina-1, que es refractaria a los efectos de silenciamiento de shRNA ratas debido a
que tienen desajustes de varias bases. Expresión de los derechos humanosβ-arrestina-1 causó un aproximado de 3 veces mayor deβ-
arrestina-1 los niveles de proteína en relación con

FIGURA 5. Efecto de silenciamiento de ARNhc β-arrestina-1 en la transducción de señales de mGlu1 en las celulas de CHO.A, los niveles
de proteína de β-arrestina-1 en mGlu1-expresado en las celulas de CHO. Las muestras en el carril 3 fueron transfectadas con plásmidos
se codifica en los objetivos RNA contra la rata β-arrestina-1, que reduce la expresión a un 24% de los controles no transfectadas (Carril
1). Revuelto de control shRNA no afecta los niveles de proteína de β-arrestina- 1 (carril 2). Derribo por ARNhc se invierte por
transfección de los derechos humanos β-Arrestin-1 (calle 4). Derribo por ARNhc se invierte por transfección de humanoβ-Arrestin-1
(calle 4). Transfección withhumanβ-arrestina-1 hace que la expresión niveles de 314% con respecto a los controles no transfectadas. B,
la cuantificación de la Western blot expresado como proporción de ofbanddensitiesmeasuredforβ-arrestina-1 y β-Actina. C, de
protección de señalización a través mGlu1 es abolida por shRNA silenciamiento deβ-arrestina-1. En shRNA células que expresan, la
transfección de los derechos humanosβ-arrestina-1 restaura la señalización de protección por glutamato. D, la falta de efecto de
silenciamiento de β-arrestina-1 en agonista inducida por al hidrólisis PI en las células CHO que expresan mGlu1. E y F, glutamato (Glu)-
inducido internalización de mGlu1 es atenuada por ARNhc silenciamiento deβ-arrestina-1. Las células fueron marcadas con biotina
escindible y estimulado con glutamato durante 1 h. Biotina extracelular se retiró y se internaliza mGlu Receptores 1a se baja en
neutravidina. P, pellet (interiorizado durante la incubación); S, sobrenadante (receptores restantes). Efecto de silenciamiento de ARNhc
β-Arrestin1 en la fosforilación de ERK inducida por los agonistas después de 5 minutos (G) y 24 h (H). ERK fosforilación transitoria es
sensible a la inhibición de la PLC por U73122 (30µM) (G). Fosforilación de ERK sostenido está bloqueado por el silenciamiento de ARNhc
β-arrestina- 1 pero no se ve afectada por la inhibición de la PLC (H). Fosforilación de ERK fue midió mediante ELISA, y los datos se
expresan como un porcentaje de ERK fosforilada en ausencia de los agonistas. Todos los valores son medias de al menos tres
experimentos ejecutados en triplicados, con barras de error representan SE. Los dobles asteriscos representan diferencias significativas
(p< 0,001) en comparación con los controles no tratados usando Bonferroni ajustado prueba de la t. Quis, quisqualato.

Controles no transfectadas (Fig. 5, A y B). El control adicional de experimentos demostraron que el silenciamiento de ARNhc β-
arrestina-1 fallo para disminuir la agonista inducida por hidrólisis de PI en células CHO que expresan los receptores de mGlu1 (Fig. 5D).
En contraste, β-Arrestin- 1 shRNA abolió el efecto protector de glutamato contra la privación de suero (Fig. 5C). La protección por el
glutamato fue restaurada después de la transfección de los derechos humanos β-arrestina-1 (Fig. 5C).

El uso de ensayos de internalización, se encontró que un pulso de 30-min 1 mM de glutamato causo que el 50% de los receptores de
mGlu1 para convertirse en contraste internalizado de las células de control, donde~ 18% de los receptores de mGlu1 fueron
internalizados durante la incubación de 30-min (fig. 5, E y F). La transfección con shRNA dirigido a la internalización de β-arrestina- 1
causado en la presencia de glutamato 1 mM que es equivalente con la internalización constitutiva visto en las células no expuestas a
glutamato (Fig. 5, E y F). Otros experimentos demostraron que el silenciamiento de β-arrestina-1 es afectado de manera diferente a la
fosforilación transitorios de ERK y sostenido mediada por los receptores de mGlu1. La fosforilación transitorios de ERK es inducida por
glutamato y quisqualato que se redujo por el inhibidor de PLC U73122, pero no por el silenciamiento β-Arrestin-1 (Fig. 5G). En
contraste, la fosforilación sostenido de ERK, mide 24 horas después de la aplicación de agonistas, se ha activado sólo por el glutamato y
fue abolida por el silenciamiento de β-arrestina-1, pero no por el inhibidor de PLC U73122 (Fig. 5H).

Estos resultados muestran que la clásica señalización de mGlu1 a través de hidrólisis PI, que también incluye la fosforilación transitoria
de ERK, no depende de la presencia deβ-Arrestin-1. De hecho, la figura. 5B sugiere que la hidrólisis de PI después del silenciamiento de
β-arrestina-1 fue ligeramente elevada, lo que corresponde bien a la capacidad que se informó de β-arrestina para inhibir la proteína G-
mediada por la transducción de señales (41). En contraste, nuestros resultados indican que la presencia de β-Arrestin-1 es necesaria
para ambos ya que sostiene la fosforilacion de ERK y la señalización protectora de mGlu1.

DISCUSIÓN

En un informe anterior, hemos demostrado que el glutamato, que actúa selectivamente a los receptores de mGlu1, protege a las
neuronas de la apoptosis de la muerte inducida por privación trófica (1). En este estudio, se muestran la existencia de un mecanismo de
transducción de señales de novela que permite a los receptores de mGlu1 mediar en esta señalización de protección. Este mecanismo
es distinta de la clásica bien descrito, la proteína G-mediada por la transducción de señales del grupo receptores I mGlu (7, 8) y no es
compartida por los receptores mGlu5. Ahora muestran que en las células CHO que expresan receptores mGlu1, la protección del
glutamato de la toxicidad causada por la privación de suero, y esta protección fue bloqueada no sólo por un no competitivo de los
antagonistas de mGlu1, sino también por la inhibición de los receptores de internalización por el silenciamiento de β-arrestina-1 y la
inhibición de la expresión de dinamin. Además, la señalización de protección se bloqueó por los inhibidores de MEK 1/2. La vía por la
que los actos de mGlu1 no parece estar relacionada a las clásicas de señalización de proteínas G, como la protección no fue atenuada
por la inhibición de la fosfolipasa C. En cambio, nuestros datos revelan la existencia de un mecanismo previamente no declarada de
señalización asociados con los receptores de mGlu1, a saber, una proteína de señalización G-independiente de protección de vía que
requiere β-Arrestin-1 y la activación de MEK seguido por la fosforilación de ERK.

La señalización a través de antiapoptóticas β-arrestina se ha demostrado de numerosos GPCRs (42). Como moléculas de señalización,
de β-arrestinas Se ha demostrado que media la estimulación de la fosforilación de varias proteínas quinasas, incluyendo ERK (43).
Además, la señalización de β-arrestina medida se ha demostrado que ser independiente de la señalización de la proteína G para
múltiples receptores incluyendo la angiotensina II tipo 1 bis del receptor (44), la dopamina D3 receptor, (45) el β 2-adrenérgico (46), y el
µ los receptores opioides (47). De acuerdo con informes anteriores que β-Arrestin-1 es necesario para la agonista inducida por la
internalización de los mGlu1 (21), nuestros resultados sugieren que la señalización de protección de los mGlu1 puede ser iniciado por el
agonista dependiente de la internalización del receptor, seguido por una no clásica, de la proteína G-independiente de mecanismo de
transducción de señales. Nuestros resultados también indican que, de manera similar a varios otros GPCRs (25), mGlu1 muestra un
ligando sesgo hacia los diferentes mecanismos de señalización, que se manifiesta por la capacidad de glutamato para activar ambas vías
de señalización, mientras que se activa quisqualato solo la proteína de G es medida por la hidrólisis PI.

La señalización de protección mGlu1 parece estar medido por un mecanismo diferente de la fosforilación de ERK que el descrito
anteriormente. Varios informes indican que los agonistas de acción en mGlu1 inducen a un aumento transitorio de la fosforilación de
ERK que los picos a los 5 min y desaparece a los 30 minutos (23, 36). Consistente con estos informes, en las células de CHO que
expresan mGlu1, a 5 min, agonistas de la fosforilación inducida de ERK por una transitoria, que había un perfil farmacológico similar a la
observada para hidrólisis de PI, fue bloqueado por la inhibición de la actividad PLC, y no depende de la expresión de β-arrestina. A
mayor concentración de glutamato, la β-arrestina es silenciosamente reducida ligeramente y la fosforilación de ERK también a los 5
minutos, lo cual es consistente con un informe anterior que muestra que una porción de mGlu1 medida Fosforilación transitoria de
MAPK es dependiente de β-Arrestin (23). En conjunto, estos datos sugieren que la fosforilación transitorios de ERK está mediada por el
mecanismo clásico de la proteína G-mediada por hidrólisis PI.

Además, hemos observado que el glutamato, que actúan a mGlu1, se activa también una fase de larga duración de la fosforilación de
ERK, que se mantuvo en presencia de glutamato para 24 h. Hasta donde sabemos, este es el primer reporte de una fosforilación
sostenida de ERK debido a la estimulación de una metabotrópicos receptores de glutamato. Similar al efecto protector del glutamato, la
fase sostenida de la fosforilación de ERK fue insensible a la inhibición del PLC y fue completamente abolida por shRNA silenciamiento de
expresión de β-arrestina-1. En contraste, con la Fosforilación transitoria de ERK, la fase de sostenido fue inducida por muchas mayores
concentraciones de glutamato y no fue provocada por quisqualato. Como se ha demostrado, esta diferencia en el glutamato potencia
reflejada en la presencia de células CHO transfectadas receptor de reserva para la hidrólisis PI. El perfil farmacológico de la fosforilación
sostenido de ERK asemejaba a la de protección de señalización de mGlu1, pero no a la de hidrólisis PI y fosforilación transitoria de ERK.
Estos datos sugieren fuertemente que la señalización protectora de mGlu1 está mediada por glutamato inducida en la fosforilación
sostenida de ERK. Aunque las líneas de producción de los objetivos específicos de la ERK fosforilada no se han, ERK fosforilada, que
actúa en el núcleo de la célula, se demostró que provoca respuestas celulares de protección (24).

En conclusión, hemos demostrado la existencia de un nuevo mecanismo de transducción de la señal de los receptores de mGlu1. En
contraste a la clásica proteína G-medida por hidrólisis PI, este mecanismo parece implicar agonista mediada, internalización del
receptor dependiente β-arrestina-1- , seguido por la activación de MEK en cascada y una larga duración, la fase sostenida de la
fosforilación ERK . Este mecanismo parece ser responsable para la acción protectora de la media por los receptores de glutamato
mGlu1. Hemos propuesto previamente que mGlu1 puede funcionar como un receptor de dependencia de la apoptosis causado en
ausencia de glutamato, posiblemente debido a la escisión de su dominio C -terminal (1). Ahora, se propone que la señalización de
protección, positivo de mGlu1, que se produce en presencia de glutamato, es medida por este nuevo, mecanismo de la transducción
de señales de la proteína G-independiente, Esta hipótesis necesita ahora ser validados en los sistemas que expresan receptores nativos
mGlu1 e in vivo. Además los estudios también son necesarios para atender el mecanismo y establecer las condiciones en las que el
glutamato, clásicamente vistos como un excitotoxina (12, 48, 49), también pueden producir un efecto protector cuando actúa en
mGlu1. Actuando como un receptor de la dependencia, mGlu1 puede servir como un sensor de glutamato extracelular, promoviendo
la supervivencia neuronal en presencia de glutamato y la inducción de apoptosis en su ausencia. Dicho mecanismo podría desempeñar
un papel importante en la fisiología del cerebro, permitiendo al glutamato actuar como un factor trófico para contribuir al desarrollo
neuronal y selección neuronal durante sinaptogénesis y, posiblemente, por participar en la reestructuración del tejido cerebral
dañado.