Capitulo4 Columnas

Columnas Cromatográficas
4 - Columnas cromatográficas
4.-
4.1. Dimensiones de columnas
4.2. Materiales de las columnas
4.2.1. Soportes sólidos
4.2.2. Fases estacionarias líquidas
4.2.3. Fases estacionarias sólidas
4.3. Instalación de la columna
4.4. Acondicionamiento de la
l columna
l
4.5. Teoría de cromatografía de gases
4 5 1 Resolución de la columna.
4.5.1. columna Selectividad y eficiencia
4.5.2. Relación de partición y eficiencia del recubrimiento
4.-
l columna
l
Diámetro
Longitud interno
COLUMNAS (ID) Material
(m)
(mm)
más empleado
inerte y rígido
Vidrio
Acero A veces se
EMPAQUETADAS 1–5 2–4 inoxidable
utilizan
recubrimientos
de Teflon
(material
Sílice inerte)
fundida
recubierta
bi t
Flexibles y
CAPILARES 10 - 100 0.1 – 0.8 poliamida fuertes
Metálicas mecánicamente
Rellena imperfecciones y refuerza

Dimensiones de columnas
Diámetro interno de columna
0.25 mm: para inyecciones split/spliless o inyección

on-column.
.
0.32 mm:
mm ppara inyección
y splitless
p o inyección
y on-
column cuando se necesitan analizar muestras más
concentradas.
concentradas
0.53 mm: para separar mezclas poco complejas
4.-
l columna
l
Componentes de columna
Requisitos
Estabilidad térmica – Las temperaturas de análisis no
han de descomponer los materiales de la columna.
Estabilidad química – Materiales inertes, libres de
centros activos.
Los materiales han de ser de calidad cromatográfica
Relleno
Fase líquida GLC
Soporte sólido +
Sólid poroso
Sólido GSC
Columna empaquetada
poliamida
p m
tubo de
sílice
f
fase
estacionaria Columna capilar
pared
p d tubular
t b l soporte
t
100-530 µm sílice fundida adsorbente
poroso
fase
fase líquida
líquida
WCOT PLOT SCOT
Componentes de columna empaquetadas
Soporte sólido
Incrementa el área superficial ( 0,5-10 m2 g-1)
El soporte sólido
Compuesto de partículas pequeñas de tamaño
sirve de base para uniforme (microporos regulares ~ 1 µm) y poca
la fase estacionaria resistencia mecánica
No interfiere con la muestra
Tamaño de Intervalo de
malla Existen tamaños de malla estándar
diámetro medio
(µm) Se emplea
p universalmente tierra de diatomeas
60/80 177-260 la serie Chromosorb es la más popular
80/100 149-177
Soportes Descripción
100/120 125 149
125-149 sólidos
ólid
ChromasorbTM
120/140 105-125
P Rosa, el menos inerte, mayor
eficiencia
W Blanco, más inerte, pero menos
eficiente que P. Para drogas,
pesticidas y bioquímicos.
bioquímicos
G Menor área superficial, más inerte
y más fuerte que W. Uso general.
Silanización
(desactivación de la superficie)
Lavado con ácidos fuertes para eliminar los metales.
Tratamiento químico (DMCS, TMCS)

R SiOH + (CH3)2SiCl2
R-SiOH R SiOSi(CH3)2Cl + HCl
R-SiOSi(CH
R-SiOSi(CH3)2Cl + CH3OH R-SiOSi(CH)2OCH3 + HCl

Los grupos funcionales metilo reemplazan a los grupos alcohol.
GLC GSC
Fases líquidas Adsorbentes sólidos
Son líquidos no volátiles que cubren de forma Adsorbentes porosos. Gel de sílice, óxido de
uniforme el soporte sólido. aluminio, tamiz molecular.

La cantidad recomendada es del 2% al 10% en peso. Menor número de centros de adsorción en el
La composición química es diferente a la del soporte sólido que causen colas.
soporte sólido.
sólido
No hay fase líquida que produzca sangrado.
FE
líquida GSC se emplea, principalmente, para análisis de
Sólido Tubo
inerte capilar muestras gaseosas.
poroso material
inerte
P
Para minimizar
i i i lla pérdida
é did dde f
fase lí
líquida
id
por volatilización:
Las cadenas Las cadenas

poliméricas se poliméricas se ligan
entrecruzan químicamente
Fases estacionarias líquidas

La elección de una fase determina la selectividad de la columna
Con muchas fases se obtiene la misma separación – las diferencias

en polaridad son mínimas. Una misma fase estacionaria puede
tener diferentes nomenclaturas.
Existen cientos de fases disponibles

(especialmente, en columnas empaquetadas)
La selección de la fase estacionaria para las

columnas capilares es más sencilla
“Semejante disuelve semejante”
Se emplean fases polares para componentes polares.

polares
Se emplean fases no polares para componentes no polares.

SILICONAS (polisiloxanos) las más empleadas en CG. Cubren
una amplia gama de polaridades y propiedades químicas diversas.
P á ti
Prácticamente,t cualquier
l i radical
di l orgánico
á i o inorgánico
i á i se puede
d
ligar a la cadena polimérica
CH3 R1 CH3
H3C Si O Si O Si CH3 R1, R2 = radical orgánico
CH3 R2 CH3
n
Polietilenglicol HO-[CH2-O-CH2-O]-H
Sustitución de la cadena
La cantidad y el tipo de
100% metil
sustitución determina el tipo de 5% fenil
fase
fase. 6% cianopropilfenil
20% fenil
Un aumento de la sustitución
polarridad
35% fenil
disminuye la estabilidad térmica. 14% cianopropilfenil
p p
50% fenil
Para incrementar la polaridad 65% fenil
p
se emplean sustituciones fenilo,, 40-50% trifluoropropil
p p
50% cianopropilfenil-
cianopropilo, cianopropilfenil, Polietilengicol (PEG)
trifluoropropilo… 50% cianopropil
80% cianopropil
Las fases enlazadas y
100% cianopropil
entrecruzadas favorecen la
estabilidad térmica.
Fases estacionarias líquidas comerciales

Composición y Columna empaquetada Columna capilar
descripción equivalentes equivalentes
100% metil sustitución OV 1, OV-101,
OV-1, OV 101, SP-2100,
SP 2100, DC-
DC DB 1, HP-1,
DB-1, HP 1, HP-101,
HP 101, Ultra-1,
Ultra 1,
La menos polar 200, UC-W982, S96, CP-SIL 5, SPB-1
SE-30
5% fenil,, 95% metil OV-3,, OV-73,, CP Sil 8 DB-5,, HP-2,, Ultra-2,, SPB-5,,
sustitución CP-Sil 8CB
6% cianopropilfenil, 94% DB-1301
metil sustitución
14% cianopropilfenil, 86% OV-1701 DB-1701, SPB-7, CP-Sil 19CB,
metil sustitución Rtx-1701
50% fenil,
e , 50% metil
et OV 7, OV
OV-17, OV-11,, OV
OV-22,, SP-
S DB-17,
7, HP-17,
7, RSL-400,
S 00, Rtx-
t
sustitución 2250, DC-710 50, PE-17, 007-17, SP-2250
Moderado incremento de la
polaridad. Drogas, pesticidas,
bi
bioquímicos.
í i
Fase estacionaria en orden de menor a mayor polaridad

Fases estacionarias líquidas comerciales

Composición y Columna empaquetada Columna capilar
descripción equivalentes equivalentes
50% trifluoropropil
trifluoropropil, 50% OV-210,
OV 210 OV
OV-202,
202 OV
OV-2150,
2150 DB 210 RSL
DB-210, RSL-500,
500 SP
SP-2501
2501
metil sustitución QF-1, SP-2401
Moderada polaridad.
Farmacéuticos
50% cianopropilfenil OV-225, Silar 5 CP DB-225, HP-225, SP-2330,
50% metil sustitución. CP-Sil 43CB, RSL-500
Elevada polaridad.
Polietilenglicol. Carbowax 20M, Súperos, DB-WAX, HP-20M,
Elevada polaridad. Alcohol, Supelcowax 10, PEG Supelcowax 10, CP-WAX 52
fenol, enlaces de hidrógeno. CB, Súperos II
Polietilenglicol. OV-351, FFAP, Carbowax DB-FFAP, HP-FFAP, Nukol,
Modificado con ácido. 20M-ácido tereftálico Súperos FA, Stabilwax-DA
50% cianopropil, 50% metil SP-2310, SP-2330, CP-SIL 58 DB-23, SP-2330, Rtx-2330,
sustitución. PE-CPS-1, 007-CPS-1
Fase estacionaria en orden de menor a mayor polaridad
Sangrado de columna
Aparece como una señal de ruido de fondo en
el detector. El sangrado se produce por la Ácidos Bases fuertes
fuertes
descomposición de la fase estacionaria.
estacionaria
HCl KOH
El sangrado aumenta con el espesor de la H2SO4 NaOH
H3PO4 NH4OH
c p ell diám
capa, diámetro
tr dde lla c
columna,
lumn lal longitud
l n itud y lla HNO3
temperatura. Evitar usar ácidos y bases fuertes

Límite inferior: la fase adquiere propiedades de un
sólido, es menos eficiente pero a cambio no resulta
dañada.
Límite superior
p isotérmico: es la temperatura
p
máxima recomendada para una operación isotérmica.
Límite superior en programación: debería de
alcanzarse sólo por periodos cortos de tiempo,
normalmente 2020°CC por encima del límite isotérmico.
isotérmico
Las columnas polares sufren más sangrado.
Elección de una fase estacionaria líquida

Polaridad de la fase estacionaria semejante a los
compuestos a analizar.
Las columnas con fase no ppolar duran más.
Elegir la fase menos polar con la que se obtenga una
separación adecuado.
De
D forma
f m generall en GC, GC ses elige
li una fase
f s ligeramente
li m t
polar (5% fenilsilicona: DB-5, SPB-5, HP-5,…)
Evitar fases que contengan elementos que den respuesta en
el detector (p.ej. fases que contengan flúor deben evitarse
con ECD, fases con cianopropil deben evitarse con NPD).
Emplear fases de polietilenglicol para muestras que posean
enlaces de hidrógeno (polares).
Para análisis de gases es más adecuada una fase
estacionaria sólida.
Fases estacionarias sólidas
Adsorbentes sólidos
GSC se emplea,
p ,p principalmente,
p ,p
para muestras g gaseosas.
Menor número de centros de adsorción en el soporte sólido que causen
colas. Además, no hay fase líquida, por tanto no se produce sangrado.
Material Aplicación
Carbón Mezclas gaseosas,
hidrocarburos Polímeros porosos
Alúmina Mezclas gaseosas, C2, Porapak® y Hayesep®.
C3, C4 Etilvinilbenceno entrecruzado con
Gel de sílice Dióxido de carbono, divinilbenceno.
hidrocarburos Pueden modificarse mediante
Tamiz
T mi O2 , N2 , CH4 , CO copolimerización con monómeros
molecular polares.
Polímero Compuestos gaseosos Disponible en muchos tamaños de
poroso y polares
l poro y partícula.
tí l
4.-
l columna
l
Instalación de la columna
Instalación de la columna
Corte de la columna
Introducir la tuerca y la férrula en la columna.
Emplear una herramienta afilada de cortar.
I
Inspeccionar
i ell corte
t con una lupa.
l
La columna debe de introducirse a una longitud determinada que viene

especificada para cada inyector y detector.
detector
cm
4.-
l columna
l
Acondicionamiento de la columna
Acondicionamiento de la columna
En primer lugar hay que dejar circular el gas portador a través de la
columna durante 15-30 minutos.
Acondicionar con una rampa de temperatura lenta (5 (5°/min)
/min)
Acondicionamiento inicial ≥ 4 horas.
Si está contaminada,
contaminada se acondiciona a 20 °C
C por encima de la
temperatura máxima recomendada para la columna.
L temperatura
La t t normall de
d acondicionamiento
di i i t recomendada:
d d :
Tmax − Tapp
Tcond = + Tapp
2
Tcond = Temperatura
p de acondicionamiento
Tmax = Temperatura máxima recomendada para la columna
Tapp = Temperatura máxima requerida para el análisis
4.-
l columna
l
4.5.1. columna Selectividad y Eficiencia
Teoría de Cromatografía de Gases
Grado de separación entre dos picos

RESOLUCIÓN Medida de la anchura de pico y de la distancia entre picos
11.18
18 × ∆t R
R =
W1 + W2
∆tR= diferencia en los

tiempos de retención entre
los dos picos.
W1 y W2 = anchura de los
dos picos medida a la mitad
de sus alturas.
alturas
RESOLUCIÓN
Resolución de columnas Resolución de columnas

empaquetadas capilares
Con
C n las columnas
c lumnas capilares se obtiene
btiene una ma
mayorr
resolución que con las columnas empaquetadas.
RESOLUCIÓN
R= 1.0 los dos picos están separados un 98% de la línea de base.
R= 1.5 los dos picos están separados un 99.7% de la línea de base.
Forma del pico
La curva tipo Gauss es la ideal Distribución estadística de las moléculas

Selectividad Eficiencia
de la de la
Columna Columna
l
Resolución
Selectividad: capacidad de separar entre dos compuestos.
Eficiencia: medida del ensanchamiento del pico.

pico
de la de la
Columna Columna
l
Resolución
Selectividad: capacidad de distinguir entre dos compuestos.
Eficiencia: medida del ensanchamiento del pico.

pico
SELECTIVIDAD DE LA COLUMNA

tR2
α = α>1 la separación es posible.
t R1
SELECTIVIDAD DE LA COLUMNA
Factores que afectan:
Solubilidad frente a volatilidad.
Naturaleza química de la fase estacionaria.
Naturaleza química de los componentes de la muestra.
P ió d
Presión de vapor de
d los
l componentes.
t
de la de la
Columna Columna
l
Resolución

compuestos
Eficiencia:
Ef c enc a med
medida
da del ensancham
ensanchamiento
ento del p
pico.
co.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Eficiencia
Columna empaquetada
medida del Columna capilar
p
ensanchamiento
2
⎛t ⎞ ⎛ tR ⎞
2
N = 5 .54 ⎜ R ⎟ ´
del pico. ⎝W ⎠ N = 5 .54 ⎜ ⎟

⎜W
⎝ ⎠
t ´R = t R − t 0
N ó Neff = eficiencia t’R = tiempo de

tR =tiempo de retención retención ajustado
W = anchura del pico t0 = tiempo de
medida a la mitad de su retención de un pico
altura no retenido (pico
del aire)
Se expresa de forma cuantitativa como el número de platos.
N=L/H
Equilibrio vapor-líquido en la destilación.
Para la columna de destilación de la

figura el número de platos es tres
figura, tres.
Factores que influyen en la eficiencia de la columna
A. Difusión de Eddy (efecto no lineal).
B. Difusión longitudinal.
C Resistencia
C. R i t i a la
l transferencia
t f i de
d masa.
A. Difusión de Eddy (efecto no lineal)
o Depende del tamaño y forma del empaquetamiento, además de las

características en su fabricación.
o Despreciable para columnas capilares.

capilares
B. Difusión longitudinal
perfil de
perfil de
concentración
ó
concentración
inicial
después de la
difusión
o Difusión molecular en la fase gaseosa.
o Fuerte dependencia de la velocidad de flujo.

flujo
C. Resistencia a la transferencia de masa.
Fase Móvil
ó
concentración concentración
en equilibrio real
Fase Estacionaria
o Facilidad con la que se transfieren los componentes

de la fase gaseosa a la fase estacionaria.
o Fuerte
F t ddependencia
d i d
de lla velocidad
l id d dde fl
flujo
j y lla
cantidad de fase estacionaria.
B
Ecuación de Van Deemter HEPT = A + + Cµ
µ
Combina los tres efectos de ensanchamiento de picos.
HEPT: altura equivalente al plato teórico.

A= difusión de Eddy.
B= difusión
B fus ón longitudinal.
ong tu na .
C= resistencia a la transferencia de masa.
µ= velocidad lineal del gas portador.
Bajo HEPT = alta eficiencia de columna.
Se puede calcular si el número efectivo de platos es conocido:

L c ol siendo L = longitud de la columna.
HEPT = col
N eff
Gráficas de Van Deemter
A B o La gráfica determina la velocidad

lineal óptima.
p m .
µ µ o La ausencia de difusión de Eddy (A)

en las columnas
m capilares
p da lugar
g a la
obtención de un valor de HEPT bajo.
C
HEPT A difusión de Eddy
B difusión longitudinal
C resistencia a la transferencia de masa
µ µ µ gasto (ml/min)
HEPT (mm)
velocidad óptima (µ) HEPT N max R max

min
EFICIENCIA DE LA COLUMNA pico

d
de
aire
Ejemplo del cálculo de HEPT

minutos
Dado el cromatograma y que la longitud de la columna capilar es de 15 m.
1 . 18 × ∆ t ⎛ 120 s ⎞
R = R
= 1 . 18 ⎜⎜ = 11 . 8
W 1 + W 2 ⎝ (6 + 6 )s ⎠
2
⎛ t ´R ⎞ ⎛ 240 s ⎞
2
N effff = 5 . 54 ⎜ = 5 . 54 ⎜ = 8 . 864
⎜ W ⎝ 6 s ⎠
⎝ ⎠
t 300 s
α = R2 = = 1 .7
tR1 180 s
L c ol 1500 cm
HEPT = = = 0 . 17 cm
N eff 8 . 864
Neff se calcula normalmente en un pico que sea al menos 5

veces el tiempo de retención del “pico del aire”.
Relación de partición y eficiencia del recubrimiento
Eficiencia de recubrimiento
Comparación de la eficiencia de columna real con la eficiencia máxima teórica.
Neffreal o bien
bi HEPTteórico
CE% = ×100 CE% = × 100
Neffteórico HEPTreal
Capas delgadas presentan una mayor eficiencia de recubrimiento.
Las columnas no polares tienen normalmente una eficiencia de

recubrimiento del 90-100%.
Las columnas polares tienen normalmente una eficiencia de

recubrimiento del 60-80%.
Espesor de capa
Cantidad de recubrimiento de fase estacionaria
Capas de poco espesor dan lugar a una
Afecta a la retención y
mayor retención y capacidad. Se emplean
a la capacidad
p
para compuestos poco volátiles.
volátiles
Columnas Espesor de capa

Relación de fase
df
r Capilares 0.25 µm
β =
2 d f
Semicapilares 1.0 – 1.5 µm
r= radio de la columna en µm
df= espesor de
d capa en µm E
Empaquetadas
t d > 10 µm
Para lla misma

P i fase
f estacionaria,
t i i
β separación
columna, temperatura, y muestra:
Dimensiones de columnas
Capacidad de columna
La capacidad de columna es la máxima cantidad de muestra
que puede inyectarse en la columna sin que se produzca una
distorsión de pico significante.
significante
La capacidad de columna
Un exceso da lugar a:
se incrementa con:
o ensanchamiento de pico.
o espesor de capa (df).
) o asimetría (colas o frentes).
frentes)
o temperatura.
o diámetro interno (ID).
o selectividad de la fase
estacionaria.
Gaussiano Cola Frente
Relación de partición
Relación de tiempo en la fase estacionaria frente en la fase móvil
t R − t0
K ´=
t0
tR= tiempo de retención del compuesto

t0= tiempo
t empo de
del p
pico
co de a
aire
re
Eficiencia de recubrimiento
pico
Columna de 15 m,
calcular: de
aire
i 0 53 mm
0.53 mm,espesor
espesor
a.- la relación de fase de recubrimento
b.- la relación de partición minutos 0.25 µm
c.- la
l eficiencia
f de
d recubrimiento
b
Emplear la ecuación de Golay-Giddings r 265 µ m
para determinar HEPT teórico.
teórico
a.- β =
2 d
β =
2 ( 0 . 25 µ m )
= 530
f
11k ' 2 + 6 k '+ 1 t R − t0 6 min − 1 min

HEPT teórico =r
3(1 + k ' ) 2
b.- K ´ = k '= =5
t0 1 min
2
⎛ t ´R ⎞ ⎛ 300s ⎞
2
1500cm
c.- N = 5 .54 ⎜ Neff = 5.54⎜ = 13850 HEPTreal = = 0.11 cm
m
⎜W ⎝ 6.0 s ⎠ 13.850
⎝ ⎠
11 × 52 + (6 × 5) + 1 0.045cm
HEPTteórico = 0.0265cm = 0.045 cm CE% = ×100 = 41 %
3(1 + 5) 2 0.11cm
Características de una columna
RESUMEN
Columnas Columnas
empaquetadas capilares
Longitud 1-5 10-100 ID Capacidad

(m) (mm) de muestra
(ng)
Diámetro 2-4 0.1-0.8
interno 0.18 < 50
(
(mm))
Platos por 5-20 50-200
0.25 50-100
segundo
Platos por 4000-5000 20000-250000
0.32 400-500
columna
Eficiencia 1500 2500
1500-2500 3000 4000
3000-4000
0.53 103-2 103
(platos por
metro)
La mayor diferencia es la longitud de columna.
Los platos por metro para las columnas capilares es ligeramente
superior debido a la ausencia de la difusión de Eddy.

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Columnas Cromatográficas

Rellena imperfecciones y refuerza

Diámetro interno de columna

0.25 mm: para inyecciones split/spliless o inyección

Los materiales han de ser de calidad cromatográfica

Lavado con ácidos fuertes para eliminar los metales.

Tratamiento químico (DMCS, TMCS)

R-SiOSi(CH3)2Cl + CH3OH R-SiOSi(CH)2OCH3 + HCl

uniforme el soporte sólido. aluminio, tamiz molecular.

Las cadenas Las cadenas

Fases estacionarias líquidas

Con muchas fases se obtiene la misma separación – las diferencias

Existen cientos de fases disponibles

La selección de la fase estacionaria para las

“Semejante disuelve semejante”

Se emplean fases polares para componentes polares.

Fases estacionarias líquidas

Fases estacionarias líquidas comerciales

Fase estacionaria en orden de menor a mayor polaridad

Fases estacionarias líquidas comerciales

temperatura. Evitar usar ácidos y bases fuertes

Elección de una fase estacionaria líquida

La columna debe de introducirse a una longitud determinada que viene

Grado de separación entre dos picos

∆tR= diferencia en los

Resolución de columnas Resolución de columnas

R= 1.5 los dos picos están separados un 99.7% de la línea de base.

Forma del pico

La curva tipo Gauss es la ideal Distribución estadística de las moléculas

Selectividad: capacidad de separar entre dos compuestos.

Eficiencia: medida del ensanchamiento del pico.

Selectividad: capacidad de distinguir entre dos compuestos.

Eficiencia: medida del ensanchamiento del pico.

Selectividad: capacidad de distinguir entre dos compuestos.

Factores que afectan:

 Solubilidad frente a volatilidad.

Naturaleza química de la fase estacionaria.

Naturaleza química de los componentes de la muestra.

Selectividad: capacidad de distinguir entre dos compuestos.

del pico. ⎝W ⎠ N = 5 .54 ⎜ ⎟

N ó Neff = eficiencia t’R = tiempo de

Se expresa de forma cuantitativa como el número de platos.

Equilibrio vapor-líquido en la destilación.

Para la columna de destilación de la

Factores que influyen en la eficiencia de la columna

A. Difusión de Eddy (efecto no lineal).

Factores que influyen en la eficiencia de la columna

A. Difusión de Eddy (efecto no lineal)

o Depende del tamaño y forma del empaquetamiento, además de las

o Despreciable para columnas capilares.

Factores que influyen en la eficiencia de la columna

o Difusión molecular en la fase gaseosa.

o Fuerte dependencia de la velocidad de flujo.

Factores que influyen en la eficiencia de la columna

C. Resistencia a la transferencia de masa.

o Facilidad con la que se transfieren los componentes

 Combina los tres efectos de ensanchamiento de picos.

 HEPT: altura equivalente al plato teórico.

 Bajo HEPT = alta eficiencia de columna.

 Se puede calcular si el número efectivo de platos es conocido:

A B o La gráfica determina la velocidad

µ µ o La ausencia de difusión de Eddy (A)

velocidad óptima (µ) HEPT N max R max

Solubilidad frente a volatilidad.

Naturaleza química de la fase estacionaria.

Naturaleza química de los componentes de la muestra.

Combina los tres efectos de ensanchamiento de picos.

HEPT: altura equivalente al plato teórico.

Bajo HEPT = alta eficiencia de columna.

Se puede calcular si el número efectivo de platos es conocido: