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GENÉTICA MOLECULAR
1. El ADN como depositario de la información genética. Experimentos de
Griffith.
2. Concepto molecular de gen.
3. Replicación del ADN.
4. Expresión de la información genética: el dogma central de la biología
molecular.
5. Transcripción.
6. El código genético.
7. Traducción.
8. Estructura del genoma de procariotas y eucariotas.
9. El Proyecto Genoma Humano.
10.Concepto de proteoma y proteómica. Aplicaciones.
Experimento de Griffith
En 1928, Griffith realizó una serie de experimentos con la bacteria Streptococcus pneumoniae,
causante de la neumonía en las personas y extremadamente patógena para el ratón. Observó
que la bacteria presentaba dos variantes o cepas distintas. Una de ellas provocaba la
enfermedad y la muerte del ratón, a esta cepa la llamó S. La otra cepa, a la que llamó R, no era
virulenta. La principal diferencia entre ellas era que las bacterias de la cepa S presentaban una
envoltura bacteriana ausente en las cepas inofensivas. Así comprobó que la presencia de
cápsula determinaba la virulencia de la bacteria. Cuando inoculó en ratones bacterias de la
cepa S muertas, estas no provocaban su muerte, sin embargo, si inoculaba una mezcla de
bacterias S muertas y R vivas, muchos de los ratones del experimento morían.
Como resultado de sus experimentos con ratones, Griffith dedujo que en las bacterias de la
cepa S muertas había algo, a lo que llamó factor transformante, que se transmitía a las
bacterias vivas de la cepa R y las transformaba en bacterias S vivas.
Experimento de Avery
En 1944, Avery y sus colaboradores encontraron la explicación a este fenómeno, descubriendo
que la sustancia encargada de transformar las bacterias inofensivas en virulentas, era el ADN,
que determinaba la producción o no de la cápsula bacteriana.
Posteriores experimentos demostraron que el ADN es el material genético en todos los seres
vivos.
Actualmente, desde el punto de vista de su función, un gen se define como un fragmento del
ADN que lleva la información para fabricar una proteína, necesaria para que se exprese un
determinado carácter en un individuo.
Se dieron muchas hipótesis sobre como se duplica el ADN, entre ellas cabe destacar:
Hipótesis conservativa: Tras la duplicación quedarían, las dos hebras antiguas juntas
y, por otro lado, las dos hebras nuevas formando una doble hélice. (es decir, la doble
cadena original se mantiene y se sintetiza otra completamente nueva).
En 1957, Meselson y Sthal, mediante cultivos con Escherichia coli en un medio con nitrógeno
pesado (N15) demostraron la hipótesis semiconservativa. (ver experimento en libro de texto,
página 257)
La replicación del ADN tiene lugar al final de la interfase, en la fase S del ciclo celular. En los
eucariotas tiene lugar en el núcleo (donde se encuentra el ADN), y en los procariotas en el
nucleoide (región donde se localiza el ADN o cromosoma circular). Para que ocurra, la célula
necesita las moléculas que forman los diferentes nucleótidos y una serie de enzimas, que
controlan y dirigen el proceso en todo momento.
¿Qué necesitamos?
ADN molde
Nucleótidos: ATP, GTP, CTP, TTP
Proteínas SSB (evitan que las dos cadenas de ADN se vuelvan a enrollar)
Enzimas:
o Helicasas: Rompen los puentes de hidrógeno que mantienen las dos cadenas
de ADN unidas.
o Topoisomerasas (o ADN girasas). Desenrollan en ADN y evitan tensiones
celulares.
o ADN Ligasas: Unen fragmentos de ADN mediante enlaces fosfodiéster al resto
de la cadena.
o ARN polimerasas (también llamadas primasas). Son enzimas que sintetizan
un pequeño fragmento de ARN, llamado ARN cebador, para ello utilizan como
molde ADN.
o ADN polimerasas (ADN de unos 1000 nucleótidos).
Es incapaz de iniciar por si sola la síntesis de una cadena, para ello necesita hacerlo a
partir de un extremo de una corta cadena de ARN de unos 40 o 50 nucleótidos, que
llamaremos ARN cebador. (Es decir, la ADN polimerasa no puede actuar por si sola,
necesita de un ARN cebador).
b) Función Exonucleasa. Detecta errores y elimina nucleótidos cuyas bases están mal
apareadas y fragmentos de ARN.
ADN polimerasa I. Tiene tanto función exonucleasa (retira fragmentos de ARN cebador,
como función polimerasa (sintetiza ADN en los huecos en los que retiró el ARN
cebador).
ADN polimerasa II. Interviene en procesos de reparación del ADN
ADN polimerasa III. Sintetiza ADN (por lo tanto, tiene función polimerasa).
1.- La replicación comienza en zonas del ADN donde existen determinadas secuencias de
nucleótidos. El punto donde se inicia el proceso lo denominaremos oriC (punto de inicio).
2.- A partir de ese punto interviene un enzima, la helicasa, que separa las hebras de ADN al
romper los puentes de hidrógeno que mantenía unidos los nucleótidos complementarios. Las
dos cadenas de ADN se separan de manera semejante a una cremallera que se abre.
3.- Como consecuencia del proceso se forma una burbuja de replicación en la que se
observan don zonas con forma de Y (llamadas horquillas de replicación). En la burbuja se
observa una duplicación bidireccional. Es decir, la burbuja se va extendiendo a lo largo del
cromosoma en los dos sentidos.
Fase de elongación
4. A continuación comienza la síntesis de las hebras complementarias sobre cada una de las
cadenas originales.
El proceso se va a llevar a cabo gracias al enzima ADN polimerasa III. Pero para que esta
enzima actúe es necesario que exista una cadena corta de ARN (llamado ARN cebador o
primer), de unos 40 o 50 nucleótidos.
El ARN cebador es sintetizado por la primasa (que es un enzima ARN polimerasa). Para ello
utiliza una cadena de ADN como molde y sintetiza por complementariedad un trozo de ARN.
Una vez fabricado el trozo de ARN ya si puede actuar la ADN polimerasa III y sigue fabricando
la nueva hebra de ADN.
El ADN polimerasa III recorre la hebra antigua en sentido 3´ 5´, y por lo tanto fabrica la
cadena complementaria en sentido 5´ 3´ (es decir, la ADN polimerasa III une nucleótidos
en sentido 5’ 3’ ). La hebra así sintetizada se denomina hebra conductora o de síntesis
continua.
El ADN polimerasa solo puede avanzar en sentido 3´ 5´, y la otra cadena está en dirección
contraria. En este caso la síntesis es discontinua y se produce en cortos segmentos. Los
fragmentos que se forman se llaman fragmentos de Okazaki, y constan de unos 1 000 a 2
000 nucleótidos.
En primer lugar se forma un corto fragmento de ARN cebador por la primasa (ARN polimerasa).
A partir de este fragmento de ARN intervine la ADN polimerasa III y fabrica fragmentos de unos
1 000 nucleótidos de ADN.
A continuación la ADN polimerasa I (gracias a su actividad exonucleasa) retira los ARN
cebadores y fabrica (gracias a su actividad polimerasa) los segmentos de ADN que faltan.
Por último, tras la eliminación de los ARN cebadores, los fragmentos de Okazaki se unen
gracias a la acción de las enzimas ligasa. Como consecuencia se forma una hebra, llamada
retardada, ya que su síntesis es más lenta que la de la hebra conductora.
Fase de terminación
Cada hebra recién sintetizada y la que ha servido de molde se enrollan originando una doble
hélice.
Corrección de errores
Durante la replicación es frecuente que se produzcan errores y se incorporen nucleótidos que
no llegan correctamente apareados a sus bases. Inicialmente, el número de errores que se
producen es de uno por cada 100 000 bases; sin embargo, durante la propia replicación se
corrigen parte de los errores. La ADN polimerasa actúa como exonucleasa, eliminando
primero los nucléotidos mal apareados, y luego rellenando el hueco dejado con nuevos
nucleótidos. La ADN ligasa es la que termina uniendo los fragmentos resultantes. Esta acción
es similar a la de arreglar un error mecanográfico pulsando la tecla “borrar” y luego tecleando la
letra correcta.
Aunque el mecanismo de corrección de errores es muy eficiente, a veces queda alguno sin
corregir. Estos errores pueden ser importantes en la evolución.
En los eucariotas, al ser el ADN mucho más largo, existen varios puntos de iniciación
(llamado replicón) a lo largo del cromosoma. Por ello se forman varias horquillas de
replicación, lo que acelera el proceso.
Como el ADN de los eucariotas está asociado a histonas, la replicación debe tener en
cuenta la síntesis de estas proteínas. Las histonas originales se mantienen en la hebra
conductora, mientras que las nuevas histonas se unen a la hebra de ADN retardada.
La traducción de la información del ADN para que pueda sintetizarse una proteína se realiza en
dos fases:
ARNt
Replicación
ADN ARNm Proteína
Transcripción Tradución
En la actualidad este flujo de información genética ha tenido que ser modificada, debido a los
mecanismos de replicación que presentan algunos virus. Tal es el caso de los retrovirus, que
almacenan la información genética en forma de ARN. Sin embargo, poseen una enzima, la
transcriptasa inversa, que sintetiza ADN a partir de una molécula de ARN. El proceso recibe el
nombre de retrotranscripción o transcripción inversa. Por ello, el dogma central de la biología
molecular, actualmente se expresa de la siguiente forma:
Transcriptasa ARNt
inversa Replicación
Replicación
ADN ARNm Proteína
Tradución
Transcripción
5. Transcripción
La transcripción consiste en copiar parte del mensaje genético contenido en el ADN hasta el
ARN. En dicho proceso se forma una cadena de ARN cuya secuencia de bases nitrogenadas
es la misma que un segmento de una de las hebras de la doble hélice de ADN.
El proceso, tiene lugar en los eucariotas en el núcleo, donde se encuentra el ADN; en los
procariotas ocurre en el nucleoide, región donde se organiza el cromosoma bacteriano.
¿Qué se necesita?
ADN molde (Solo será preciso una de las cadenas)
Nucleótidos (ribonucleótidos): GTP, ATP, CTP y UTP
ARN polimerasa: enzima que une nucleótidos mediante enlaces fosfodiéster en
sentido 5` 3`( o lee en sentido 3` 5`).
1. Iniciación:
El ARN polimerasa se fija a una región específica del ADN, llamada centro promotor, rica en
timinas y adeninas.
Una vez fijada, la ARN polimerasa produce el desenrrollamiento de una vuelta del ADN.
2. Elongación:
Consiste en la adición sucesiva de ribonucleótidos para formar el ARN. Para ello la ARN
polimerasa avanza a lo largo de la cadena leyéndola en sentido 3` 5`(por tanto, sintetiza la
nueva cadena en sentido 5` 3`). La enzima selecciona el ribonucleótido trifosfato cuya base
es complementaria con la cadena de ADN que actúa como molde y lo une, mediante un enlace
éster, al siguiente nucleótido.
En los eucariotas, tras la unión de los 30 primeros ribonucleótidos se añade al extremo 5`una
“caperuza” formada por metil-guanonisa-trifosfato, que durante la traducción será una señal de
inicio de lectura.
3. Terminación
La ARN polimerasa llega a una zona del ADN llamada señal de terminación (rica en secuencias
de bases de guanina y citosina), que indica el final del proceso de transcripción. Esto implica el
cierre de la burbuja formada en el ADN y la separación de la ARN-polimerasa. En procariotas
esta secuencia de terminación es palindrómica (se lee igual de derecha a izquierda que de
izquierda a derecha).
En eucariotas, tras la separación del ARN, se añade en el extremo 3`una secuencia formada
por unos 200 nucleótidos de adenina, llamada cola poli-A, que al parecer interviene en los
procesos de maduración y transporte del ARN fuera del núcleo.
En procariotas la transcripción es necesaria para formar los tres tipos de ARN (mensajero,
transferente y ribosómico). En el caso del ARNm, éste se puede utilizar directamente para la
síntesis de proteínas, por tanto no existe maduración del ARN. Sin embargo, el ARNr y el ARNt
sintetizados (llamados transcritos primarios) requieren un proceso posterior de maduración
para ser funcionales. Durante este proceso el ARN transcrito sufre recortes y uniones de
fragmentos que permiten obtener los ARN definitivos más pequeños.
En eucariotas el proceso de transcripción es más complejo que en los procariotas. Existen tres
tipos de ARN polimerasa diferentes, llamadas I, II y III. La I interviene en la formación del ARNr,
la II en la síntesis de todos los ARNm y la III en la del ARNt y de un ARNr de pequeño tamaño.
Además, los ARN que se forman en los eucariotas son monocistrónicos (en procariotas son
policistrónicos); es decir, contienen la información solo para la síntesis de una proteína.
Después de la separación del ARN, una enzima (poli A-polimerasa) añade en el extremo 3´una
secuencia formada por unos 200 nucleótidos de adenina (cola de poliA), que parece intervenir
en los procesos de maduración y transporte del ARN fuera del núcleo.
Los intrones son secuencias de bases que se transcriben, pero que no se traducen, es
decir, no codifican una secuencia de aminoácidos.
Los exones son las secuencias que se trascriben y se traducen, es decir, tienen
información para formar una cadena polipéptidica.
Así pues, el ARN premensajero consta de intrones y de exones. Este ARN debe sufrir un
proceso de maduración, que consiste en la eliminación de los intrones y la unión de los exones
mediante un mecanismo que se conoce como splicing (empalme). Para ello se requiere la
actuación del enzima ribonucleoproteína pequeña nuclear (RNPpn). El proceso de splicing
comienza cuando las secuencias intrónicas forman unos bucles que provocan el acercamiento
de los extremos de los exones y continúa con el corte de los intrones y la unión de exones,
para formar un ARNm que ya está en condiciones de salir del núcleo.
6. El código genético
Durante la traducción, la molécula de ARNm va avanzando en el ribosoma y se van leyendo
los codones uno a uno.
El ribosoma “interpreta” el mensaje del ARNm, de tal manera que cada ARNt se une a un
aminoácido, lo lleva hasta el ribosoma y lo añade a la cadena polipeptídica en crecimiento.
Cada molécula de ARNt tiene un triplete de nucleótidos llamado anticodón, complementario
del codón del ARNm. Además en uno de sus extremos porta un aminoácido. De esta manera,
si el codón del ARNm es UGG, el anticodón del ARNt será ACC, y el aminoácido que porta
será el triptófano.
La correspondencia entre los codones del ARNm y los aminoácidos que forman las proteínas
recibe el nombre de código genético.
Para descifrar el código genético se utilizaron diferentes hipótesis de trabajo. Como sólo hay
cuatro bases nitrogenadas distintas, las señales codificadas para los 20 aminoácidos proteicos
deben estar constituidas por más de una base. Si cada señal estuviese formada por dos bases
2
nitrogenadas, sólo codificarían 4 = 16 aminoácidos, por lo que aún quedarían aminoácidos sin
codificar. Por tanto, cada señal que codifica para un aminoácido está constituido por tres
3
bases nitrogenadas consecutivas un triplete), es decir, 4 =64 tripletes de bases nitrogenadas.
Es universal, esto significa que es el mismo para todos los seres vivos, incluyendo los
virus. Así por ejemplo, el codón GCC codifica para el aminoácido alanina, en todos los
seres vivos. Este hecho indica que el código ha tenido un solo origen evolutivo.
Actualmente, gracias a la biología molecular, se están encontrando excepciones,
concretamente las mitocondrias y algunos protozoos utiluizan un código genético
ligeramente diferente.
Carece de solapamiento. Los tripletes se hallan dispuestos de forma lineal y continua, sin
comas ni espacios y sin que compartan ninguna base nitrogenada.
¿Dónde ocurre?
El proceso tiene lugar en los ribosomas, tanto los que se encuentran en el citoplasma
(de procariotas y eucariotas), como los que se encuentran en el interior de
mitocondrias y cloroplastos de las células eucariotas.
Ribosomas
ARN mensajero
Aminoácidos
ARN t
Enzimas y energía (que proviene de la hidrólisis del GTP).
Debes recordar que en los ribosomas se distinguen tres lugares: la sede E (liberación)
desde donde salen los ARNt una vez descargados de sus aminoácidos, la sede P
(peptidil) donde se sitúa la cadena polipéptidica en formación, y la sede A
(aminoacil) donde entran los aminoácidos que se van a ir uniendo a la cadena.
Antes de que se inicie la síntesis de proteínas propiamente dicha es preciso que los
aminoácidos, que van a ser unidos y formaran por tanto parte de la proteína, se
activen. En esta fase previa, que tiene lugar en el citoplasma y no en los ribosomas,
cada aminoácido se une a una molécula de ARNt específica gracias a la acción del
enzima aminoacil-ARNt-sintetasa.
Para ello es necesario el aporte energético obtenido por la hidrólisis del ATP. El
aminoácido queda unido por su extremo carboxilo al extremo 3’ del ARNt.
Una vez activados los aminoácidos tiene lugar la síntesis de proteínas, que comprende
las siguientes etapas:
INICIACIÓN
ELONGACIÓN
TERMINACIÓN
GENOMA DE PROCARIOTAS
Nota: en los virus el genoma está formado por una sola molécula lineal o circular de
ADN o ARN (nunca los dos) que incluye un número de genes que puede ir de unos
pocos a varios cientos. Existen elementos génicos móviles, los trasposones y los
retrotransposones que, junto con los plásmidos bacterianos, pueden haber estado en
el origen de los virus, al ser fragmentos de ADN o ARN que pudieron alcanzar la
capacidad de dividirse independientemente de sus células hospedadoras.
GENOMA DE EUCARIOTAS
No todo el ADN presente codifica para proteínas (en humanos se cree que solo
el 1% codifica para proteínas, el resto es ADN no codificante). El ADN no
codificante está formado por:
o ADN repetitivo o satélite: Secuencias de 5 – 10 pares de bases que
se sitúan en los extremos del cromosoma y centrómeros. Son zonas
importantes en la estructura del cromosoma y no se transcriben nunca.
o ADN repetitivo intermedio. Formado por secuencias de 150 – 300
nucleótidos. Son genes que codifican histonas, ARNr, ARNt, ARNm y
ARNn.
o Secuencias de intrones (no codifican proteínas.
o ADN regulador. Función hasta la fecha desconocida.
El Proyecto Genoma Humano (PGH) nace en la década de los ochenta con el objetivo
de conocer el orden en que se disponían los nucleótidos en las cadenas de ADN de
los cromosomas humanos.
Pero antes de conocer el PGH se analizaron los genomas de otros organismos,
naciendo así una nueva ciencia la genómica. En un primer momento se secuenciaron
genomas completos de virus, bacterias, etc..
El PGH nace en los años ochenta liderado por organismos públicos de EEUU y bajo la
dirección de James Watson (el codescubridor de la estructura del ADN). El PGH contó
con la colaboración de centros de investigación y universidades de todo el mundo,
especialmente Reino Unido, Alemania, Francia y Japón, y lo transformaron en un
proyecto internacional.
1.- Conocer en qué orden están los genes y qué distancia existe entre ellos
(elaboración de un mapa genético). Actualmente esta fase está completa.
3.- Determinar la función de cada gen, es decir, averiguar la función que realizan.
Aunque el proyecto nació como un consorcio público, en 1996 uno de los fundadores
del PGH, Craig Venter fundó Celera Genomics, una empresa financiada con fondos
privados. Se inicia así en 1999 la secuencia del genoma utilizando dinero privado. En
tan solo un año se obtuvo el primer borrador, lo que obligó al consorcio público a
acelerar sus resultados.
Tener secuenciado el genoma humano es como tener todas las páginas del manual
que se necesita para hacer el cuerpo humano. Ahora el desafío es determinar la forma
de leer el contenido de todas esas páginas para luego entender cómo trabajan todas
las partes juntas, y así descubrir las bases genéticas de la salud y la patología de las
enfermedades humanas.
la manera en que interactúan entre ellas para poder comprender mejor, no solo el
funcionamiento de las células, sino del organismo.
La proteómica ha experimentado un gran avance en los últimos años debido a las
técnicas de separación y secuenciación de proteínas.
Por otro lado, los hallazgos científicos derivados de la genómica y la proteómica están
abriendo las puertas a la aplicación de la nanotecnología (diseño y puesta en
funcionamiento de máquinas moleculares que permitan realizar la prevención, el
diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades), el diagnóstico e investigación en
medicina humana y veterinaria, farmacología, patología y fisiología vegetal