Guia Laboratorio de Microbiologia DBIO1020 2019

FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y QUIMICAS
Laboratorio de Microbiología General

DBIO 1020
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
2019
DCBQ-DBIO1020 V7.0-201910 Página 1 de 73

NORMATIVAS GENERALES EN EL TRABAJO

DE LABORATORIO
Es muy importante para su seguridad y la de sus compañeros observar siempre las siguientes medidas
mínimas de seguridad.
 Es obligatorio concurrir al laboratorio con delantal blanco, lápiz dermográfico o plumón de tinta
permanente y fósforo.
 El mesón debe estar libre de todo objeto no útil para desarrollar su trabajo; al finalizar, déjelo limpio y libre
de material o equipo ajeno a su implementación normal.
 Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como “CONTAMINADO” y, por lo tanto, debe
manejarse con cuidado procurando no dejarlos en los mesones, elimínelos sólo en los recipientes dispuestos
para ello.
 En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeño que parezca, debe comunicarse inmediatamente al
profesor a cargo de la actividad.
 Respete siempre las indicaciones que se darán durante las primeras actividades prácticas respecto al uso del
mechero, asas, tubos u otros materiales.
 Está estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio.
 No haga bromas, ni permita que sus compañeros las hagan, con cultivos bacterianos o material
contaminado. Jamás debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del laboratorio.
 Antes de abandonar el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.
¡¡Recuerde!!
El principal responsable de su seguridad es usted

PRINCIPIOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO
La protección del personal y ambiente del laboratorio se logra mediante la aplicación de técnicas y normativas
de seguridad ya establecidas.
REGLAS GENERALES PARA EVITAR RIESGOS
I. Riesgos Físicos.
1. Asegurarse de que todos los equipos tengan línea de conexión a tierra, realizada por personal idóneo.
2. No manipular equipos o realizar conexiones con las manos húmedas.
3. Mantener un elevado nivel de seguridad a irradiaciones por luz ultravioleta u otro tipo de radiaciones.
II. Riesgos Químicos.
1. Almacenar los materiales volátiles, inflamables y tóxicos en un gabinete metálico o en una habitación aislada
del edificio. El lugar debe ser frío y bien ventilado. Estos materiales deben mantenerse en sus envases originales.
2. No transferir grandes volúmenes de líquidos peligrosos.
3. Transferir los materiales volátiles o inflamables en habitaciones bien ventiladas, bajo campana.
4. Evitar almacenar juntos reactivos incompatibles o explosivos.
5. Etiquetar todos los reactivos adecuadamente según el riesgo, indicando con dibujo de una calavera en el caso
que sean productos tóxicos.
6. Tener disponible neutralizantes para cualquier emergencia.
7. Tener disponibles extintores de incendios.
III. Riesgos Microbianos.
1. Debe darse estricto cumplimiento a las normativas, con el fin de minimizar los riesgos de contaminación,
enfermedades y asegurar confiabilidad de los análisis efectuados.

UNIDAD DE APRENDIZAJE I
ESTRUCTURA Y CRECIMIENTO BACTERIANO
Resultados de aprendizaje
 Describe morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana en preparaciones microscópicas de

acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.
 Relaciona la modificación de distintos factores abióticos con las características del crecimiento
bacteriano en relación a un medio de cultivo estándar.
Esta unidad se desarrollará en 6 sesiones que incluirá las siguientes actividades:
Sesión 1.
Indicaciones generales del curso
Sesión 2.
Trabajo práctico 1. Bioseguridad en el laboratorio. Materiales de trabajo
Sesión 3.
Trabajo práctico 2. Estructura bacteriana. Observación macroscópica de colonias bacterianas
Sesión 4.
Trabajo práctico 3. Estructura bacteriana. Observación microscópica de bacterias
Sesión 5.
Trabajo práctico 4. Crecimiento bacteriano.
Sesión 6.
Trabajo práctico 5. Crecimiento bacteriano. Discusión de resultados

LAS BACTERIAS:
NUESTRO OBJETO DE ESTUDIO
Las bacterias son organismos unicelulares, cuyo tamaño varía de acuerdo a la especie y a las condiciones de
cultivo. Las bacterias que se relacionan con el ser humano tienen un tamaño que se encuentra entre 0,5 y 5 μm.
El ojo humano tiene un poder de resolución de aproximadamente 100 μm, por lo que tamaños menores a este
resultan imperceptibles.
Dos ejemplos de tamaños bacterianos:
a) Las células individuales de bacterias de los géneros Staphylococcus y Streptococcus, comúnmente asociadas
a cuadros infecciosos de tipo piógeno, tienen una forma esférica con un diámetro entre 0,75 y 1,25 μm.
b) Escherichia coli, bacteria considerada como habitante normal del intestino de mamíferos (incluyendo el
humano), tiene forma de cilindro con un diámetro de 0,5 a 1,0 μm y un largo de 2 a 3 μm.
Figura 1. A) Tamaños relativos de células. B) Comparación de tamaño relativo entre bacterias y virus

PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABAJO MICROBIOLÓGICO
a) Mechero:
El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estéril, este sirve para esterilizar el asa
microbiológica, flamear la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos, entre otros y para mantener un
ambiente de trabajo estéril.
b) Placas de Petri:
Placas de vidrio o de plástico en las cuales se deposita una determinada cantidad de medio de cultivo sólido
(altura  de 4 mm). Consta de una base y una tapa, debe mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos
en que debe sembrarse el medio de cultivo.
c) Asas:
Instrumento con un mango y un alambre (nicrom) en la punta. Existen dos tipos: asa recta (que termina en
punta), y asa en anillo (un pequeño círculo en el extremo). Sirven para sembrar muestras bacterianas en
superficie y en profundidad (asa recta) y para sembrar en superficie y trasladar pequeñas gotas (asa en anillo).
d) Pipetas Pasteur:
Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plástico, estériles o no. Sirven para trasladar
material líquido (gotas) o bien para diseminar siembras acodando un extremo o formando un rastrillo. Para uso
en microbiología debe esterilizarse previamente.
e) Pipetas Graduadas:
Son las pipetas corrientes utilizadas en química, pero que para el uso microbiológico deben esterilizarse en
horno Pasteur envueltas en papel. Al desenvolverse deben flamearse al mechero.
f) Tubos de ensayo:
En microbiología los tubos de ensayo deben esterilizarse en horno Pasteur y taponarlos con algodón hidrófobo o
con tapas especiales de goma o plástico. Debe flamearse la boca del tubo cada vez que se saque la tapa y antes
de volver a colocársela.
g) Microscopio:
En microbiología se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tinción (al fresco) y el objetivo 100 X para
observaciones por inmersión (con aceite) en preparaciones teñidas. El microscopio debe quedar perfectamente
limpio después de finalizada la observación correspondiente.
h) Estufa de Cultivo:
Aparato que sirve para cultivar productos biológicos o siembras de bacterias en medios de cultivo que permitan
el crecimiento. Generalmente se utilizan a una temperatura de 35 - 37°C y atmósfera normal.

i) Baño María:
Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para mantener una determinada
temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de
cultivo sólido.
j) Horno Poupinel o Pasteur:

Es un aparato que sirve para esterilizar todo el material de vidrio que se utiliza en microbiología. El
procedimiento de esterilización más frecuente se realiza a 180°C por una 90 min. Es una esterilización en seco.
k) Autoclave:
Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y también para esterilizar
material contaminado (placas de Petri con cultivos positivos, caldos con crecimiento, muestras patológicas, etc.).
La esterilización se realiza a 121°C por 20 min y es una esterilización húmeda.
1. cañón
2. base
3. anillo que regula entrada de aire (virola)
4. entrada de gas (chiclé)
5. tubo de gas
6. llave de paso
Mechero Bunsen
Figura 2. Mechero de Bunsen. A) Nombres de sus partes; B) Tipos de llama.

Figura 3. Medios de cultivos sólidos
A B
Figura 4. Autoclave. A) Vista exterior; B) Esquema de funcionamiento

A B
Figura 5. A) Horno Pasteur (Poupinel); B) Cámara de anaerobiosis
Figura 6. Microscopio Óptico Compuesto

El microscopio óptico compuesto se conforma de los siguientes sistemas:
Sistema óptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo
Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta
Sistema de iluminación
Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación
Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador
Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecánico
Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo
Platina: Lugar donde se deposita la preparación
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular
Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos
Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el

microscopio se guardó correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 100 aumentos (100x) si la
preparación es de bacterias.
4. Realizar el enfoque de acuerdo a los siguientes pasos:
- Acercar el lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse
mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
- Separar lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la
muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente mover el
micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es
preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso.

5. Observación con objetivo de inmersión:
- Bajar totalmente la platina
- Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a
visualizar y donde habrá que echar el aceite
- Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x
- Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz
- Terminar de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión (100x)
- Mirando el objetivo, subir la platina lentamente hasta que el lente toque la gota de aceite
- Enfocar cuidadosamente con el micrométrico
- Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor
aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe
retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación
- Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también
que el objetivo 40x esté perfectamente limpio.

TRABAJO PRÁCTICO 1
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MATERIALES DE TRABAJO
RESULTADOS ESPERADOS
 El estudiante conoce las normas de bioseguridad que son utilizadas en el trabajo microbiológico, según
parámetros de seguridad aplicados en la universidad
 El estudiante conoce las características del trabajo y los materiales utilizados en el laboratorio de
microbiología
Actividades a desarrollar en la sesión práctica
 De forma expositiva se muestra al estudiante las normas relacionadas con el correcto desarrollo del
laboratorio de microbiología (funcionamiento y medidas de seguridad).
 Se muestra a los estudiantes distintos materiales que serán utilizados en el desarrollo de las actividades
prácticas como ejemplo: Mechero, Placas de Petri, Asas microbiológicas, Pipetas Pasteur, microscopio,
porta y cubreobjetos, estufa de cultivo, cámara de anaerobiosis (si hubiere), horno, autoclave, entre
otros.
 Se refuerza el manejo del microscopio óptico.
 Se refuerzan los conceptos de esterilidad y buen manejo del material de laboratorio.

Los estudiantes destaparán dos placas de agar sangre y las pondrán una, cerca del mechero durante
toda la hora de clases, mientras que la otra se dejará lejos del mechero, al finalizar la clase se tapan
ambas placas. Incubar a 35-37°C por 18-24 h.
 El profesor explica la importancia del rotulado del material e indica a los estudiantes la obligatoriedad de
presentarse con delantal blanco, ropa cerrada, marcadores (tipo Sharpie) y masking tape (cinta de papel
o pegote).
 El profesor explica en detalle el funcionamiento del mechero, enseñando a sus estudiantes a encender y
apagar con seguridad el mismo y dando a conocer la capacidad calórica de cada uno de los sectores de la
llama.
 El profesor explica a sus estudiantes cómo trabajar en esterilidad cerca del mechero, explica el manejo y
esterilización de asa de Drigalsky (etanol y llama) y asa microbiológica en punta y redonda (mechero).

ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS
CARACTERIZACIÓN BACTERIANA
Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria es la observación
directa de su morfología macroscópica y microscópica. En microbiología, debido a que las bacterias no se
pueden ver a simple vista, no se pueden estudiar de forma individual, por lo que se trabaja con poblaciones
bacterianas. Estas poblaciones se obtienen después de cultivar la bacteria de interés en un medio que le
proporcione todos los nutrientes que requiere: materia orgánica, iones inorgánicos, factores de crecimiento y
agua. Además, se debe cuidar que la temperatura a la cual se va a cultivar sea la adecuada.
En medios sólidos las bacterias crecen formando agregados que se pueden observar macroscópicamente
sobre la superficie y que reciben el nombre de colonias. Se asume que cada colonia procede de una sola bacteria
que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido hasta formar una colonia visible. Por lo
tanto, una colonia está formada por millones de bacterias.
La bacteria original desde la cual desciende la colonia se conoce como unidad formadora de colonia
(UFC). Este concepto nos ayuda a estimar el número de bacterias presentes en una muestra de interés. Para
esto, se cultiva en un medio sólido una fracción conocida de la muestra. Posteriormente, se cuentan las colonias
que se desarrollaron. El resultado del recuento bacteriano se expresa como el número de unidades formadoras
de colonia en relación al volumen (mL) o a la masa (g) de la muestra cultivada. En teoría, equivale al número de
bacterias originalmente presenten en la muestra, al momento de realizar la siembra.
Las bacterias que crecen en medios líquidos tienen gran libertad de movimiento, y como carecen de una
superficie sólida, no dan origen a colonias. El desarrollo de una población bacteriana se evidencia mediante la
turbidez del caldo o la sedimentación del cultivo.
El análisis macroscópico se refiere a la observación detallada de la morfología de las colonias, en la cual
se puede identificar características como forma, elevación, margen, superficie, brillo, color, hemólisis (en agar
sangre). Estos atributos son propios del grupo bacteriano y son estables a través de las generaciones, por lo que
este análisis permite un acercamiento a la identificación de los géneros bacterianos.
A B
Colonia bacteriana
i ii iii iv
Figura 11. Crecimiento bacteriano. A) Medio sólido: Colonias bacterianas; B) Medio líquido:
i) Formación de película en superficie, ii) Formación de sedimento en profundidad, iv) turbidez completa, v) sin crecimiento

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE BACTERIAS. COLONIAS BACTERIANAS
La observación macroscópica de bacterias es un examen visual de las colonias, en el cual se puede

distinguir características tales como:
- Tamaño (grande, mediana, pequeña, puntiforme) El tamaño de las colonias bacterianas es, en condiciones de
cultivo favorables, bastante uniforme para cada especie o tipo. La visualización del tamaño se suele hacer a
simple vista, aunque a veces es preferible utilizar lupas o estereoscopios para poder discernir con mayor claridad
las características morfológicas a observar. El tamaño de las colonias bacterianas podemos expresarlo en las
siguientes categorías:
Puntiformes: menor a 1 mm de diámetro
Pequeñas: aprox 1 mm de diámetro
Medianas: hasta 4 mm de diámetro
Grandes: mayores de 4 mm de diámetro
- Forma (circular, irregular) La morfología de una colonia viene dada por su borde y forma de elevarse sobre el
medio de cultivo
- Color (blanca, blanquecina, grisácea, dorada, tornasol) Es característico sólo de unas pocas especies
bacterianas. La pigmentación sólo se observa en colonias y nunca en células individuales. En ocasiones, el
pigmento difunde al medio, dando a éste una tonalidad característica en algunas especies.
- Aspecto o superficie (húmedo, seca, mucosa) La superficie de la colonia, examinada mediante luz reflejada,
puede mostrar un aspecto liso y brillante a la luz (colonias húmedas) o, por el contrario, una textura irregular,
rugosa y mate, sin brillo que evidencia colonias secas. Las colonias mucosas presentan una mayor cantidad de
humedad por lo que tienen un aspecto grueso y viscoso.
- Capacidad invasiva de las colonias sobre la placa (velo fino de desarrollo microbiano en la superficie del agar).
Habitualmente se pierde la visualización de un borde nítido alrededor de las colonias.
- Capacidad hemolítica. Algunas bacterias pueden ser capaces de hemolizar los hematíes de un medio nutritivo
sólido como el agar sangre. Esto es debido a la liberación de unas sustancias denominadas hemolisinas. La
hemólisis de los hematíes adyacentes a la colonia puede ser intensa o ligera y se observa como un halo verdoso
más o menos claro alrededor de la colonia. La hemólisis intensa se denomina ßeta hemólisis; la hemólisis parcial
se conoce como alfa hemólisis y la ausencia de ésta se define como gamma hemólisis. Las hemólisis se observan
mirando el medio de cultivo a contraluz, sólo en medios que contienen sangre.
Figura 12. Características macroscópicas de colonias bacterianas

A B
Figura 13. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonia mucosa/viscosa; B) Colonia de bacteria β hemolítica
Colonias invasivas
B C D
Colonias secas (opacas) Colonias húmedas (brillantes)

Colonias coloreadas
Figura 14. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonias invasivas; B) Colonias secas (opacas); C) Colonias secas, detalle; D) Colonias
húmedas (brillantes); E) Colonias coloreadas

TRABAJO PRÁCTICO 2
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS
 El estudiante deberá ser capaz de describir características macroscópicas de colonias bacterianas.
1. Observación macroscópica:
En el laboratorio encontrará placas de Petri que contienen cultivos de diversas bacterias. A partir de ellas
observe características morfológicas de las colonias bacterianas de acuerdo a las instrucciones del profesor.
- Tamaño (grande, mediana, pequeña, puntiforme)
- Forma (circular, irregular)
- Color (blanca, blanquecina, grisácea, dorada, tornasol)
- Aspecto (húmedo, seca, mucosa)
- Capacidad invasiva
- Capacidad hemolítica (cultivos en agar sangre)
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio

ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
La observación microscópica de bacterias consiste en examinar a las bacterias como células independientes, con
ayuda del microscopio y de tinciones que revelan determinadas características, como forma, agrupación,
presencia o ausencia de cápsula, esporas, flagelos, movilidad, entre otras.
A. Observación de bacterias vivas
- Al fresco: Se utiliza para observar bacterias en estado vivo. Se dispone una gota de suspensión bacteriana
(realizada con caldo, agua o suero fisiológico estéril) en un portaobjetos, se coloca un cubreobjeto y se observa
al microscopio, bajo el objetivo con aumento 10x o 40x (sin inmersión), disminuyendo la iluminación y bajando
el condensador del microscopio. Se puede observar movilidad.
- En campo oscuro: Se emplea para la observación de bacterias muy pequeñas que difícilmente se observan con
el microscopio óptico en condiciones corrientes (ej. Treponema pallidum). Se utiliza un condensador especial
que envía la luz de la lámpara de tal manera que no entra directamente a la preparación. Los rayos luminosos
son refractados por los microorganismos observándose como cuerpos brillantes sobre un fondo oscuro.
Figura 15. Micrografía de Treponema pallidum en campo oscuro
B. Observación de bacterias (muertas)
La mayoría de las observaciones microscópicas se realizan con técnicas de coloración, esto implica que las
bacterias mueren. Al teñir las bacterias se pueden percibir con mayor facilidad la forma y el tamaño, utilizando
el mayor aumento del microscopio óptico (objetivo 100x, conocido como objetivo de inmersión porque se utiliza
aceite en la observación de la preparación).
Por otra parte, las tinciones ofrecen información adicional a la morfología de las bacterias, ya que ponen de
manifiesto características de la pared celular (Tinción de Gram) o la existencia de estructuras especiales, como
esporas bacterianas (Tinción con Verde Malaquita),cápsulas (Tinta china) u otras.

Para realizar una tinción bacteriana, se requiere preparar un frotis de la muestra.
Preparación de frotis bacteriano
Se denomina frotis a la extensión que se realiza de una muestra o un cultivo sobre un portaobjetos, para luego
teñirlos. La preparación de cualquier frotis implica tres etapas fundamentales:
- Extensión: suspender las bacterias a examinar en líquido (en caso de provenir de una colonia bacteriana) o
depositar una gota de caldo (en caso de provenir de un cultivo líquido) sobre el portaobjetos, para extender el
fluido sobre el vidrio con ayuda de un asa.
- Secado
- Fijación: El objetivo es adherir las bacterias a la superficie del vidrio. La fijación se puede realizar por medios
físicos o químicos
i) Medios físicos: consiste en exponer el extendido al calor (la forma más usada).
ii) Medios químicos: consiste en colocar el extendido en contacto con una sustancia química, como
alcohol metílico, éter u otro.
Para la realización de un frotis se procede del siguiente modo:
a) Prenda el mechero (recuerde trabajar en la zona estéril, calentando el asa al rojo entre un uso y otro).
Asegúrese que el portaobjetos está completamente limpio
b) Coloque una gota de agua o suero fisiológico en el centro de la lámina (sólo si la muestra o cultivo es sólido)
c) Transfiera con un asa estéril una, dos o tres colonias (depende del tamaño) y mézclelas con el agua
formando una suspensión apenas opalescente. Deje secar al aire
d) Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama del mechero hasta que esté completamente seco. Evite
que se recaliente, pues se alterará la morfología bacteriana (y corre el riesgo de quebrar la lámina de
vidrio). Compruebe el calor del portaobjetos sobre el dorso de su mano.
Una vez extendida y fijada la preparación se deja actuar sobre ella los colorantes de uso microbiológico.
Tinciones de uso microbiológico
La tinción de los microorganismos consiste en dejar actuar una solución colorante sobre la preparación ya fijada.
Estas soluciones varían de acuerdo al método de tinción que se emplea.
Tinciones simples: Se basan en el uso de un colorante sobre el frotis bacteriano, por lo que todas las células se
observan de un mismo color. Este tipo de tinción sirve exclusivamente para observar forma y agrupación de las
bacterias.
Procedimiento
1. Realice un frotis de la muestra. Asegúrese de fijarlo correctamente.

2. Ubique el portaobjetos en la zona de tinción. Vierta sobre la muestra el colorante escogido, déjelo actuar
por 1 ó 2 minutos.
3. Lave suavemente el frotis con agua.
4. Seque el portaobjeto inclinándolo sobre papel absorbente para que escurra el agua. Luego puede pasarlo
rápidamente por la llama del mechero para que quede completamente seco.
5. Observar al microscopio, con objetivo de inmersión.
Figura 16: Esquema del procedimiento para realizar una tinción
Tinciones diferenciales: Estas tinciones utilizan más de un colorante, de manera que las bacterias de una
muestra se tiñen de colores distintos de acuerdo a su afinidad por los distintos colorantes. Se ha establecido que
la afinidad tintorial de un grupo bacteriano se correlaciona con una propiedad del grupo, como la estructura de
a nivel de la pared bacteriana, por ejemplo. De este modo, bacterias que quedan teñidas de un mismo color
pertenecen al mismo grupo bacteriano también. Entre estas tinciones, las más relevantes son la tinción de Gram
y la tinción de Ziehl - Neelsen.
A. Tinción de Gram (Christian Gram, 1884)
Esta tinción es probablemente la más importante en bacteriología. Permite distinguir, al menos, dos grupos de
bacterias basados en la afinidad por el colorante Cristal Violeta (Gram Positivas, de color azul púrpura) o por el
colorante Safranina (Gram Negativas, de color rojo). Esta diferencia en la afinidad tintorial se relaciona con la
ultraestructura de la pared bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicán y
carecen de membrana externa, mientras que las Gram negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicán
y poseen una membrana externa.
Existe también un tercer grupo de bacterias denominadas Gram variables, pues simultáneamente presentan
tinción de Gram positiva y tinción de Gram negativa, aun bajo condiciones óptimas de cultivo. Estas bacterias
poseen una pared con estructura de Gram positiva, aunque la capa de peptidoglicán es más delgada que en la
mayoría de las bacterias Gram positivas.
Procedimiento
1. Prepare un frotis.
2. Cubra toda la muestra con Cristal Violeta o Violeta de Genciana al 1%, deje actuar durante 1 minuto.
3. Elimine el exceso de colorante y lave con agua rápida pero cuidadosamente, manteniendo la lámina inclinada.
4. Cubra la preparación con la solución de lugol, deje actuar durante 1 minuto
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol etílico o alcohol-acetona durante 30 segundos
7. Lave con agua.
8. Cubra el portaobjetos con safranina, deje actuar por 30 segundos
9. Lave con agua.
10. Seque la lámina en forma inclinada sobre papel absorbente. Cuando esté completamente seca, puede
observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Principios de la Tinción de Gram
a. Tinción inicial. Las células se tiñen con Cristal Violeta o Violeta de Genciana, el cual es el colorante primario
(químicamente es una tinción básica). En este paso todas las células se tiñen de morado o azul púrpura.
b. Mordiente. Se adiciona solución de yodo (lugol), que reacciona con el cristal violeta forma un complejo
insoluble en agua. Todas las células continúan de color morado.
c. Decoloración. Se adiciona un solvente orgánico (no polar), el cual actúa lavando el complejo de cristal violeta-
yoduro de las células Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continúan teñidas de morado
y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso crítico del procedimiento, pues si se exagera decolora las
bacterias Gram positivas y si se hace por muy breve tiempo (o muy débilmente) no decolora a las bacterias
Gram negativas.
d. Tinción de contraste. Estos colorantes reemplazan al colorante primario que ha sido removido de las
bacterias Gram negativas, se utiliza Safranina o Fucsina (esta tinción debe tener una naturaleza química distinta
al Cristal Violeta), para obtener un contraste rojo o rosado. Las bacterias Gram positivas son resistentes a este
lavado (complejo insoluble a agua).
La retención o pérdida del colorante en una bacteria ocurre por el lugar de la ultraestructura en el cual se forma
el complejo cristal violeta-yoduro. Bacterias que carecen de membrana externa pero poseen un grueso
peptidoglicán retienen el colorante primario, mientras las bacterias que presentan membrana externa y una
capa de peptidoglicán más delgada pierden el colorante primario y se tiñen con la tinción de contraste.
Figura 17. Tinción de Gram. a) Etapas de la tinción; b) Micrografía de muestra con bacterias Gram positivas y Gram negativas

B. Tinción de Ziehl - Neelsen
Esta tinción se emplea para colorear aquellas bacterias que son difíciles de teñir con colorantes básicos (como
los utilizados en la tinción de Gram), porque se muestran impermeables a la coloración. Solamente utilizando
colorantes enérgicos, como la fucsina fenicada, cuya acción se fuerza con el uso de calor o con un prolongado
tiempo de contacto, estas bacterias logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que los decolorantes
fuertes como el alcohol y los ácidos no consiguen decolorarlas. Por eso reciben el nombre de bacterias alcohol-
ácido resistente (BAAR).
Esta tinción es empleada para bacterias que poseen una membrana con alto contenido lipídico, característica
por la cual son difíciles de teñir. Las bacterias del género Mycobacterium son BAAR por excelencia, pues el
contenido lipídico de las micobacterias, compuesto por fosfolípidos y ceras principalmente, alcanza hasta un
40% de su peso seco total. La colorante base de la tinción de Ziehl-Neelsen es la fucsina fenicada, como
decolorante se utiliza ácido clorhídrico al 3% en alcohol etílico, o ácido sulfúrico al 1/4 o ácido nítrico al 1/3; el
colorante de contraste suele ser azul de metileno, pero también se puede usar amarillo victoria o verde
malaquita.
Procedimiento
1. Realizar un frotis con material biológico del paciente, obtenido de zonas que contienen bacterias, como
expectoración u orina. La muestra de expectoración se extiende sobre el portaobjetos de manera
homogénea (se puede utilizar otro portaobjetos para extenderla) cubriendo las 2/3 partes de la lámina,
para luego fijar con calor. La muestra de orina debe sedimentar, el sedimento se centrifuga a 1.500 r.p.m.
durante 5 minutos. El frotis se realiza utilizando el pellet; y se debe fijar en la estufa. Esta misma operación
se realiza con otros líquidos corporales, como L.C.R. o líquido pleural.
2. Luego de realizado el frotis, se cubre la lámina con fucsina fenicada (previamente filtrada) y se calienta
hasta que emita vapores blanquecinos visibles. Repetir este proceso dos veces más, evitando que el
colorante se seque sobre la lámina. Contabilizar un tiempo total de actuación del colorante de 8 a 10
minutos. Cuando aparecen vapores se ha logrado el calentamiento aproximado de 90°C con lo que se
obtiene una cubierta cérea más blanda que se deja impregnar por el colorante.
3. Eliminar la fucsina inclinando el portaobjetos hacia adelante, lavar el frotis con un chorro de agua suave
sobre la parte del portaobjetos que no contiene extendido y dejar escurrir el agua sobre la película
coloreada de modo que ésta no se desprenda.
4. Cubrir la totalidad de la lámina con alcohol-ácido de manera que vaya decolorando y arrastrando
suavemente la fucsina hasta que las partes más gruesas del extendido conserven sólo un ligero tinte
rosado. Eliminar el alcohol-ácido y lavar con agua.
5. Cubrir la lámina con azul de metileno durante 1 minuto.
6. Eliminar el azul de metileno y lavar con agua a baja presión por ambos lados.
7. Secar a temperatura ambiente.
También puede realizarse la técnica en frío, sin necesidad de calentamiento, dejando actuar el colorante
durante 30 minutos.
Las bacterias alcohol-ácido resistentes son aquellas que no pierden la coloración inicial con fucsina por acción
del alcohol-ácido y se observarán de color rojo, mientras el resto de la preparación se observará de color azul.

Figura 18: Frotis con tinción de Ziehl-Neelsen
Tinciones especiales: El objetivo de estas tinciones es destacar algunos constituyentes de la bacteria, como
flagelos, cápsulas, esporas o gránulos intracitoplasmáticos. Los procedimientos de estas tinciones son complejos,
pero permiten precisar detalles de la estructura bacteriana. En general, son útiles en trabajos de investigación
bacteriológica, con escasa utilidad en el laboratorio clínico.
Figura 19. Micrografía de bacterias con flagelos teñidos

A. Tinción para cápsula
Se trata de una tinción negativa que permite determinar la presencia de cápsulas polisacáridas, usando tinta
china.
Figura 20: Esquema del procedimiento de la tinción de cápsula
Procedimiento
a) Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio.
b) Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado.
c) Deje secar y fije.
d) Cubra con fucsina o safranina.
e) Lave, seque y observe con objetivo de inmersión.
Figura 21: Cápsulas bacterianas con tinción negativa

B. Tinción de Esporas
Algunos géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a
condiciones ambientales adversas, como sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas bacterianas
se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la
espora se debe a la estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también
las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.
Figura 22: Tinción de esporas. A) Esquema del procedimiento; B) Esporas teñidas con verde malaquita

Morfología Celular
A pesar de su pequeño tamaño las bacterias, pueden presentar una variada morfología. Sin embargo, la gran
mayoría de ellas se pueden caracterizar en las siguientes formas básicas:
i) Cocáceas, células bacterianas de forma esférica o aproximadamente esféricas
ii) Bacilares, células en las cuales uno de sus ejes es mucho mayor que el otro, adoptando la apariencia de un
bastón o cilindro
iii) Espiraladas, células largas que presentan torsión alrededor de un eje central (espirales y espiroquetas)
iv) Curvas, células retorcidas pero que no alcanzan una torsión completa
Bacterias cocáceas
Bacterias bacilares
Bacterias espirales
Bacterias espiroquetas
Bacterias de formas
no tradicionales
Bacterias filamentosas
Figura 23. Morfología celular de las bacterias

Al dividirse las bacterias, las células hijas pueden quedar unidas o próximas unas a otras dando lugar a
agrupaciones típicas que ayudan a completar su estudio microscópico.
Agrupación de las células bacterianas
Las bacterias presentan diversos modelos de agrupación de acuerdo a los diferentes planos en los que puede
ocurrir la división celular, si las células hijas permanecen junto a la célula madre una vez realizada la división
celular. Cada una de estas disposiciones es típica para un grupo particular, por lo que esta característica puede
usarse en identificación.
Se pueden distinguir las siguientes agrupaciones:
 Pares: Las células se presentan mayoritariamente en parejas posterior a una división en un plano. Si la
forma bacteriana es cocácea se habla de diplococos (Ej. Neisseria spp.), si la forma de la célula es bacilar se
habla de diplobacilos.
 Tétradas: Resultan de la división de diplococos en el plano perpendicular al primer plano de división. Son 4
células unidas entre sí (Ej. Micrococcus spp.)
 Cubos o sarcina: Se producen cuando una tétrada se divide en un tercer plano formando un paquete cúbico
de ocho células que asemejan un cubo. Esta agrupación es característica del género Sarcina (cocácea).
 Racimos: En este caso la división celular se produce en tres planos, de forma irregular, dando origen a
masas de células que en la observación microscópica se asemejan a racimos. Esta agrupación es
característica del género Staphylococcus.
 Cadenas: Las células se ubican en línea formando cadenas de longitud variable. Esta agrupación se presenta
porque la división celular ocurre en un solo plano y las células no se separan después de la división. La
agrupación en cadena es característica de los géneros Streptococcus (forma cocácea), Bacillus y
Lactobacillus (formas bacilares).
 Empalizada: Agrupación que se encuentra sólo en bacterias en forma de bacilo. Las células se disponen una
al lado de la otra dando la impresión de una empalizada. Ej. Corynebacterium spp.
 Letra china: también se presenta sólo en bacilos. Las células se disponen formando diferentes ángulos que
dan la idea de letras chinas Ej. Corynebacterium spp.
La agrupación de las células es una propiedad constante en las bacterias, por esta razón, facilita la identificación
bacteriana en el laboratorio.

Sin agrupación (aislada)
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: empalizada y letra china
Figura 24. Agrupación de bacterias bacilares

Sin agrupación (aislada)
Agrupación: en pares
Agrupación: en cadenas
Agrupación: en tétradas
Agrupación: sarcina
Agrupación: racimo
Figura 25. Agrupación de bacterias cocáceas

TRABAJO PRÁCTICO 3
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
 El estudiante será capaz de describir morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana en

preparaciones microscópicas de acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.
1. Tinción de Gram
- En el laboratorio encontrará diversas placas con cultivos bacterianos, a partir de ellas seleccione una bacteria
Gram positivo y/o una Gram negativo y realice la tinción de Gram correspondiente.
- También podrá encontrar preparaciones de bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus
sp., Bacillus subtilis Neisseria sp.y Micrococcus sp.) teñidas con tinción de Gram listas para ser observadas al
microscopio
- Las bacterias deben ser visualizadas (aumento 100x con aceite de inmersión) y documentadas correctamente
indicando forma celular, agrupación y afinidad tintorial (Gram positivo o Gram negativo)
2. Tinción de Cápsula
- Realice una tinción de cápsula (tinción negativa) de Klebsiella pneumoniae y/o Staphylococcus saprophyticus
 Agregar con micropipeta una gota (50 µl) de tinta china en la orilla de un porta objeto
 Agregar 50 µl de K. pneumoniae o S. saprophyticus sobre la gota anterior
 Esparcir con el cubre objeto en forma de frotis
 Fijar al mechero
 Agregar colorante de contraste fucsina o safranina durante 2 min
 Lavar suavemente con agua y secar con papel absorbente
 Observe con aumento 100x con aceite de inmersión
3. Revisión de resultados y preparación del reporte
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio, incluyendo limpieza y orden del
microscopio.

CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
CRECIMIENTO BACTERIANO
Los microorganismos en general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en
el laboratorio, que son denominados medios de cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio de forma estéril. Estos suministran
los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos, como agua, carbono, nitrógeno,
hidrógeno, calcio, fósforo y hierro.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras, en cambio,
necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios diseñados por el
ser humano. Los microorganismos que requieren factores de crecimiento específicos, como aminoácidos,
vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de sintetizar, reciben el nombre de microorganismos
exigentes.
Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos y según el
objetivo del estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
- Contener las sustancias necesarias para el crecimiento del (os) microorganismo (s)
- Mantener condiciones de esterilidad hasta el momento de la siembra
Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías:

requerimientos físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica;
entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias
minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembradas las bacterias en el medio de cultivo, deben ser incubadas a la
temperatura y tensión de oxígeno adecuadas.
CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos (tales como
aminoácidos, carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales)
2. Tener un pH que permita un desarrollo óptimo
3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas
4. Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé, tapones de goma, tapas
metálicas o roscas.
UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material biológico corporal (secreción purulenta, orina,
órgano, fecas u otros) o de un alimento (leche, carne, entre otros).
2. Estudio morfológico de las colonias.
3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario)
4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios diferenciales.
5. Obtención de toxinas o investigación de sus características.
6. Cultivo y recolección de bacterias para la elaboración de productos biológicos (vacunas, antígenos,
bacteriocinas, toxoides, entre otros)
7. Estudio de susceptibilidad antibiótica

Clasificación de los medios de cultivo
Según su utilidad práctica
Medios corrientes: Son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la mayoría de las bacterias.
Sirven de base para la preparación de los medios especiales.
- Ejemplos: Caldo nutriente, Agua peptonada, Agar nutritivo.
Medios especiales: Son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva sirven para el cultivo de
bacterias muy exigentes. En su formulación, pueden contener sustancias inhibidoras de ciertas bacterias,
facilitando el aislamiento y diagnóstico de los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas. También
pertenecen a esta clasificación aquellos medios que facilitan el diagnóstico porque manifiestan características
bioquímicas de algunas especies microbianas; esto lo logran por la adición desustancias químicas determinadas.
Los medios especiales se clasifican en:
Medios Mejorados: Se obtienen añadiendo a los medios de cultivo corrientes sustancias de mayor valor
nutritivo, como sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero sanguíneo (equino), suero fetal bovino,
huevo, cerebro, corazón, trozos o extracto de hígado, carne o levadura, entre otros. Estas sustancias tienen el
efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes, como Streptococcus spp. o
Corynebacterium spp. Como la mayoría de estas sustancias son de naturaleza proteica no pueden ser
esterilizadas por autoclave, pues coagulan con el calor. Cuando esto ocurre, las sustancias deben ser
esterilizadas por filtración y se deben agregar a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa
asepsia.
- Ejemplos de medios mejorados: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazón, caldo de Tetrationato, caldo Selenito
(empleado en el aislamiento de Salmonella spp. desde muestras provenientes de excrementos, orina o aguas
residuales).
Medios Selectivos: Los medios selectivos estimulan el desarrollo de ciertas especies bacterianas mientras
inhiben el desarrollo de otras especies; esto permite el aislamiento y diagnóstico de bacterias patógenas con
facilidad y rapidez, especialmente cuando el causante del cuadro infeccioso se encuentra en zonas corporales
donde ya existen bacterias de forma natural. Por ejemplo, es frecuente que en fecas, orina, exudados, alimentos
o agua haya presencia de bacterias sin interés diagnóstico (que no causan enfermedad), pero que crecerán en
los medios de cultivo corrientes enmascarando la presencia del agente patógeno buscado.
Estas características se obtienen por la adición de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares,
antibióticos, entre otros.
- Ejemplos de medios selectivos: Agar Brucella, Agar McConkey, Caldo Selenito Cistina.
Medios indicadores o diferenciales: Son medios comunes o mejorados a los cuales se le ha adiciona ciertas
sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, propias de algunas especies
bacterianas, como por ejemplo: producción de H2S gas, de ácidos o de sustancias alcalinas, acción proteolítica,
acción lipolítica, entre otras. Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie
microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales.
- Ejemplos de medios diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Agar Baird Parker, Agar Rambach.

Los medios de cultivo se pueden encontrar en tres estados físicos:
1. Medios Líquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de células estresadas
y/o para el enriquecimiento de bacterias presente en una muestra.
2. Medios Sólidos: se utilizan para obtener colonias aisladas sobre la superficie del medio de cultivo, para el
estudio de la morfología de las colonias, lo que no permiten los medios líquidos. Se diferencian de los anteriores
porque tienen una matriz de sostén, que puede ser agar-agar o gelatina.
3. Medios Semisólidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de
agar que un medio sólido, por lo que no solidifican totalmente a temperatura ambiente.
Los medios sólidos tienen generalmente agar–agar como agente solidificante, espesante o gelificante. El
agar-agar es una sustancia hidrofílica de carácter coloidal procedente de diversas especies de algas marinas,
especialmente del tipo “Gelidium”, que tiene la propiedad de formar un gel. Químicamente el agar-agar es un
polisacárido de cadena larga. El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fría,
se disuelve solamente a temperatura de ebullición, se mantiene en forma viscosa a 60 – 80°C y solidifica en
forma de un gel estable a 40 - 45°C. Resiste perfectamente la esterilización a 121°C y por su capacidad de
retener agua no se deshidrata fácilmente, lo que permite almacenar los medios por un período de tiempo a 5°C.
La gelatina es atacada y descompuesta por muchos tipos de bacterias; sin embrago, se añade a los
medios de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de atacarla (presencia de enzimas gelatinasas) o
cuando las bacterias degradan el agar-agar (enzimas agarasas).
TÉCNICAS BÁSICAS DE SIEMBRA MICROBIANA
TECNICAS BASICAS DE CULTIVO BACTERIANO
Para un correcto desarrollo de las actividades en microbiología es necesario conocer y practicar las
técnicas básicas de manejo y cultivo de microorganismos. Estas técnicas no han variado mucho desde el estudio
sistemático del mundo microbiano, ya hace más de dos siglos, pero aun representan una manera segura y fiable
para el estudio microbiológico.
Un concepto clave en las técnicas microbiológicas es la ESTERILIDAD, la cual debe estar presente en todo
momento, especialmente en el manejo del material de trabajo. A continuación se especifican las nociones
básicas en el manejo estéril del material microbiológico de importancia y las técnicas de sembrado
microbiológico:
A. Esterilización de asas y pipetas

Cada vez que se desee utilizar asas de platino o pipetas capilares deben esterilizarse a la llama del
mechero. Para esterilizar el asa, se coloca el alambre en posición semivertical sobre la llama hasta que se ponga
color rojo vivo, inmediatamente se completa la esterilización flameando la parte metálica del mango.
La esterilización de asas y pipetas capilares se realiza antes y después de haberlas usado con bacterias.
Para tomar bacterias es preciso esterilizar previamente el asa y esperar hasta que esté totalmente fría. El asa se

enfría tocando las paredes de vidrio del tubo, la tapa de la placa de Petri, o bien la zona del medio en que no
haya bacterias. Luego se procede a tomar la muestra.
En el caso de las pipetas, la de tipo capilar debe ser rota en el extremo, si se encuentra sellada, para
luego deslizarla sobre la llama girándola suavemente en una extensión muy superior a la que se introducirá en el
tubo, luego se enfría del mismo modo que el asa de platino.
Las pipetas aforadas pueden estar en cilindros metálicos o envueltas en papel ya estériles. En el primer
caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las
otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta desde el extremo donde queda parte del papel suelto,
de manera de no tocar su extremo inferior (que estará en contacto con la muestra).
Figura 7. Forma correcta de esterilizar el asa microbiológica
Figura 8. Espacio de trabajo microbiológico
EL ESPACIO DE TRABAJO MICROBIOLOGICO SIEMPRE DEBE ESTAR ORDENADO Y CON LOS MATERIALES
DISPUESTOS PARA EL TRABAJO INDIVIDUAL

B. Flameo de tubos de ensayo.

Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente
antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos al interior del
tubo, a través del aire.
Figura 9. Forma correcta de esterilizar un tubo de ensayo
C. Aislamiento de Bacterias:
Cuando se realiza una siembra en medios sólidos es deseable obtener las bacterias en forma de colonias
aisladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una microbiota mixta, que se manifiesta por el
desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (microbiota normal) o contaminantes del
proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.
Para realizar diagnóstico microbiológico, el organismo debe ser primero aislado y mantenido puro en
condiciones de laboratorio.
Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de una
colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos con fines diagnósticos. En el caso de los medios
líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de 1 gota o 1 asada del
cultivo a un medio sólido para obtener colonias aisladas y asegurarnos de su pureza (todas con características
macroscópicas iguales). Si fuese necesario, las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener
cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología y
microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria. Sólo en este momento se puede proceder a la
identificación de la especie bacteriana mediante el traspaso de una colonia a una batería de medios
diferenciales.

Técnicas de Aislamiento
De medio sólido, de mezcla bacteriana o de muestra patológica a Placa de Petri.
1. Estrías en zig-zag: Se toma el asa con la muestra y se procede a hacer una estría en zig-zag desde un extremo
a otro de la placa. Sin esterilizar el asa se puede repetir la misma operación en una segunda o tercera placa para
llegar a obtener colonias aisladas. Es preciso actuar con rapidez para evitar la contaminación con
microorganismos presentes en el aire. Esta técnica es poco recomendable para personas que poseen poca
práctica en laboratorio microbiológico. (Figura 10. A).
2. Estrías con movimientos de lateralidad (Técnica de siembra por agotamiento): Se toma la placa con la mano
izquierda y se distribuye la siembra en una pequeña área junto a su borde. Se esteriliza el asa, se enfría y se
arrastra un poco de la bacteria ya sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa con movimiento en
zig-zag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continúan los movimientos hasta ocupar toda la
superficie de la placa. (Figura 10. B).
A B
Figura 10. Formas correctas de sembrar un cultivo sobre agar. A) En zigzag; B) por agotamiento

TRABAJO PRÁCTICO 4
CRECIMIENTO BACTERIANO Y CONDICIONES DE CULTIVO
 El estudiante será capaz de relacionar distintos factores abióticos (nutrientes, condiciones de cultivo) con las
características del crecimiento bacteriano.
Crecimiento bacteriano y nutrientes
a) Necesidad de nutriente para crecimiento: A partir de cultivos saturados de Streptococcus pyogenes sembrar,
utilizando un asa curva y técnica por agotamiento, una placa de agar Tripticasa de Soya y una placa de Agar
Tripticasa/Sangre.
Incubar cada medio de cultivo sembrado en estufa a 35-37° C por 24 horas en atmósfera normal
b) Utilización de glucosa (fermentación) para el crecimiento: A partir de cultivos saturados de Escherichia coli y
Pseudomonas sp. sembrar, utilizando asa curva un tubo con caldo mineral con glucosa al 1%, agregar una
capa de aceite mineral (vaselina) e incubar en estufa a 35-37°C por 24 horas en atmósfera normal
Crecimiento bacteriano y factores ambientales
c) Presión osmótica: A partir de cultivos saturados de Staphylococcus aureus y Escherichia coli sembrar,
utilizando asa curva, los siguientes tubos:
-caldo tripticasa de soya
-caldo tripticasa de soya más NaCl 2%
-caldo tripticasa de soya más NaCl 10%
d) pH: A partir de cultivos saturados de Enterococcus sp. y Escherichia coli sembrar, utilizando asa curva, los
siguientes tubos:
-caldo nutritivo, pH 2
e) Registre en su cuaderno los procedimientos realizados y los resultados obtenidos.
NO OLVIDAR: Todas las muestras deben ser correctamente rotuladas y dispuestas en la incubadora respectiva,
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio.

TRABAJO PRÁCTICO 5
CRECIMIENTO BACTERIANO Y CONDICIONES DE CULTIVO. PARTE II
 El estudiante será capaz de relacionar distintos factores abióticos (nutrientes, condiciones de cultivo) con las
características del crecimiento bacteriano
1. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos relacionando estos con
las propiedades bacterianas en cada caso
2. Comentar, discutir sus resultados y confeccionar el reporte
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio.

UNIDAD DE APRENDIZAJE II
CONTROL DE MICROORGANISMOS
 Reconoce el efecto de los métodos de control físicos, químicos y de antibacterianos sobre el crecimiento
bacteriano
Sesión 7
Trabajo práctico 6. Control de microorganismos. Agentes físicos de control
Sesión 8
Trabajo práctico 7. Control de microorganismos. Agentes físicos de control. Revisión y discusión de resultados
Sesión 9
Trabajo práctico 8. Control de microorganismos. Agentes químicos de control
Sesión 10
Trabajo práctico 9. Control de microorganismos. Agentes químicos de control. Revisión y discusión de resultados
Sesión 11
Trabajo práctico 10. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos
Sesión 12
Trabajo práctico 11. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos. Revisión y discusión de resultados

ESTERILIZACION
La esterilización se define como la destrucción completa o eliminación total de los microorganismos o
toda forma de vida incluyendo bacterias y sus formas esporuladas, hongos, virus y parásitos, que se encuentran
en la superficie o en el interior de objetos y sustancias. El criterio práctico para evaluar la esterilidad es la
ausencia de crecimiento microbiano en un medio adecuado.
La eliminación de los microorganismos puede efectuarse mediante procesos físicos, mecánicos o
químicos. El método escogido para esterilizar un producto depende fundamentalmente de su naturaleza y
estabilidad frente al calor u otros agentes esterilizantes. Así, por ejemplo, cuando necesitemos agregar suero
equino a un medio de cultivo líquido para enriquecerlo, no podemos aplicar calor para esterilizarlo, ya que se
produciría la coagulación de las proteínas del suero alterando su composición. Situación semejante ocurre con
otras sustancias o materiales termolábiles, para los cuales se utilizan métodos de esterilización que no alteren su
estabilidad, uniformidad o identidad de dichas sustancias o materiales.
DESINFECCIÓN
La desinfección puede definirse como el proceso elimina gran cantidad de bacterias, virus y hongos, pero
no necesariamente todas las formas de vida de estos microorganismos Las técnicas o procesos destinados a
realizar desinfección o reducción del número de microorganismos contaminantes se aplican únicamente a
objetos inanimados.
La eficacia del procedimiento de desinfección se ve determinada por:

 Naturaleza del objeto a desinfectar
 El número y grado de resistencia de los microorganismos presentes en la superficie
 Cantidad de materia orgánica presente.
Los desinfectantes son clasificados en tres niveles (alto, mediano y bajo), según la intensidad de su actividad
sobre los microorganismos a eliminar.
1. Desinfección de Alto nivel: Se logra con desinfectantes de alto nivel de actividad que son capaces de
eliminar esporas lentamente, por lo tanto, son desinfectante-esterilizante.
Son ejemplos de desinfectantes de al nivel Óxido de Etileno, Formaldehído al 8% en alcohol 70%,
Glutaraldehído al 2%, Peróxido de Hidrógeno, entre otros.
2. Desinfección de Medio Nivel: Se logra con desinfectantes de nivel intermedio que son no son capaces de
eliminar esporas pero si eliminan bacterias (incluido Mycobacterium tuberculosis), hongos y virus no
lipídicos. Son ejemplo de estos desinfectantes Compuestos clorados (por ej.: hipoclorito de sodio),
Compuestos iodados (iodóforos y alcohol iodado), Compuestos fenólicos, Alcoholes y Clorohexidina.
3. Desinfección de Bajo Nivel: Se logra con desinfectantes de bajo nivel que sólo son capaces de eliminar
bacterias vegetativas (excepto Mycobacterium). Son ejemplo de estos desinfectantes los compuestos de
Amonio cuaternario y Compuestos mercuriales.

La selección del agente o el procedimiento a utilizar depende de las características del objeto y, desde un punto
de vista clínico, de la probabilidad que tiene éste de producir una infección si es utilizado estando contaminado.
CLASIFICACIÓN DE SPAULDING
La clasificación de Spaulding, que data y rige desde 1968, es un criterio de indicadores para la desinfección de
objetos y materiales que se utilizan en el ámbito sanitario y hospitalario, que van a tener contacto con el
paciente, tipificados de acuerdo al riesgo de infección.
 Objetos críticos: Penetran en los tejidos o cavidades. Normalmente deben estar estériles.
 Objetos semicríticos: Entran en contacto con tejidos mucosos. Deben estar libre de bacterias.
 Objetos no Críticos: Deben por lo menos ser lavados, tienen contacto con piel sana.
Nivel Tipo de Equipo Ejemplo Mínimo nivel requerido

Crítico Instrumento inducido Instrumentales quirúrgicos, Esterilización
directamente en el torrente cateterismos cardíacos; Catéteres
sanguíneo o en zonas estériles IV, etc.
del cuerpo.
Semicrítico Objeto en contacto con mucosa Endoscopios flexibles, tubos Desinfección de Alto nivel
intacta endotraqueal, laringoscopios, etc. (D.A.N.)
No Crítico Objeto en contacto con piel Manguito de presión sanguínea, Desinfección de Mediano y
intacta. Otoscopio, etc. Bajo nivel
Figura 28. Cuadro resumen. Criterios de desinfección, clasificación de Spaulding
ASEPSIA
Etimológicamente, el concepto asepsia significa “ausencia de podredumbre”. Por lo tanto, el término
asepsia se relaciona con la ausencia de microorganismos que causan enfermedad. Para lograr esto se utilizan un
conjunto de técnicas que impiden el acceso de las bacterias no deseables al campo de trabajo hospitalario que
permiten lograr o mantener la ausencia de microorganismos infecciosos en los tejidos vivos. Se dice que un
material es aséptico cuando está privado de gérmenes (por esterilización o desinfección).
SEPSIS
Hace referencia a la presencia de microorganismos patógenos en una o varias estructuras orgánicas. Una
sepsis, localizada en un punto determinado del cuerpo, puede provocar una respuesta inflamatoria sistémica, si
no es detectada y tratada a tiempo. Cuando la sepsis está localizada en sangre se denomina bacteremia. El
cuadro de sepsis y bacteremia juntos recibe el nombre de septicemia.
ANTISEPSIA
Se refiere a las técnicas o procesos que, por su baja toxicidad, se utilizan para conseguir la asepsia de la
piel y de las mucosas asociadas en un organismo. La antisepsia normalmente es llevada a la práctica mediante
agentes químicos. Este término no implica la destrucción de todas las formas de vida; ya que, generalmente, los
antisépticos poseen un efecto bacteriostático. Una sustancia química bacteriostática inhibe el crecimiento o
multiplicación de los microorganismos, evitando que aumente la cantidad de microorganismos en el tiempo.

SANITIZACIÓN
Es la acción de utilizar procesos o técnicas que producen la reducción sustancial del contenido
microbiano, hasta un nivel de seguridad, sin que se llegue a la desaparición completa de microorganismos
patógenos, sin producir algún tipo de infección.
La esterilización, desinfección y antisepsia conducen, generalmente, a la destrucción, eliminación y/o inhibición

de los microorganismos, constituyendo los principales medios para prevenir infecciones en los hospitales.
Estos procedimientos se realizan mediante tres tipos de agentes:
1) Agentes Físicos
2) Agentes Químicos
3) Agentes Mecánicos
CLASIFICACION DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION Y/O DESINFECCIÓN
1. METODOS FISICOS: Se basan en la aplicación de agentes físicos naturales como, por ejemplo, temperatura
(calor), luz, radiación UV, radiación ionizante, entre otros.
2. METODOS MECANICOS: Las sustancias que no se pueden esterilizar por métodos físicos o químicos se pueden
tratar por métodos mecánicos, como la filtración.
La filtración se basa en los procesos físico-químicos observados entre los cuerpos microbianos o
elementos en suspensión y una sustancia semi-porosa. Así se consigue separar y retener los microorganismos de
los líquidos o superficies que los contienen. Los líquidos a filtrar deben atravesar por presión o vacío pequeños
canalículos de manera que los microorganismos queden retenidos en el filtro por adsorción. En el mecanismo de
adsorción influyen la viscosidad del líquido, pH, cargas eléctricas, tiempo y temperatura. Los filtros (de asbesto,
vidrio, porcelana, celulosa) deben tener un diámetro de poro inferior al diámetro de las bacterias. Un tamaño de
poro utilizado ampliamente para este fin es 0.22 μm (no retienen virus).
3. METODOS QUIMICOS: Se utilizan sustancias químicas, como óxido de etileno, fenol, alcohol, halógenos o
tensoactivos con el objetivo de realizar esterilización, desinfección y/o antisepsia cuando los materiales y/u
objetos no pueden ser sometidos al calor o producen daño a su integridad.
Métodos Físicos
I. CALOR SECO
El fundamento y principio de la esterilización del calor seco es producir la muerte por un aumento de las
reacciones de oxidación de los microorganismos. Esto se logra mediante:
A. Acción directa de la llama

La destrucción de los microorganismos mediante la llama es un procedimiento muy eficaz cuando el
material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se usa para esterilizar el asa de platino que se calienta

al rojo blanco (1300°C), espátulas, pinzas, pipetas, bocas de tubo o matraces, etc., empleando la llama del
mechero Bunsen por un tiempo de exposición de 10 segundos (también se denomina “ flameado“).
Cuando, además de matar las bacterias, se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se
habla de incineración. Este procedimiento se utiliza para destruir fluidos y restos orgánicos procedentes del
hospital, animales muertos por enfermedades contagiosas, ropa, vendas y objetos altamente contaminados.
B. Por aire caliente

El aire caliente confinado a temperatura de 160 a 180°C mantenido durante 1 hora, destruye con
seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicación se recurre al uso del horno de aire caliente, siendo
el más usado el horno Pasteur, que tiene como fuente calórica una resistencia eléctrica que está ubicada en la
parte inferior de la cámara. El horno Pasteur se utiliza para esterilizar material de vidrio (tubos, placas Petri,
matraces, etc.), de porcelana, de acero y otros materiales inalterables a esa temperatura. Nunca se emplea para
esterilizar material plástico, líquidos o medios de cultivo.
II. CALOR HUMEDO

El mecanismo de esterilización por calor húmedo induce la coagulación de las proteínas del protoplasma
bacteriano y de los ácidos nucleicos, y la destrucción de las membranas celulares. Se considera un método más
efectivo que el calor seco por su mayor poder de penetración y menor tiempo de acción.
A. Por agua en ebullición

El agua en ebullición (100°C) es suficiente para matar formar vegetativas de bacterias, pero no sus
esporas. Por lo tanto, no se logra esterilización.
B. Por vapor fluente

Se utiliza para la esterilización de instrumentos de cirugía, equipos de lechería, equipos de la industria de
alimentos, entre otros. Se alcanza una temperatura de aproximadamente 100°C si se mantiene sin presión y a
nivel del mar. Una exposición por 15 minutos es suficiente para destruir la forma vegetativa de las bacterias,
pero no sus esporas.
C. Por vapor de agua a presión

Las esporas de algunas bacterias son capaces de resistir los 100°C. La esterilidad completa sólo se
alcanza con el uso de calor húmedo a temperaturas más altas, en la forma de vapor saturado bajo presión. En
ausencia de aire, vapor de agua sometido a alta presión, tiene una temperatura constante. Por lo tanto, si
conocemos la presión podemos fácilmente conocer la temperatura que alcanza el vapor:
* vapor de agua a 121°C se obtiene con 1 atmósfera o 15 libras /(pulgada)2
En el laboratorio, el vapor de agua a presión se utiliza para esterilizar medios de cultivo, artículos de
plástico o polipropileno, soluciones u otros materiales para los cuales no se puede utilizar calor seco.
Los equipos empleados para la esterilización, bajo estas condiciones, se denominan autoclaves.
Existen distintos modelos de autoclaves (de carga vertical u horizontal), pero en general todos tienen las
siguientes partes: fuente calórica (gas, resistencia eléctrica o red de vapor), manómetro (con una escala lb/in2 o
Kg/cm2 o atmósferas), termómetro, llave de escape de vapor, válvula de seguridad, llave de descarga de agua y
llave de entrada de agua. Los autoclaves siempre deben ser manipulados por personal entrenado y autorizado.

Figura 29. Autoclave. A) Esquema del funcionamiento del autoclave; B) Etapas de autoclavado; C) Aspecto exterior
III. RADIACIONES
La radiación es absorbida por el ADN de los microorganismos, produciendo mutaciones letales o
modificaciones químicas del ADN de manera ya no es posible su proliferación. También inducen la formación de
sustancias químicas como oxhidrilos y átomos de hidrógeno, altamente reactivos con los procesos celulares
vitales. La radiación ultravioleta actúa directamente sobre el ADN en los líquidos que contienen oxígeno y
compuestos orgánicos mediante la producción de peróxidos orgánicos.
A. Luz solar
La luz solar tiene una propiedad bactericida muy eficaz, especialmente entre longitudes de onda de
2.100 a 3.000 Angstroms. Las bacterias esporógenas (productoras de esporas) son más resistentes que las no
esporógenas (no productoras de esporas). Lo mismo sucede con las bacterias fluorescentes que convierten las
ondas cortas (germicidas) en ondas largas de menor actividad. No es de mucha utilidad su acción esterilizante en
el laboratorio.

B. Radiación ultravioleta
Los rayos UV tienen escaso poder de penetración, lo que se utiliza principalmente para esterilizar las
superficies del material expuesto a la irradiación. En laboratorio, generalmente, se utilizan lámparas que emiten
luz con longitud de onda entre 2.650 y 2.750 Angstroms (Å) en la esterilización de aire, de ambientes y
superficies de trabajo o campo quirúrgico. Debe mantenerse un registro de las horas de esterilización de cada
tubo, ya que tienen una vida útil limitada que debe ser controlada.
C. Radiaciones ionizantes
Se utilizan preferentemente rayos gamma, que son radiaciones de alta energía emitidas por un isótopo
radioactivo de Cobalto 60 o Cesio 137. Dado su alto poder de penetración y la no generación de calor, se
emplean en la esterilización de material termosensible como el plástico (tubos, placas, jeringas y bolsas
desechables), hilos de sutura, entre otros.
Métodos Mecánicos
I. FILTRACION
Los filtros de uso corriente en el laboratorio son:
a) Filtros Seitz: Son discos de asbesto de diferentes diámetros y diferente porosidad. Estos discos se montan en
un aparato metálico donde se coloca el líquido a filtrar. Los discos se desechan después de su uso. Los filtros y
sus soportes se deben esterilizar en autoclave.
b) Filtros de vidrio poroso: Se fabrican en base a vidrio finamente pulverizado y comprimido.
c) Filtros de membrana: Son discos de ésteres de celulosa (acetato o triacetato) con 12 porosidades distintas,
según su uso. Los discos de poros con 0.22 μm de diámetro se consideran esterilizantes (para eliminación de
bacterias).
Filtración líquida Filtración de aire

TRABAJO PRACTICO 6
CONTROL DE MICROORGANISMOS.
AGENTES FISICOS DE CONTROL
 El estudiante será capaz de interpretar los resultados obtenidos en la aplicación de métodos de control
de microorganismos
1. Esterilización con fuego directo. Esterilizar un asa, luego tomar un inóculo a partir de un cultivo (Escherichia
coli en placa) y sembrar una mitad de placa de agar Tripticasa. Posteriormente, tomar el inóculo a partir del
mismo cultivo bacteriano, esterilizar el asa y luego sembrar en la otra mitad de placa. Incubar a 35-37°C por
24 h.
2. Efecto del agua caliente a distintas temperaturas. En el laboratorio dispondrá de 3 baños termorregulados
con las siguientes temperaturas (50, 70 y 100°C respectivamente)
A partir de un cultivo saturado de E. coli, sembrar una asada en tres caldos de caldo tripticasa estériles.
Repetir la operación con Bacillus subtilis. Colocar los tubos, de E. coli y B. subtilis a las temperaturas de 50,
70 y 100°C por 5 min. Terminado el proceso enfriar al agua corriente y luego incubar por 24 h a 37°C.
3. Efecto de radiación UV en el crecimiento bacteriano. Sembrar Escherichia coli y B. subtilis sobre cuatro
placas de agar tripticasa (en tapiz bacteriano con tórula) respectivamente. Someter las placas a distintos
tiempos de radiación UV: 0 (control), 5, 10 y 15 min. Luego incubar a 37°C por 48 h.

TRABAJO PRÁCTICO 7
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES FISICOS

DE CONTROL. PARTE II
de microorganismos
1. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos
2. Los estudiantes deben realizar un análisis de los resultados obtenidos y confeccionar reporte

Métodos Químicos
Los antisépticos y desinfectantes son sustancias químicas ampliamente utilizadas. De acuerdo a su

acción se pueden clasificar en bactericidas (destruyen las bacterias) o bacteriostáticos (inhiben el desarrollo
bacteriano).
La actividad germicida de los desinfectantes depende de las condiciones de uso: concentración, tiempo,
temperatura, pH, cantidad y calidad de la materia orgánica presente, características de la superficie, tipo y
concentración de microorganismos, entre otros.
Las sustancias químicas más frecuentemente usadas en el laboratorio son los siguientes:
1. ALCOHOLES: El alcohol etílico (etanol) es no tóxico, es incoloro e inodoro. Es útil contra las formas vegetativas
pero ineficaces contra las esporas. Actúa por deshidratación y desnaturalización de las proteínas. La
concentración óptima es al 70% (4 volúmenes de alcohol 95° más 1 volumen de agua destilada). El alcohol
isopropílico es más bactericida que el etanol, por lo que está desplazando al primero, ya que está libre de las
restricciones legales de la ley de alcoholes. Los demás alcoholes no son de uso práctico debido a su insolubilidad,
olor y alto costo. Se usan como antiséptico y desinfectante.
2. CLORO: El Hipoclorito de Sodio comercial viene a una concentración entre el 2,5 % y el 8 %. Para su uso en el
laboratorio se debe diluir al 1 %. El Hipoclorito de Sodio es un desinfectante de acción bactericida mediada por
la oxidación de los grupos sulfhidrilos libres.
3. YODO: tiene una acción bactericida sobre formas vegetativas y esporas, sobre hongos y algunos virus. Actúan
directamente por yoduración y oxidación, interfiriendo los procesos de óxido reducción y fosforilación
bacterianos. Se utiliza como tintura (solución alcohólica al 2% o 3%), lugol (solución acuosa al 5%) o para
aumentar la acción bactericida del alcohol etílico (alcohol yodado al 2%).
4. YODOFOROS: es una asociación de yodo con polímeros (polivinilpirrolidina) generalmente se usa al 10%, lo
que permite una liberación lenta de yodo (1%). Tiene acción bactericida y se utiliza como antiséptico y
desinfectante.
5. FENOL: la solución al 0.2% tiene una acción bacteriostática, al 1% es letal para la mayoría de las bacterias y al
1.5% es fungicida. Se usa en soluciones acuosas, es de bajo costo tiene un gran poder de penetración aún en la
piel intacta.
6. IONES DE METALES PESADOS: sales de mercurio (Timerosal, Mercurio Cromo), plata (Nitrato de plata), Zinc
(Sulfato de zinc) y cobre (Sulfato de cobre) en concentraciones altas desnaturalizan las proteínas. Actúan
combinándose a los grupos sulfhidrilos. Se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica y no actúan
sobre las esporas.
7. AGENTES ALQUILANTES: sustituyen átomos lábiles de hidrógeno con radicales alquilo. Un ejemplo es el óxido
de etileno que se usa para esterilizar materiales plásticos. Tiene una gran penetración, muy activo contra
esporas y virus. Es extremadamente tóxico y forma mezclas explosivas con el aire.

8. DETERGENTES: Sólo son desinfectantes, destruyen membranas. Son tensoactivos (o surfactantes), es decir,
disminuyen la tensión superficial y favorecen el arrastre por el agua, dan una función de barrido. Los jabones
neutros son poco efectivos, por lo que el mayor efecto sobre los microorganismos se debe a la acción mecánica
con la cual se acompaña la aplicación. Su actividad disminuye con la materia orgánica y son inefectivos contra M.
tuberculosis, virus de la hepatitis y esporas.
Los detergentes se pueden clasificar, de acuerdo a su naturaleza química, en: no iónicos, aniónicos y
catiónicos (sales de amonio cuaternario), que son los más usados.
La efectividad de los detergentes catiónicos (con carga positiva) se atribuye a la capacidad de romper
membranas, inactivar enzimas productoras de energía y a la desnaturalización de las proteínas externas de la
célula. Son compuestos de amonio cuaternario (NH4), en los que los hidrógenos se sustituyen por cadenas de
carbono. Uno de los más usados, y el primero que se comercializó (1935), es el cloruro de benzalconio, por su
baja toxicidad y su buena acción detergente. El cloruro de benzalconio se usa en la desinfección preoperatoria
de la piel (concentración del 0.05 - 0.5%) y en toallitas antisépticas, posee un nivel de desinfección bajo. La
actividad antimicrobiana de los amonios cuaternarios (o Quats, por si siglas en inglés) se inactiva por los
surfactantes aniónicos, como los jabones. Sin embargo, los Quats de tercera generación permanecen activos en
aguas duras y toleran residuos aniónicos, por lo que se usan en la limpieza de pisos y paredes. Otros
desinfectantes relacionados son la clorhexidina y la octenidina. Son desinfectantes de material médico,
alimentación y antisepsia de la piel.
9. FORMALDEHIDO: puede utilizarse en solución (Formalina) o al estado gaseoso como gas (formol) para
desinfectar ambientes de trabajo (aire). Al mezclar Permanganato de potasio (1 parte) con Formalina (2 partes),
se libera gas formol que es altamente bactericida y virucida.
Eiminación de virus
La velocidad de inactivación de los virus se relaciona con la concentración del agente y la duración de la
exposición. Los agentes inactivantes de virus son el formaldehído, la luz ultravioleta, la hidroxilamina y los
elementos radioactivos.
Los agentes activos contra las proteínas virales son calor, enzimas proteolíticas, ácidos débiles, luz
ultravioleta, compuestos sulfhidrilos y detergentes. Los agentes lipotróficos virales son solventes (como el
cloroformo)
10. ÁCIDOS Y ALCALIS: A pH extremos los microorganismos se inactivan. Sin embargo, algunos microorganismos
toleran pH muy extremos. Esto presenta utilidad, por ejemplo, para detectar M. tuberculosis al resistir pH básico
(álcalis). Las sustancias químicas que alteran el pH son utilizados principalmente para la preservación de otros
compuestos químicos, como los alimentos en la industria alimentaria. Ejemplos:
- Ácido benzoico - Refrescos, alimentos ácidos

- Ácido sórbico - Quesos
- Propionato cálcico - Pan

TRABAJO PRACTICO 8
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES QUIMICOS

DE CONTROL
de microorganismos
1. Efecto de desinfectantes de superficies. Utilizando 4 placas de agar tripticasa de soya, los estudiantes deben
dividir, utilizando un marcador, cada placa en dos partes.
Placa 1. En la primera mitad sembrar una muestra obtenida con una tórula humedecida con agua destilada
estéril, que se ha pasado por una superficie “sucia”. En la segunda mitad sembrar una muestra obtenida a
partir de una superficie que ha sido desinfectada previamente por cloro (deje actuar el cloro por 5 minutos)
Placa 2. En la tercera mitad sembrar una muestra obtenida a partir de una superficie que ha sido
desinfectada previamente con cloro (deje actuar el cloro por 10 minutos) y en la cuarta mitad sembrar una
muestra obtenida a partir de una superficie desinfectada previamente con cloro que ha actuado por 15
minutos. Incubar las palcas a 37°C por 24 h.
Placa 3. En la primera mitad sembrar una muestra obtenida con una tórula humedecida con agua destilada
estéril, que se ha pasado por una superficie “sucia”. En la segunda mitad sembrar una muestra obtenida a
partir de una superficie que ha sido desinfectada previamente por desinfectante en aerosol tipo “Lysoform”
(deje actuar por 5 minutos)
Placa 4. En la tercera mitad sembrar una muestra obtenida a partir de una superficie que ha sido
desinfectada previamente con el aerosol (deje actuar por 10 minutos) y en la cuarta mitad sembrar una
muestra obtenida a partir de una superficie desinfectada previamente con el aerosol que ha actuado por 15
minutos. Incubar las placas a 35-37°C por 24 h.
2. Desinfección (antisepsia) corporal. Utilizando 4 placas de agar sangre, los estudiantes deben dividir,
utilizando un marcador, cada placa en dos partes.
Para determinar el efecto de antisépticos sobre la microbiota normal del cuerpo, se debe realizar el mismo
procedimiento descrito previamente, seleccionando una superficie, tomando la muestra y retomando
posterior a la aplicación de alcohol gel sobre una superficie corporal y de solución de clorhexidina.
Posteriormente incubar a 35-37°C por 24 h.

TRABAJO PRÁCTICO 9
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES QUIMICOS

DE CONTROL. PARTE II
de microorganismos
1. Revisión de resultados: los estudiantes deben documentar los resultados obtenidos
2. Los estudiantes deben realizar un análisis de los resultados obtenidos y confeccionar reporte

AGENTES ANTIBACTERIANOS
Los antibióticos son productos naturales de hongos, actinomicetos o bacterias, capaces de matar a los
microorganismos o de inhibir su crecimiento. La producción de antibióticos se asocia en particular con
microorganismos del suelo presentes en la naturaleza que, al parecer, proporcionan una ventaja selectiva a esos
microbios en su competencia por el espacio y los nutrientes. Aunque la mayoría de los agentes antibacterianos y
antimicóticos, usados hoy día en clínica, proceden de productos naturales de la fermentación y, la mayor parte
de ellos, son modificados químicamente para mejorar sus propiedades antibacterianas y/o farmacológicas. Sin
embargo, otros antibacterianos son completamente sintéticos, como las sulfamidas y las quinolonas. Así pues, el
término “antibacteriano” se usa con frecuencia en vez del término “antibiótico” que hace alusión
exclusivamente al compuesto de síntesis natural.
A. Espectro de actividad antibacteriana.

Cada agente antibacteriano puede actuar solamente sobre un determinado número de especies bacterianas,
de tal manera que su utilidad clínica se dirige a las infecciones producidas por ese grupo de microorganismos. El
conjunto de especies bacterianas que pueden ser inhibidas o muertas por un agente antibacteriano (que son
susceptibles al antibacteriano) constituye el espectro de actividad antibacteriana, para ese agente en particular.
Generalmente, se acepta que los antibacterianos que actúan sólo sobre bacterias Gram-positivas, o bien
solamente sobre Gram-negativas poseen espectro antibacteriano reducido. En cambio, aquellos que pueden
actuar sobre especies de ambos grupos de microorganismos poseen amplio espectro antibacteriano. Es
importante comprender que esta clasificación de espectro antibacteriano se relaciona a la tendencia del
compuesto para actuar preferentemente sobre uno o los dos grupos bacterianos definidos por la tinción de
Gram.
B. Tipo de actividad antibacteriana.

Los antibacterianos pueden inhibir el desarrollo bacteriano (actividad bacteriostática) o matar
microorganismos (actividad bactericida). En el laboratorio se expresa la actividad inhibitoria de estos
compuestos a través de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la actividad bactericida a través de la
concentración mínima bactericida (CMB). La primera (CMI) se define como la concentración más baja de
antibacteriano que es capaz de inhibir el crecimiento o desarrollo de una cepa bacteriana, y la segunda (CMB),
como la menor concentración que produce la muerte del cultivo. Ambas concentraciones se pueden determinar
con relativa exactitud en el laboratorio y son frecuentemente utilizados para evaluar la actividad antibacteriana
de los compuestos antibacterianos.
Un antibacteriano tendrá mayor potencia en la medida en que sus CMI y CMB sean más bajas, es decir, que
las concentraciones requeridas para inhibir o matar una cepa bacteriana sean bajas. Cuando un agente
antibacteriano es administrado en el organismo como tratamiento de un proceso infeccioso, puede manifestar
una actividad bacteriostática o una bactericida sobre el agente etiológico. En el primer caso se denominan
compuestos bacteriostáticos y si pueden matar microorganismos in vivo se denominan bactericidas. El efecto
que produce el antimicrobiano in vivo es una consecuencia de la relación entre la CMI, la CMB y la concentración
de antibacteriano que se alcanza en el lugar de la infección. La mayor posibilidad de obtener un efecto
bactericida in vivo sobre una cepa bacteriana existe cuando la CMB del antibacteriano es muy baja, ya que es
posible que en el organismo se sobrepase dicha concentración.

Estudios de sensibilidad antimicrobiana:
Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana son métodos que determinan in vitro la sensibilidad de
los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.
En los diversos test de sensibilidad antimicrobiana, se utiliza la mínima concentración de antibiótico que
inhibe el crecimiento de un microorganismo in vitro (CIM) como parámetro para determinar susceptibilidad o
y/o resistencia de las bacterias a los agentes antibacterianos.
Susceptibilidad, significa que la concentración de antibacteriano necesaria para matar y/o inhibir es
alcanzada en el sitio de infección, por lo tanto la cepa bacteriana es posible eliminarla.
Resistencia, significa que la concentración de antibacteriano necesaria para matar y/o inhibir NO es
alcanzada en el sitio de infección, por lo tanto la cepa bacteriana NO es posible eliminarla.
a) Difusión en agar (por disco): También denominado antibiograma, este es un método cualitativo (Kirby Bauer)
que determina susceptibilidad. En este caso una bacteria pura se inocula en la superficie de una placa de agar y
se les pone a interaccionar con sensidiscos de antibacterianos (discos de papel impregnados con una
concentración conocida del antibiótico). Durante la incubación el antibiótico difunde desde el disco a través del
agar, de manera radial. La concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco y en el punto en
donde la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir el crecimiento de la bacteria en estudio
se produce una zona circular de inhibición del crecimiento bacteriano en torno al disco (halo de inhibición). El
diámetro del halo de inhibición permite clasificar la respuesta del microorganismo al antibiótico,
categorizándolo como susceptible (sensible), intermedio o resistente, de acuerdo a las tablas publicadas por el
CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Si las recomendaciones para realizar este método son fielmente
seguidas, las categorías S, I o R se correlacionan muy bien con los resultados de los otros métodos. Este método
es el más comúnmente usado.
b) Dilución en agar: Es considerado el método de referencia. Consiste en inocular placas conteniendo una
determinada concentración de un antibiótico con el microorganismo en estudio. Después de la incubación (16 a
18 horas), se examina si el microorganismo creció o no en cada una de las placas inoculadas, así se determina la
concentración inhibitoria mínima (CIM) para el antibiótico en estudio. Por ejemplo, si una cepa de S. aureus
crece en una placa que contiene una concentración de oxacilina de 0.06 μg/mL, pero no crece en una placa con
una concentración de oxacilina de 0.12 μg/mL, significa que la concentración mínima de oxacilina que se
requiere para inhibir a ese organismo es 0.12 μg/mL.
c) Dilución en caldo: Para este caso se utilizan tubos (macro dilución) o microplacas (micro dilución) que
contienen concentraciones crecientes de un determinado antibiótico. El microorganismo en estudio es
inoculado en los diferentes tubos o pocillos de la microplaca y la concentración inhibitoria mínima es
determinada después de la incubación, de la misma forma descrita anteriormente para el método de dilución en
agar.
d) E-test: Es un método más simple para obtener una CIM. Utiliza una tira de plástico que contiene
concentraciones crecientes de un determinado antibiótico que van desde 0.016 μg/mL hasta 256 μg/mL. Esta
tira se pone sobre una placa de agar que ha sido inoculada con el organismo en estudio. Después de incubar la

placa por 16 a 18 horas, se forma un área de inhibición en forma elíptica y la concentración inhibitoria mínima se
lee directamente. Este es el método de elección para hacer estudios de susceptibilidad en bacterias fastidiosas o
con requerimientos especiales, como por ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Haemophilus influenzae y bacterias anaeróbicas.
e) Métodos automatizados: en este momento existen varios sistemas que ofrecen distintos niveles de
automatización y que pueden ser usados por los laboratorios de microbiología para el estudio de
susceptibilidad. Los instrumentos en el mercado utilizan una medición turbidimétrica o fluorométrica para
detectar crecimiento bacteriano en un medio líquido. La mayoría de ellos utilizan el método de microdilución y
períodos de incubación menores que los habituales. Estos métodos son bastante confiables para el estudio de
enterobacterias y otras bacterias de crecimiento rápido, pero no son adecuados para microorganismos de
crecimiento lento o requerimientos especiales.

TRABAJO PRACTICO 10
AGENTES ANTIBACTERIANOS
 El estudiante es capaz de interpretar los resultados de la actividad antibacteriana in vitro de acuerdo a

las normativas CLSI.
1. Realización de antibiograma. En una placa de agar Mueller Hinton, sembrar un cultivo de Staphylococcus
aureus que posee concentración bacteriana de 0,5 Mac Farland (aprox 1 x 10 8 ufc/ml), utilizando la técnica
de tapiz bacteriano con tórula estéril. Posteriormente colocar 6 sensidiscos de antibacterianos con pinzas,
previamente esterilizadas con alcohol puro. Incubar a 35 -37°C por 18-24 h. Repetir el procedimiento para
Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae
Determinar la susceptibilidad de la misma forma anterior pero en una placa de agar Mueller Hinton/sangre
para Streptococcus pyogenes.
Sensidiscos a utilizar:
Gram negativo: ampicilina, amoxicilina/ácido clavulánico, cefadroxilo, ciprofloxacino, sulfatrimetoprin,
gentamicina
S. aureus: cloxacilina, cefuroxima, eritromicina, ciprofloxacino, sulfatrimetoprin, gentamicina
S. pyogenes: penicilina, cefuroxima, cefradina, eritromicina, ciprofloxacino, sulfatrimetoprin
Después de la incubación, analizar resultados y discuta con sus compañeros

TRABAJO PRACTICO 11
AGENTES ANTIBACTERIANOS. PARTE II
 El estudiante es capaz de interpretar los resultados de la actividad antibacteriana in vitro de acuerdo a

las normativas CLSI.
1. Los estudiantes revisan las placas y miden los halos de inhibición del crecimiento (deben medir diámetros en
milímetros, utilizando una regla - cada grupo debe llevar una regla)
2. Determinar susceptibilidad y/o resistencia utilizando tabla adjunta
3. Interpretar resultados

HALOS DE INHIBICION CLSI: ENERO 2014 M100-S24 Vol.34 N°1

El siguiente cuadro indica consideraciones explicativas

* Staphylococcus spp. **Staphylococcus coagulasa-negativa E: Enterococcus spp. H: Haemophilus spp.
A: Staphylococcus aureus St: Salmonella typhi, extraintestinal spp. Sv: Streptococcus grupo viridans Sb: Streptococcus Beta
$: Streptococcus pneumoniae P: Pseudomonas aeruginosa hemoliticos
L: Staphylococcus lugdunensis Ac: Acinetobacter spp. B: Burkholderia cepacia N: Neisseria gonorrhoeae
Sm: Stenotrophomonas maltophilia Eb: Enterobacteriaceae Nm: Neisseria meningitidis V: Vibrio cholerae
SDD Susceptible dependiente de la Dosis(dosis mayores a las normales)
NOTAS: Para Burkholderia cepacia sólo se informa CAZ y MRP En Salmonella spp. y Shigella spp. las Cefalosporinas de primera y segunda
Para Stenotrophomonas maltophilia sólo se informa LVX y SX generación pueden ser activas in vitro, no son efectivas clínicamente, por lo
Cloramfenicol no se informa en cepas del tracto urinario. que no deben informarse como S.
NOTAS: Klebsiella spp. y Escherichia coli que producen beta-lactamasa de espectro En cepas de LCR debe informarse CTX y CTR
extentido (BLEE), son clínicamente R a Penicilinas, Cefalosporinas o CFM no es aplicable a Morganella spp.
Aztreonam a pesar de ser S in vitro. CPR no es aplicable a Providencia spp. por dar S falsa.
NOTA: Cepas de Staphylococcus aureus resistente a los macrólidos y cepas de Después de la incubación, los microorganismos que no muestran
Staphylococcus spp. coagulasa negativo, pueden tener resistencia constitutiva o “aplanamiento “del halo de la Clindamicina deberían reportarse como
inducible a la Clindamicina; o pueden ser resistentes sólo a los macrólidos. “Clindamicina Susceptible”, por otra parte, aquellos que presentan
La resistencia inducida a la Clindamicina se puede detectar usando el Test de “aplanamiento” del halo dela Clindamicina adyacente al disco de Eritromicina
aproximación de discos, poniendo el disco de Clindamicina (2 mcg) entre 15 a 26 (REFERIDA COMO ZONA“D”) indica Resistencia Inducible a la Clindamicina.
mm del disco de Eritromicina (15 mcg), como procedimiento normal del método de Estas cepas deben informarse como “CLINDAMICINA RESISTENTE”.
difusión del disco.
PRINCIPALES NOVEDADES 2014: IMIPENEM: Cambian los valores de los Halos R-I-S con Acinetobacter spp.
CEFEPIME: Se introduce el rango SDD (susceptibilidad dependiente de la dosis). MEROPENEM: Cambian los valores de los Halos R-I-S con Acinetobacter spp.

UNIDAD DE APRENDIZAJE III
MICROBIOTA Y MICROORGANISMOS PATOGENOS
Distingue las características de la microbiota y de los microorganismos asociados a un proceso infeccioso
Sesión 13
Trabajo práctico 14. Seminario. Exposiciones
Sesión 14
Trabajo práctico 15. Seminario. Exposiciones

MICROBIOTA DEL CUERPO HUMANO
Los microorganismos no sólo están presentes en el ambiente que rodea al hombre, sino que se
encuentran en toda la biósfera, pues son ubicuos. La colonización microbiana del individuo comienza con el
nacimiento. Los primeros microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y
del área perineal hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño, al pasar por el canal de parto. Las
microbiotas características de otras áreas en el adulto se desarrollan posteriormente, y derivan y se seleccionan
de diversas fuentes ambientales.
La piel y mucosas hospedan a una gran variedad de bacterias que forman parte de la microbiota y se
pueden dividir en:
a) Microbiota residente. Son microorganismos relativamente fijos que se encuentran en un sitio anatómico
determinado. Si esta microbiota se trastorna rápidamente es restablecida. Son microorganismos comensales y
su permanencia en un área particular depende de factores como temperatura, humedad, nutrientes e
inhibidores.
b) Microbiota transitoria. Son microorganismos que se hospedan en la piel o mucosas en forma transitoria,
provienen del ambiente y no producen enfermedad a no ser que la microbiota residente sufra alteraciones. Si
esto sucede, la microbiota transitoria puede colonizar, proliferar y llegar a producir enfermedad.
Microbiota de la piel
La piel, debido a su constante exposición y contacto con el ambiente, es capaz de albergar muchos
microorganismos transitorios; sin embargo, existe una microbiota residente constante y bien definida,
diferenciándose entre los sitios anatómicos. Esto sucede por las condiciones de cada sitio, como la presencia de
secreciones, el hábito de llevar ropa, proximidad de las mucosas, etc. La sudoración abundante, el lavado y el
hábito de bañarse no eliminan ni modificar significativamente a la microbiota normal residente.
Algunos microorganismos de la piel son:

- Staphylococcus epidermidis
- Staphylococcus aureus (pequeña cantidad)
- Micrococcus spp.
- Streptococcus alfa y no hemolíticos
- Propionibacterium spp.
- Peptococcus spp.
- Otros microorganismos como Candida spp., Acinetobacter spp. entre otros, en personas que trabajan en el
área de la salud (microbiota transitoria).

Microbiota de la boca y vías respiratorias
Las mucosas de la boca y de la faringe son a menudo estériles al nacer, pero son colonizadas en el paso
por el canal vaginal. Entre 4 y 12 horas después del nacimiento se establecen Streptococcus del grupo viridans
como microbiota residente, junto con Staphylococcus spp., Neisseria spp. y difteroides, en términos generales
bacterias aerobias y anaerobias.
En la faringe, tráquea y fosas nasales se establece una microbiota similar. En los bronquios se
encuentran sólo algunas bacterias, pues bronquios y alvéolos se definen como normalmente estériles.
Algunos microorganismos de nasofaringe son:

- Difteroides
- Neisseria spp. (no patógenas)
- Streptococcus alfa hemolíticos
- Varias especies de bacterias anaerobias
Microbiota del Intestino

Al nacer el intestino es estéril y luego son introducidos microorganismos a través de alimentos y la saliva.
Microorganismos intestinales:
- Enterobacterias (en gran cantidad) (excepto Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Vibrio spp.,
Campylobacter spp.)
- Enterococcus spp.
- Streptococcus no hemolíticos
- Levaduras en escasa cantidad
- Anaerobios en gran número
Microbiota de la Uretra
La porción anterior de la uretra en ambos sexos contiene un número pequeño de los mismos tipos de
microorganismos hallados en piel y perineo.
Microbiota de la Vagina
Poco después del nacimiento aparecen en la vagina lactobacilos aerobios (bacilos de Doderlein) los
cuales permanecen durante gran parte de la vida manteniendo el pH vaginal ácido, cuando el pH se hace neutro
(etapa pre púber y post menopausia) aparecen cocos y se mantienen algunos lactobacilos. En etapas fértiles
existe un predominio de Lactobacilos que permiten mantener un pH entre 4 y 4,5, lo que permite una
protección contra microorganismos patógenos.
Microorganismos comensales de la vagina:
- Lactobacillus spp.
- Corynebacterium spp.
- Anaerobios

Microbiota del Ojo (conjuntiva)
Los microorganismos del ojo son preferentemente difteroides, Neisseria spp. (no patógenas). La microbiota de la
conjuntiva se mantiene normalmente regulada por el flujo de las lágrimas, ya que éstas contienen enzima
lisozima que posee acción antibacteriana.
Microorganismos comensales del ojo:

- Difteroides
- Neisseria ssp. (no patógenas)
- Haemophilus ssp. (no patógenos)
- Staphylococcus no hemolíticos
Es válido enfatizar que, en general, los anaerobios estrictos tienden a exceder en número a las formas
aerobias y facultativas, por un factor de 10 a 100 o más. Existe una permanente interacción tanto entre los
mismos componentes de la microbiota, como con el hospedador; esto conduce a fluctuaciones en la biota, tanto
cualitativamente como cuantitativamente, lo cual manifiesta efectos más o menos pronunciados en el
hospedador. Estos efectos pueden ser beneficiosos, inaparentes, o incluso, perjudiciales.
En otras zonas del cuerpo existen cantidades menores de microorganismos, a menudo en tránsito (como
el resto del aparato digestivo y respiratorio, la vejiga y el útero). El hallazgo de microorganismos patógenos en
estos sitios es altamente sugestivo de enfermedad, pero no constituye una prueba. En el otro extremo se
encuentran ciertos tejidos y órganos que son normalmente estériles, donde la presencia de microorganismos se
considera de importancia diagnóstica, por ejemplo: Sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido de cavidades
estériles (sinovial, pleural, etc.) y los tejidos profundos en general.
Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la microbiota y el hospedero. Sin

embargo este equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crítica

- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.
Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a una infección
endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades,
como:
- Deficiencia en el estado inmunitario del hospedero.

- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugías.
- Uso de antibióticos.
Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:

- Infección urinaria por Enterobacterias.
- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)
- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibióticos, entre otras

TRABAJO PRACTICO 12 y 13
MICROBIOTA NORMAL Y MICROORGANISMOS
PATÓGENOS
 El estudiante es capaz de distinguir las características de la microbiota respecto de los microorganismos

asociados a un proceso infeccioso relacionado con su quehacer profesional
A partir de los casos y/o revisiones que le ha entregado su profesor, busque información y confeccione una
presentación para ser expuesta oralmente frente a sus compañeros.
Esta actividad será evaluada a través de una rúbrica.

UNIDAD DE APRENDIZAJE IV
MICROORGANISMOS EUCARIONTES
Reconoce hongos y parásitos a partir de muestras macroscópicas y/o microscópicas, según parámetros
morfológicos clásicos de identificación
Esta unidad se desarrollará en 2 sesiones de laboratorio que incluirá las siguientes actividades:
Sesión 15
Trabajo práctico 14. Observación y análisis de diversas muestras de hongos
Sesión 16
Trabajo práctico 15. Observación y análisis de diversas muestras de parásitos

HONGOS
Los hongos son organismos eucariontes. El cuerpo o talo de los hongos puede ser unicelular o pluricelular.
Figura 30. Esquema de características macroscópicas de los hongos
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo contenido en
glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y se incuban a 25-30ºC. El tiempo de incubación varía de
acuerdo a la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales 48 horas aprox., hongos dermatofitos 15-30 días).
HONGOS UNICELULARES (LEVADURAS)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente por
yemación. Los criterios usados para el diagnóstico son fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y
microscópicos).
Existen varias levaduras de importancia clínica, entre ellas están las que pertenecen al género Candida.
De las especies de este género, Candida albicans es la más frecuentemente aislada desde muestras clínicas. Su
identificación se basa en criterios fisiológicos y escasamente en criterios morfológicos. El estudio morfológico de
las levaduras permite “orientar” o “aproximar” hacia el género, pero la identificación definitiva se hace siempre
sobre la base de pruebas bioquímicas.
Las pruebas de identificación de levaduras pueden agruparse en dos categorías:

Pruebas morfológicas
a) Aspecto de las colonias
b) Observación microscópica de su forma y presencia de ascosporas
Pruebas fisiológicas
a) Temperatura máxima de crecimiento
b) Crecimiento en presencia de cicloheximida
c) Capacidad de utilizar diversos compuestos como única fuente de carbono en condiciones de aerobiosis
d) Capacidad de fermentación de diversos azúcares
e) Capacidad de utilización de diversos compuestos como fuente única de nitrógeno
f) Actividad ureasa
g) Capacidad de crecimiento con altas concentraciones de glucosa
Candida albicans
Levadura capaz de filamentar (pseudohifas). Su identificación se basa en la capacidad de formar un talo
germinativo al ser incubada a 37°C en plasma humano durante 3-4 horas.
- Aspecto macroscópico: Colonias blancas, cremosas, brillantes.
- Aspecto microscópico: Células ovoides y presencia de pseudomicelios
- Importancia clínica: De las variadas especies de Candida spp. sólo unas pocas se consideran importantes como
patógenos humanos, siendo Candida albicans la que con mayor frecuencia se relaciona con infecciones en
humanos, desde un simple compromiso superficial de la piel y las mucosas hasta cuadros profundos del tipo
invasivo en pacientes inmunocomprometidos.
HONGOS FILAMENTOSOS
La identificación de los hongos filamentosos está basada principalmente en las características macro y
microscópicas de las colonias. Entre estas, la morfología microscópica de los cultivos es la que proporciona los
datos más importantes: el grosor de los filamentos, el tipo y la distribución de los septos, y, sobre todo, la forma,
el tamaño y la disposición de las esporas y de las estructuras formadoras de éstas. Entre los hongos filamentosos
la cantidad y tipo de esporas son muy variables, y están afectadas por diferentes factores, como el tipo de medio
y las condiciones de cultivo. A fin de conseguir unas condiciones óptimas de esporulación, es de gran
importancia “ofrecer” al hongo las mejores condiciones de crecimiento posibles.
Los principales métodos aplicados para la observación microscópica de los cultivos son: la observación
en fresco, con una solución adecuada y las preparaciones en cinta adhesiva. Los cultivos observados según estos
métodos resultan útiles en la mayoría de los casos para identificar las especies, pero en muchas ocasiones no
permiten revelar las principales características morfológicas de una especie determinada. En estos casos es
necesario recurrir a un tipo de preparación más compleja, como es la realización de microcultivos o cultivos en
portaobjetos.
Los hongos filamentosos pueden ser:

- sifonados o no septados (hongos inferiores)
- septados o tabicados (hongos superiores)
Los hongos sifonados son generalmente multinucleados (Ej. Mucor spp.) y los hongos septados presentan hifas
con tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (Ej. Aspergillus spp., Microsporum spp.,
Trichophyton spp., entre otros).
Hongos sifonados (Mucor spp.)

- Aspecto macroscópico: Presentan micelio algodonoso.
- Aspecto microscópico: Presencia de hifas especializadas (esporangióforo) que sostiene a una estructura
esférica (esporangio) dentro de la cual se producen las esporas (endoesporas).
- Importancia clínica: La mucormicosis es el modelo de enfermedad por hongos oportunistas (cuando las
condiciones del hospedero favorecen su desarrollo). Se presenta en las formas clínicas rinocraneal, pulmonar,
gastrointestinal y diseminada.

Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (Ej. Penicillium spp.), como patógenos
oportunistas (Ej. Aspergillus spp.) y como patógenos (Ej. Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton
spp.)
Penicillium spp.
Se le considera un contaminante ambiental, se desarrolla en 3-4 días.
- Aspecto macroscópico: Colonias verde-azuladas o verde amarillas. Su superficie es aterciopelada, lanosa,
estriada o lisa, con el reverso incoloro o amarillo.
- Aspecto microscópico: Presenta hifas septadas de las que se origina una prolongación (conidióforo) que en su
extremo distal presenta células conidiogénicas con forma de botella (fiálides). Las fiálides producen los conidios
(espora asexuada externa) que tienen forma redondeada y los que se disponen en cadenas.
Aspergillus spp.
Hongo patógeno oportunista de crecimiento rápido (aprox. 48 horas).
- Aspecto macroscópico: Colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas, coloreadas (crema, verde, café y
negras).
- Aspecto microscópico: Presenta hifas septadas de las que nace una prolongación no septada (conidióforo), el
cual se dilata en su extremo distal (vesícula) rodeándose allí de células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides
producen conidios, los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce
como “cabeza aspergilar”.
- Importancia Clínica: El género Aspergillus puede producir reacciones alérgicas por la inhalación de sus esporas;
colonización de vías aéreas; invasión de tejidos en sujetos con enfermedades de base.
Dermatofitos
Hongos patógenos agrupados en tres géneros (Microsporum, Trichophyton y Epidermophyton) que
producen lesiones de piel, pelo y uñas. Son hongos filamentosos septados, queratofílicos, de ramificaciones
hialínicas de desarrollo lento (15-30 días).
- Aspecto macroscópico: Colonias algodonosas pulverulentas o céreas. Color según la especie (blanco. beige,
amarillo, etc.) Con o sin producción de pigmentos que difunden en el medio de cultivo.
- Aspecto microscópico: Los diversos géneros pueden presentar hifas en bambú, en raqueta de tenis, en espiral,
etc. Las esporas externas pueden presentarse como microconidias (conidias pequeñas) que nacen a lo largo de
la hifa y como macroconidias (conidias de gran tamaño).
Métodos de observación de hongos
El examen microscópico de muestras para estudio de hongos tiene una gran utilidad. El sembrado en medios de
cultivo para aislamiento de especies micóticas puede o no ser útil, ya que no siempre resulta positivo cuando la
observación directa es positiva.

Método del KOH
Este tratamiento tiene por objetivo destruir gran parte de la estructura tisular, manteniendo inalterable a los
hongos, lo cual facilita su observación al microscopio.
- Colocar unas gotas de KOH (con o sin tinta Parker) en un portaobjetos
- Colocar la muestra en el líquido y mezclar cuidadosamente
- Calentar suavemente al mechero sin hervir. La formación previa de burbujas de gas indica que se aproxima
el momento de suspender el calentamiento.
- Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con aumento menor (10x) y luego 40x
Observación de cultivos
Es importante examinar los cultivos en la medida en que se están formando porque esto facilita la observación
de sus estructuras reproductivas características.
1. Suspensión en lactofenol.
Colocar gotas de lactofenol en portaobjetos con asa de metal sacar una pequeña porción de la colonia y
colocar en el lactofenol. Con dos asas metálicas, separar y extender suavemente la masa micelial y colocar
cubreobjetos. Observar, con bajo aumento, cambiando a aumento mayor. Lamentablemente este método
no preserva la estructura y posición de conidias, esporas y similares. Sin embargo, es un método que debe
efectuarse.
2. Técnica del celofán o cinta adhesiva.

Cortar un trocito de cinta adhesiva y formar un círculo con el pegamento hacia el exterior. Con una pinza
pegar sobre la superficie de la colonia del hongo y levantar. Luego abrir el círculo de cinta y colocarlo sobre
una gota de lactofenol en un portaobjetos de tal manera que se pegue al vidrio y observe al microscopio con
los aumentos correspondientes.
Figura 31. Diversidad de hongos, y estructuras fúngicas

PARASITOS
Se conocen como parásitos a los organismos que viven a expensas de otro individuo de distinta especie,
alimentándose de las sustancias que elabora o utilizándolo como nicho. Aunque pueden ser perjudiciales, no
llegan a causar la muerte. El término parásito, debido a que hace referencia a una forma de vida y no a una
clasificación taxonómica, engloba a una gran cantidad de especies muy diversas entre sí.
Para fines clínicos, se agrupan en Protozoos (organismos unicelulares eucariontes que no poseen pared
externa), Helmintos (gusanos) y Artrópodos. No todos los protozoos, gusanos o artrópodos son definidos como
parásitos, ya que ser clasificados como parásitos depende de la interacción con un hospedador y de las
consecuencias de su ciclo infectivo.
En los ciclos de vida indirectos o heteroxénicos, los parásitos necesitan pasar por dos o más hospederos
de distintas especies para alcanzar su pleno desarrollo. El hospedador infectado elimina al medio ambiente las
formas infectantes, por fecalismo llegan al hospedador intermediario, en éste se desarrolla un estado larval o
metacéstodo en los tejidos y llega al huésped susceptible a través del carnivorismo.
CICLO BIOLÓGICO DE UN PARASITO
El conjunto de etapas y transformaciones que experimenta un organismo superior durante su desarrollo,

se conoce como ciclo de vida o ciclo biológico. Estos ciclos, en parásitos, pueden ser directos (o monoxénicos), si
el parásito requiere de un solo hospedero para todo su desarrollo, o indirectos (o heteroxénicos) si necesita dos
o más hospederos.
Figura 32. Ciclos biológicos de parásitos

HOSPEDADOR: Se denomina hospedador al ser vivo que alberga un parásito y podemos distinguir:
• Definitivo: En el cual el parásito alcanza su madurez sexual y se reproduce
• Intermediario: Alberga las formas larvales de los parásitos y se desarrolla parte de su ciclo biológico
• Paraténico: Aquél que transporta al parásito, pero en él no se desarrolla ninguna etapa del ciclo biológico
CLASIFICACION DE LOS PARÁSITOS

TRABAJO PRACTICO 14
 El estudiante es capaz de reconocer algunos hongos a partir de la caracterización macro y microscópica

de sus estructuras.
1. A partir de diversas placas que tienen especímenes fúngicos, realice un análisis de las siguientes
características:
Tamaño de colonias
Aspecto de las colonias
Características relevantes
2. A partir de diversas preparaciones microscópicas, observe al microscopio y dibuje lo observado.
3. Documente sus resultados en el reporte correspondiente
microscopio.

TRABAJO PRACTICO 15
 El estudiante es capaz de reconocer algunos parásitos a partir de la caracterización macro y

microscópica de sus estructuras.
1. A partir de preparaciones microscópicas comerciales, cada grupo deberá seleccionar muestras de parásitos
y muestras de artrópodos. Las muestras deberán ser observadas en el microscopio e inmediatamente
dibujadas, en su reporte deberá incluir las estructuras más importantes observadas a través del microscopio
(3 por cada muestra).
2. A partir de especímenes macroscópicos de parásitos disponibles en el laboratorio, realice observación a ojo

desnudo y/o con la ayuda de una lupa. Dibuje y documente sus resultados en el reporte correspondiente
microscopio.

BIBLIOGRAFIA
Casanova, Egon R. (2006). Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Revista médica de Chile, 134(9), 1200-
1202. Recuperado el día 30 de enero de 2015, de http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-
98872006000900018&lng=es&tlng=es. 10.4067/S0034-98872006000900018.
Gamazo, C., Lopez-Goñi, I., Díaz, R. (2005) Manual Práctico de Microbiología. Editorial Masson. Barcelona.
García Martos P., Paredes Salido F., Fernández del Barrio. (1994). Microbiología Clínica Práctica. Segunda
edición. Servicio de Publicaciones de la Universidad de Cádiz. 482 páginas
García Saavedra M. J., Vicente García J. C. (2003). Técnicas de descontaminación: Limpieza, desinfección,
esterilización. Editorial Paraninfo. 251 páginas
Koneman E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger P.C., Winn W.C. (2008) Diagnóstico Microbiológico.
Texto y Atlas color. Sexta edición. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana.
Montiel F., Lam, M. (2001). Manual de Microbiología Clínica. Santiago. Publicaciones Técnicas Mediterráneo
Ltda.
Negroni M. (2009). Microbiología Estomatológica. Fundamentos y Guía Práctica. Segunda edición. Buenos Aires.
Editorial Médica Panamericana

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FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y QUIMICAS

Laboratorio de Microbiología General

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

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NORMATIVAS GENERALES EN EL TRABAJO

 Está estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio.

 Antes de abandonar el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.

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PRINCIPIOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO

REGLAS GENERALES PARA EVITAR RIESGOS

II. Riesgos Químicos.

III. Riesgos Microbianos.

DCBQ-DBIO1020 V7.0-201910 Página 3 de 73

ESTRUCTURA Y CRECIMIENTO BACTERIANO

 Describe morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana en preparaciones microscópicas de

Esta unidad se desarrollará en 6 sesiones que incluirá las siguientes actividades:

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DCBQ-DBIO1020 V7.0-201910 Página 5 de 73

PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABAJO MICROBIOLÓGICO

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j) Horno Poupinel o Pasteur:

Figura 2. Mechero de Bunsen. A) Nombres de sus partes; B) Tipos de llama.

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Figura 3. Medios de cultivos sólidos

Figura 4. Autoclave. A) Vista exterior; B) Esquema de funcionamiento

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Figura 5. A) Horno Pasteur (Poupinel); B) Cámara de anaerobiosis

Figura 6. Microscopio Óptico Compuesto

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El microscopio óptico compuesto se conforma de los siguientes sistemas:

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

4. Realizar el enfoque de acuerdo a los siguientes pasos:

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5. Observación con objetivo de inmersión:

- Bajar totalmente la platina

- Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz

- Terminar de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión (100x)

- Enfocar cuidadosamente con el micrométrico

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BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Y MATERIALES DE TRABAJO

Actividades a desarrollar en la sesión práctica

 Se refuerza el manejo del microscopio óptico.

 Se refuerzan los conceptos de esterilidad y buen manejo del material de laboratorio.

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OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE BACTERIAS. COLONIAS BACTERIANAS

La observación macroscópica de bacterias es un examen visual de las colonias, en el cual se puede

Figura 12. Características macroscópicas de colonias bacterianas

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Colonias secas (opacas) Colonias húmedas (brillantes)

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ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS

 El estudiante deberá ser capaz de describir características macroscópicas de colonias bacterianas.

Actividades a desarrollar en la sesión práctica

NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio

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A. Observación de bacterias vivas

Figura 15. Micrografía de Treponema pallidum en campo oscuro

B. Observación de bacterias (muertas)

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