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Biosensores y Bioelectrónica: X

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Nuevos biosensores electroquímicos para investigar las interacciones

entre atezolizumab y PD-1/PD-L1 y evaluar su
inhibidores de molécula pequeña

Juncheng Zou, Cong Li, Xinyue Zhang, Tao Huang, Nurmuhammat Kehriman, Wen Kuang, Xin
Hu, Youqi Yan, Xiaomei Ling*
El Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Naturales y Biomiméticos y la Escuela de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Pekín, Beijing, 100191, PR China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: La vía PD-1/PD-L1 juega un papel importante en la inmunoterapia tumoral. Se construyó un nuevo sensor electroquímico de
Interacción biosensor células de sobreexpresión inmovilizadas utilizando nanopartículas de grafeno-quitosano-Pt dopadas con N (NGR-CS-PtNP) y
electroquímico PD-1/PD-L1
polianilina (PANI) para investigar la interacción entre atezolizumab y células HEK293 que sobreexpresan las proteínas PD-1 o
Inhibidor del punto de control inmunitario
PD-L1. La constante de unión entre atezolizumab y las células PD-L1-HEK293 se calculó en 2,4× 107METRO−1. Usando este
Detección de drogas
método para seleccionar 18 componentes principales de la inyección de Aidi (ADI), se encontró que la constante de unión
Inhibidor de molécula pequeña
entre el ginsenósido Rg1 y las células PD-1-HEK293 era 9.9×104METRO−1. Luego, se construyó un nuevo inmunosensor
electroquímico utilizando nanopartículas de oro y ácido 11-mercaptoundecanoico (11-MUA). La constante de unión calculada
entre atezolizumab y la proteína PD-L1 purificada fue 6,11×109METRO−1y CI50
el valor fue de 2,73 ng/mL. Mientras tanto, con la concentración de ginsenósidos Rg1 aumentando a 20 μM, la tasa de
inhibición alcanzó un máximo, que fue de alrededor del 50%. La tecnología de detección electroquímica se utilizó
originalmente para investigar las interacciones entre atezolizumab y PD-1/PD-L1. Y utilizando los sensores novedosos
anteriores, los inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a PD-1/PD-L1 podrían examinarse y evaluarse en diferentes
niveles, lo que conduciría a resultados más precisos. Adicionalmente, los sensores electroquímicos requieren equipos simples,
bajos costos de materiales, acompañados de las ventajas de rapidez, sensibilidad y alta selectividad.

1. Introducción
La vía PD-1/PD-L1 es uno de los puntos de control inmunitarios inhibidores
más estudiados, que es un método importante de inmunoterapia tumoral. La
proteína PD-L1 expresada en las células tumorales puede unirse a la proteína PD-1
en la superficie de los linfocitos T, lo que inhibirá el efecto letal de los linfocitos T y
la secreción de citocinas IL-2, IFN-γ, etc.Pardoll 2012). Aunque existen algunos
inhibidores de anticuerpos monoclonales dirigidos a esta vía aprobados por la
FDA, no se pueden ignorar algunos problemas, como la incapacidad de tomar por
vía oral, grandes efectos secundarios inmunogénicos y altos costos de producción.
El desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas puede solucionar de forma
eficaz estos problemas. ADI es una inyección de medicina tradicional china que se
puede usar en combinación con quimioterapia o radioterapia para aumentar la
eficacia y reducir la toxicidad. Se ha informado que la inyección puede afectar el
sistema inmunológico y aumentar la proporción de linfocitos CD4+/CD8+ (Fan et
al., 2019). Mientras tanto, el astrágalo (Fu et al., 2014) y ginseng
(Ratán et al., 2021), que son ingredientes de ADI, han mostrado efectos
inmunomoduladores en experimentos farmacológicos. Sin embargo, las vías
de señalización específicas que ADI afecta en el sistema inmunitario no
están claras. Tampoco está claro si hay compuestos activos en ADI que
puedan actuar en la vía PD-1/PD-L1.
Los métodos de detección y evaluación actuales para los fármacos de
inmunoterapia tumoral dirigidos a PD-1/PD-L1 incluyen la tecnología de
fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) (Liu et al., 2016), ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Yim et al., 2020), resonancia de
plasmón superficial (SPR) (Wang et al., 2019), interferometría de biocapa (BLI) (Kim
et al., 2020), termoforesis a microescala (MST) (Abbas et al., 2019), fluorimetría
diferencial de barrido (DSF) (Ganesan et al., 2019), polarización de fluorescencia
(FP) (Shrestha et al., 2020), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)
(Konieczny et al., 2020), etc. Estos métodos a menudo requieren equipos
especializados y costosos, o el etiquetado de proteínas y compuestos
relacionados, lo que lleva a pasos de procesamiento complicados. Sin embargo,
los métodos electroquímicos pueden medir la constante de unión de

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:lingxm@bjmu.edu.cn (X. Ling).

https://doi.org/10.1016/j.biosx.2022.100146
Recibido el 17 de enero de 2022; Recibido en forma revisada el 25 de marzo de 2022; Aceptado el 8 de abril de 2022 Disponible
en línea el 13 de abril de 2022
2590-1370/© 2022 Los autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/bync-nd/
4.0/).
J. Zou et al.
el atezolizumab a PD-L1, así como el IC50del compuesto que inhibe la interacción
PD-1/PD-L1, acompañado de las ventajas de rapidez, sensibilidad, alta selectividad
y bajo costo. Por ejemplo, la afinidad de unión de una serie de péptidos a AKA, que
es un receptor de tirosina quinasa implicado en la entrada del virus Zika, se
estudió mediante métodos de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS)
y voltamperometría de onda cuadrada (SWV), a fin de determinar preliminarmente
detectar moléculas peptídicas candidatas que inhiben la entrada del virus del Zika
en las células (Kim et al., 2021). Se construyó un biosensor de membrana celular a
través del autoensamblaje capa por capa, se determinó la capacidad de unión de
los componentes del chile, el ajo y la pimienta de montaña al potencial receptor
transitorio humano vanilloid 1 (hTRPV1), lo que proporcionó una base para el
diseño. de analgésicos potenciales razonables (Xiao et al., 2021). Actualmente,
generalmente se informa que se utilizan métodos electroquímicos para
determinar las concentraciones de sPD-L1 (Niedzialkowski et al., 2021) y ligando-1
positivo (PD-L1+) exosomas (Cao et al., 2020), pero las aplicaciones de biosensores
electroquímicos para estudiar los efectos de las drogas en el
Figura 1.Diagramas esquemáticos del proceso de construcción de (A) sensor electroquímico de células inmovilizadas y (B) inmunosensor electroquímico.
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Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146
No se ha informado la interacción de PD-1/PD-L1 y para detectar inhibidores de
molécula pequeña de PD-1/PD-L1.
Para fijar biomateriales en la superficie del electrodo, es necesario utilizar
materiales con alta conductividad, buena estabilidad y excelente
biocompatibilidad en la construcción de electrodos. NGR tiene una alta actividad
electrocatalítica, excelente durabilidad y selectividad debido al tamaño similar de
los átomos de N y átomos de C, y la formación de fuertes enlaces de valencia (
Shabnam et al., 2017). Además de una buena biocompatibilidad, otros materiales
pueden inmovilizarse de manera estable en CS a través de fuertes enlaces de
hidrógeno e interacción electrostática. La rica variedad y el considerable número
de grupos funcionales también conducen a una mayor modificación (
Adumitrachioaie et al., 2019;Suginta et al., 2013). PtNP (Chen et al., 2018) y AuNP (
Lopes et al., 2021) tienen alta eficiencia de transferencia de electrones y buena
biocompatibilidad. La modificación utilizando estos dos tipos de nanopartículas
puede mejorar en gran medida la actividad electrocatalítica de otros materiales y
proporcionar más sitios activos. PANI tiene las ventajas de fácil preparación, bajo
costo, alta conductividad, baja toxicidad, buena
J. Zou et al.
biocompatibilidad, y tiene una amplia gama de aplicaciones en diversos
campos biomédicos e industriales (Zare et al., 2020). Los grupos sulfhidrilo y
carboxilo de 11-MUA son fáciles de formar nuevos enlaces químicos estables
y tienen buena tolerancia a la temperatura y el pH (Chen et al., 2013;Lee et
al., 2015).
En este trabajo, primero se construyó un nuevo tipo de sensor electroquímico
de células inmovilizadas para estudiar la interacción entre atezolizumab y las
células que sobreexpresan PD-1 o PD-L1 (como se muestra enFigura 1A). Las
células HEK293 que sobreexpresan PD-L1 se inmovilizaron usando PANI/NGR–CS–
PtNPs, mientras que se usaba atezolizumab y dimetilsulfóxido (DMSO) como
controles positivo y negativo, respectivamente. El aumento del impedimento
estérico que surge de la unión de atezolizumab al PD-L1 en las células PD-L1-
HEK293 dificultaría que la sonda electroquímica se acerque a la superficie del
electrodo. La inercia eléctrica de atezolizumab impidió la transferencia de
electrones, por lo que redujo el valor de respuesta actual. Por lo tanto, la
interacción entre los analitos y la proteína PD-1/PD-L1 podría determinarse
mediante el cambio de la respuesta de corriente del sensor después de incubar
diferentes concentraciones de los analitos. En consecuencia, se seleccionaron 18
componentes principales de ADI. En segundo lugar, se estableció un nuevo tipo de
inmunosensor electroquímico para estudiar la interacción entre atezolizumab y las
proteínas PD-1/PD-L1. Como se muestra enFigura 1B, la proteína PD-1 se fijó en
los AuNP depositados con electrodo de carbono vítreo (GCE) usando 11-MUA.
Después del bloqueo, el electrodo pudo capturar bio-PD-L1 incubado con
atezolizumab (control positivo). Luego, el reconocimiento específico de SA/biotina
hizo que el anticuerpo marcador se uniera al sensor, formando estreptavidina-
peroxidasa de rábano picante (SA-HRP)/bio-PD-L1/albúmina de suero bovino
(BSA)/PD-1/11-MUA/ AuNP/GCE. Atezolizumab redujo la cantidad de bio-PD-L1
capturado, lo que provocó que la cantidad de proteína SA-HRP unida disminuyera.
Finalmente, la capacidad catalítica del electrodo en la hidroquinona (HQ)/H2O2la
solución disminuyó, haciendo que la corriente de respuesta disminuyera. Por lo
tanto, BSA/PD-1/11-MUA/AuNPs/GCE o PD-L1 podrían incubarse con los analitos
de diferentes concentraciones, y los cambios en la corriente de respuesta del
sensor podrían reflejar la interacción entre los analitos y el PD-1/PD. -Proteína L1.
Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la aplicación de tecnología
de detección electroquímica para investigar la interacción entre atezolizumab y
PD-1/PD-L1, así como para detectar inhibidores de moléculas pequeñas de PD-1/
PD-L1. Además, los resultados de estos dos métodos podrían confirmarse y
complementarse entre sí, cumpliendo completamente los requisitos para la
detección de inhibidores de molécula pequeña PD-1/PD-L1 en diferentes niveles.
2. Experimental
El aparato, los productos químicos y los materiales se enumeraron en
Información de apoyo. También se describieron los pasos de síntesis de
materiales relacionados.
2.1. Preparaciones de células HEK293 que sobreexpresan proteínas PD-1 o PD-L1
Las células HEK293 se cultivaron en medio RPMI 1640 con FBS al 10 %,
penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) a 37◦C, 5% CO2
y 95% de atmósfera. El plásmido hPD-1-C-GFP o el plásmido hPD-L1-C-OFP se
transfectaron transitoriamente en células HEK293 utilizando Lipofectamine 2000, y
las células transfectadas se cultivaron durante 36 a 48 h en las mismas
condiciones que antes. Las células PD-1-HEK293 y las células PD-L1-HEK293 se
observaron mediante un microscopio de fluorescencia para detectar si la
transfección tuvo éxito. Se recogieron células HEK293, células PD-1-HEK293 y
células PD-L1-HEK293, se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) 0,1 M a 5,0×107células/ml, fijadas con paraformaldehído al 4 % y
almacenadas a 4◦C hasta su uso.
2.2. Construcción de sensores electroquímicos de celdas inmovilizadas
El GCE se pulió con polvos de alúmina de 0,3 y 0,05 μm en una superficie
de espejo y luego se ultrasonicó en ácido nítrico acuoso 1:1, etanol y agua
durante 30 s, respectivamente. Haciendo referencia al trabajo anterior.
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Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146
(Li et al., 2021), NGR, PtNP y CS se mezclaron en proporciones de volumen de
2:1:1. Se dejaron caer 5 μL de la mezcla sobre la superficie limpia de GCE y se
secó a 30◦C. Posteriormente, se añadieron gota a gota 3 μL de suspensión
PANI. Después de secarse, se dejaron caer 5,0 μL de la suspensión de células
(células PD-1-HEK293, células PD-L1-HEK293 o células HEK293) sobre la
superficie de PANI/NGR-Pt-CS/GCE, y las células se incubaron durante 30 min
a temperatura ambiente. Luego, el electrodo se sumergió en una solución
de BSA al 1% (p/v) durante 30 min. Después de lavarse con PBS, el sensor de
celda electroquímica obtenido se denominó BSA/células/PANI/NGR–CS–
PtNPs/GCE.
2.3. Estudio de interacción entre atezolizumab y células PD-L1-HEK293 utilizando
sensores electroquímicos de células inmovilizadas
En el grupo experimental se construyó un sensor electroquímico de
células de sobreexpresión inmovilizadas BSA/PD-L1-HEK293/PANI/NGR–CS–
PtNPs/GCE, con atezolizumab como control positivo y DMSO como control
negativo. El electrodo modificado final se incubó con diferentes
concentraciones de atezolizumab (1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5 μg/mL) o
DMSO (0,5‰,1‰,2‰,3‰)en solución de PBS 0,1 M (pH 7,4) durante 30 min.
Después de ser lavados, las respuestas electroquímicas de los biosensores
se registraron por voltamperometría de pulso diferencial (DPV) en KCl 0,1 M
que contenía K 5,0 mM.3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] en el rango de potencial de
+0,5 V–0 V.
En el grupo de control en blanco, el sensor de células inmovilizadas BSA/
HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE se construyó con células HEK293 ordinarias y se
incubó en diferentes concentraciones de solución de atezolizumab o solución de
DMSO durante 30 min como se describe anteriormente. Las respuestas se
registraron de la misma manera.
Tomando la tasa de cambio del valor de respuesta actual de DPV como
estándar de evaluación, la fórmula de cálculo fue Δyo=(yo0–yo)/yo, dóndeyo
yyo0fueron las respuestas actuales de la sonda electroquímica en los
sensores incubados con o sin atezolizumab, respectivamente. El estado de
unión del analito y las células inmovilizadas correspondientes se reflejó en la
relación entre la tasa de cambio actual y la concentración de los analitos
incubados. La capacidad de unión podría evaluarse mediante la constante
de unión calculada a través del método Lineweaver-Burk (Xiao et al., 2019).
2.4. Detección de los compuestos activos dirigidos a las células de sobreexpresión
Se seleccionaron los 18 componentes principales de ADI para estudiar las
interacciones entre los compuestos y las células PD-1-HEK293 o las células PD-L1-
HEK293 mediante el método establecido, incluidos astragalosido I, astragalosido
II, astragalosido IV, calicosina-7-o-β -D-glucósido, ácido clorogénico, eleuterosido
B, eleuterosido E, ginsenósido Rb1, ginsenósido Rb2, ginsenósido Rb3,
ginsenósido Rc, ginsenósido Rd, ginsenósido Re, ginsenósido Rf, ginsenósido Rg1,
formonometina, isoastragalosido I e isofraxidina. Los sensores electroquímicos de
células de sobreexpresión inmovilizadas preparados por células PD-1-HEK293 o
células PD-L1-HEK293 se incubaron con diferentes concentraciones de los
compuestos durante 30 min. Después del lavado, las respuestas se registraron
mediante DPV en KCl 0,1 M que contenía K 5,0 mM.3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] en el
rango potencial de
+ 0,5 V–0 V.
2.5. Construcción de inmunosensor electroquímico
El electrodo se limpió primero como2.2. Posteriormente, el electrodo se
insertó en el 0,5 MH2ASI QUE4solución acuosa y se utiliza como electrodo de
trabajo. Si bien se utilizaron alambres de Ag/AgCl y Pt como electrodo de
referencia y contraelectrodo, respectivamente, se escanearon 15 veces para
limpiar la superficie del electrodo en modo de voltamperometría cíclica (CV) entre
−0,5 V y +1,5 V, a una velocidad de escaneo de 100 mV/s. Luego, el electrodo se
insertó en el HAuCl 0,2 mM.4solución que contiene Na 0,1 M2ASI QUE4y H2ASI QUE
4para hacer que las AuNP se depositen electroquímicamente. Después de ser
sumergido en el agente de conexión y protegido de la luz
J. Zou et al.
Durante la noche, el electrodo se enjuagó con etanol y agua desionizada, seguido
de la activación del grupo carboxilo con una solución que contenía N-(3-
dimetilaminopropil)-N 0,2 M′-clorhidrato de etilcarbodiimida (EDC) y N-
hidroxisuccinimida (NHS) 0,1 M durante 40 min. Se dejaron caer 5 μL de proteína
PD-1 sobre la superficie del electrodo y se incubó a temperatura ambiente durante
2 h. Después de sumergirse en la solución de bloqueo durante 1 hora, se
agregaron gota a gota secuencialmente 7,5 μL de proteína biotina-PD-L1 y
proteína SA-HRP a la superficie del electrodo, y se incubaron durante 1 hora cada
una. El electrodo se enjuagó entre pasos para eliminar la proteína no unida.
Finalmente, el electrodo modificado se usó como electrodo de trabajo, mientras
que el electrodo de calomelano saturado (SCE) y el alambre de Pt se usaron como
electrodo de referencia y contraelectrodo, respectivamente. La corriente se midió
en una solución que contenía una cierta cantidad de HQ y H2O2
en el modo DPV entre − 0,35 V y +0,15 V.
2.6. Establecimiento y aplicación de un nuevo método de inmunosensor
electroquímico para estudiar la interacción entre atezolizumab y la
proteína PD-1/PD-L1
Según la información previa al ensayo, cuando se había construido BSA/
PD-1/11-MUA/AuNPs/GCE, la mezcla de bio-PD-L1 y atezolizumab incubada
durante 1 h se dejó caer sobre el electrodo. Después de ser incubado con
proteína SA-HRP, la respuesta actual se obtuvo por DPV.
Este método se aplicó para estudiar el ginsenósido Rg1. BSA/PD-1/11-MUA/
AuNPs/GCE se sumergió en diferentes concentraciones de ginsenósidos Rg1
durante 1 h. Luego, el electrodo se incubó secuencialmente con proteína biotina-
PD-L1 y proteína SA-HRP, y se detectó por DPV.
3. Resultados
3.1. Caracterización de sensores electroquímicos de células de
sobreexpresión inmovilizadas
Se utilizaron FTIR y XRD para caracterizar el PANI sintetizado. En Figura
2A, el pico de vibración de flexión del C–N en el anillo de benceno apareció
en 1542 cm−1, mientras que los picos de vibración de tracción de C–C y N–H
en el anillo de benceno, así como C–C en el anillo de quinona, ubicado a
1439 cm−1, 1280cm−1, y 1224cm−1. Estos resultados fueron consistentes con
lo que la referencia (Rao et al., 2017) informó. en el DRX
Figura 2.(A) espectro FTIR de PANI; (B) espectros XRD de PANI y NGR-CS-PtNPs; Imágenes SEM de (C) NGR–CS–PtNPs, (D) PANI/NGR-PtNPs-CS y (E) HEK293/ PANI/NGR-
PtNPs-CS; (F) Respuestas CV del sensor en KCl 0,1 M que contiene K 5,0 mM3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6a la velocidad de exploración de 100 mV/s de − 0,1 V a 0,6 V.
4
Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146
patrón de PANI (Figura 2B), los tres picos de difracción en 2θ = 8.9◦, 20.8◦, y 25.2◦
fueron causados por la periodicidad en la dirección a lo largo, paralela y
perpendicular a la cadena de polímero, respectivamente, que también estaban en
línea con el informe (Pan et al., 2006). Sin embargo, la cristalinidad era pobre y la
forma de sal de jade estaba dopada en la cadena PANI. En resumen, se pudo
comprobar que la elaboración del PANI fue exitosa.
De acuerdo con los resultados XRD de NGR-CS-PtNPs enFigura 2B, un
pico ancho alrededor de 2θ = 25◦fue causado por NGR (Parque et al., 2020). Y
los picos alrededor de 43◦correspondía al plano (200) de las PtNP (Ding et al.,
2014), cuya intensidad máxima fue baja debido a la baja cantidad y alta
dispersión de las PtNP.
Figura 2C,Figura 2DyFigura 2Efueron micrografías electrónicas de
barrido de NGR-CS-PtNPs, PANI/NGR-PtNPs-CS, HEK293/PANI/NGR-PtNPs-
CS, respectivamente. NGR-CS-PtNP formaron una estructura porosa, que fue
beneficiosa para la difusión de sondas electroquímicas. PANI se entrelazó
aún más para formar una estructura de red. La interacción intermolecular π-
π podría promover el entrecruzamiento de las nanoestructuras fibrosas,
uniéndose firmemente a las NGR-CS-PtNP subyacentes sin moteado ni
desprendimiento. Al mismo tiempo, debido a su espacio lo suficientemente
grande, podría facilitar la reacción de oxidación-reducción de [Fe(CN)6]3-/4-
acercándose al electrodo para producir una señal de respuesta
electroquímica más sensible. La estructura de la red también podría
proporcionar un soporte excelente para las células HEK293, que tenían una
morfología completa sin daños y se distribuyeron uniformemente en PANI/
NGR-PtNPs-CS. La fijación era relativamente firme y difícil de quitar. Por lo
tanto, el material era adecuado para construir un sensor electroquímico de
celda inmovilizada estable.
Figura 2Fmostró las curvas CV de los diferentes electrodos en el proceso de
preparación en KCl 0,1 M que contenía K 5,0 mM3[Fe(CN)6]/K4[Fe (CN)6] a una
velocidad de barrido de 100 mV/s desde -0,1 V a 0,6 V. La curva de GCE mostró un
par de picos redox reversibles, lo que refleja la reacción redox entre Fe3+y fe2+.
Después de la modificación de NGR-CS-PtNPs, el valor de corriente pico aumentó.
Fue porque la combinación de materiales aún mantenía su propia excelente
conductividad y podía promover efectivamente la transferencia de electrones en la
superficie del electrodo. Debido a la excelente conductividad eléctrica de PANI,
después de modificar PANI en el sensor, la corriente máxima aumentó aún más. Si
bien las células inmovilizadas se fijaron posteriormente en la superficie del
electrodo y los sitios activos se bloquearon con BSA, la mala conductividad de las
células y proteínas,
J. Zou et al. Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146

junto con un gran impedimento estérico, dificultaría la transferencia de electrones
y la difusión de sondas electroquímicas [Fe(CN)6]3-/4-, haciendo que la corriente de
pico disminuya sucesivamente. Este resultado también fue consistente con las
expectativas, lo que indica que el sensor electroquímico de celda inmovilizada se
construyó con éxito.
3.2. Establecimiento de un nuevo método para estudiar la interacción de
atezolizumab con células que sobreexpresan PD-1/PD-L1
Atezolizumab es el primer anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA
dirigido a PD-L1, que puede competir con PD-1 para unirse a la superficie y
dificultar la unión de PD-1/PD-L1 (Zhang et al., 2017). Por lo tanto, el grupo
experimental utilizó atezolizumab como control positivo y DMSO como
control negativo. Los resultados experimentales se muestran enFigura 3A y
Figura 3B. Mientras el sensor electroquímico de células de sobreexpresión
inmovilizadas se incubaba con atezolizumab, a medida que la concentración
de atezolizumab aumentaba gradualmente, el valor actual de respuesta de
BSA/hPD-L1-HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE disminuía gradualmente. Sin
embargo, mientras el sensor electroquímico de células de sobreexpresión
inmovilizado se incubó con DMSO, el valor de respuesta actual no cambió
significativamente y la tasa de cambio actual no aumentó con el aumento de
la concentración de DMSO.
El grupo de control en blanco usó células HEK293 ordinarias para
construir el sensor. Los resultados se mostraron enFigura 3CyFigura 3D. El
sensor BSA/ HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE se incubó con diferentes
concentraciones de atezolizumab y DMSO. Los valores de cambio de
respuesta actual enFigura 3Aeran significativamente diferentes de los
demás enFigura 3B,Figura 3CyFigura 3D, mientras que los valores enFigura
3Beran similares a los deFigura 3CyFigura 3D, mostrando que el cambio en
la corriente enFigura 3Ade hecho fue causado por la unión de atezolizumab
a la proteína PD-L1. Por un lado, debido a la mala conductividad del
atezolizumab, podría pasivar el electrodo y dificultar la transferencia de
electrones del sensor. Por otro lado, la sonda electroquímica [Fe (CN)6]3-/4-
Fue difícil acercarse a la superficie del sensor debido al impedimento
estérico, lo que resultó en una disminución en el valor de respuesta actual. A
medida que aumentaba aún más la concentración de atezolizumab, el valor
de respuesta actual tendía a ser estable. Fue porque atezolizumab fue
excesivo y se produjo el efecto de saturación del receptor.
Los valores de respuesta actuales del sensor electroquímico de células de
sobreexpresión inmovilizadas frente a la concentración de atezolizumab fueron
trazado (Figura 3F), exhibiendo una relación hiperbólica entre los dos, que
era similar a la reacción enzimática de la cinética enzimática. El efecto de
saturación podría expresarse utilizando la fórmula de Lineweaver-Burk. La
tasa de cambio de corriente del sensor electroquímico de celda inmovilizada
en concentración de atezolizumab se ajustó con un ajuste recíproco doble,
como se muestra en el recuadro deFigura 3F, la relación era Δyo−1= 0.1164×
C−1+2.8035 (R2= 0,9987). La constante de enlace calculadakade atezolizumab
y PD-L1-HEK293 fue 2,4×107METRO−1.
La precisión se evaluó mediante las desviaciones estándar relativas (RSD)
del valor de respuesta actual. La precisión intradiaria, interensayo e
interdiaria fue del 1,54 %, 9,1 % y 7,5 %, respectivamente. BSA/PANI/ NGR–
CS–PtNPs/GCE se almacenó a 4◦C durante 3 días, la RSD de la tasa de cambio
actual medida en diferentes momentos fue del 1,5 %. En resumen, este
método tuvo buena reproducibilidad y estabilidad, lo que podría
proporcionar una plataforma de análisis confiable y estable para estudiar la
interacción entre atezolizumab y las células que sobreexpresan PD-1/PD-L1.
3.3. Detección de los componentes principales de ADI utilizando sensores
electroquímicos de celda inmovilizada
Se utilizaron dos tipos de sensores electroquímicos de células de sobreexpresión
inmovilizadas para seleccionar 18 compuestos principales en ADI. La mayoría de los
resultados de las pruebas para la detección de compuestos de molécula pequeña fueron
negativos. Tomando el ginsenósido Rf como ejemplo, los resultados experimentales
relevantes puestos en los materiales de apoyo fueron similares a los resultados del grupo
de control en blanco. Se encontró que solo el ginsenósido Rg1 interactuaría con BSA/
PD-1-HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE. El resultado del compuesto positivo fue similar
al resultado de los grupos experimentales, lo que podría expresarse de manera similar
mediante la fórmula de Lineweaver-Burk. El resultado del ajuste recíproco doble de la
tasa de cambio de corriente del sensor de concentración de ginsenósido Rg1 fue: Δyo−1=
81.532×C−1+8.1438 (R2= 0,9937). Se pudo calcular que la constante de unión de PD-1-
HEK293 y ginsenósido Rg1 fue de 9,9×104METRO−1.
3.4. Establecimiento y aplicación de un nuevo método de inmunosensor
electroquímico para estudiar la interacción entre atezolizumab y la
proteína PD-1/PD-L1
Con el fin de evaluar los inhibidores a diferentes niveles, se estableció un
novedoso inmunosensor electroquímico como complemento y

Fig. 3.Los resultados de DPV de BSA/hPD-L1-HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE incubados con (A) atezolizumab o (B) DMSO de diferentes concentraciones; Los resultados
de DPV de BSA/HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE incubados con (C) atezolizumab o (D) DMSO de diferentes concentraciones; (E) Los resultados de DPV de BSA/hPD-1-
HEK293/PANI/NGR–CS–PtNPs/GCE incubados con ginsenósido Rg1; Relación entre la tasa de cambio de la corriente de respuesta de (F) BSA/PD-L1-HEK293/PANI/ NGR-
PtNPs-CS/GCE y las concentraciones incubadas de atezolizumab o (G) BSA/PD-1-HEK293/PANI/NGR-PtNPs -CS/GCE y concentraciones incubadas de ginsenósido Rg1.
Recuadros: las relaciones lineales entre el recíproco de la tasa de cambio actual y el recíproco de la concentración del compuesto correspondiente.

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J. Zou et al.
verificación. En primer lugar, se optimizaron las condiciones experimentales
del inmunosensor electroquímico, lo que se puede apreciar en los
materiales complementarios. En segundo lugar, al cambiar la concentración
de bio-PD-L1, se pudo encontrar que la respuesta actual del inmunosensor
electroquímico tenía una buena relación lineal con la concentración de
proteína bio-PD-L1 en el rango de 0.5–7.5 μg/mL, como se muestra en la
Figura 4A. Podría expresarse como:yo(μA) = -1.292 + 3.698×C(μg/ml) (R2=
0,9973). Se encontró que no hubo un efecto significativo sobre la señal del
sensor cuando los experimentos se realizaron con HSA o IgG a 100 veces la
concentración máxima del rango lineal, lo que indica una buena selectividad
del sensor. La RSD del valor de respuesta actual se utilizó como estándar de
evaluación, y las precisiones intradía e interensayo fueron del 1,9 % y el 4,6
%, respectivamente. Después de almacenar el electrodo SA-HRP/bio-PD-L1/
BSA/PD-1/11-MUA/Au/GCE modificado a 4◦C durante 3 días, la respuesta
actual podría alcanzar más del 85% del valor inicial, lo que indica que el
sensor tenía buena estabilidad.
Usando atezolizumab como control positivo, a medida que aumentaba la
concentración de atezolizumab, también aumentaba el bio-PD-L1 unido. Por
lo tanto, disminuyó la cantidad de SA-HRP que podría unirse a bio-PD-L1/
BSA/PD-1/11-MUA/Au/GCE, lo que llevó a una respuesta de corriente
reductora. Al medir la respuesta actual, podríamos usar la relación lineal
anterior para calcular la concentración libre de bio-PD-L1 después de la
preincubación. Luego, se obtuvo la tasa de inhibición de la concentración
correspondiente mientras que la concentración inicial fue de 7.5 ng/mL
(mostrado enFigura 4B). De esta relación, su IC50fue de 2,73 ng/ml.
Para utilizar un método (BEATTY et al., 1987) para calcular la
constante de unión de atezolizumab y la proteína PD-L1, la
concentración de PD-1 en el electrodo BSA/PD-1/11-MUA/Au/GCE se
cambió de 1,5 μg/mL a 3,0 μg/mL y se realizó un mismo experimento.
Como se muestra en Figura 4C, el nuevo CI50podría medirse en 7.26 ng/
mL, y el calculadokafue 6.11×109METRO−1.
Como se muestra enfigura 4D, cuando la concentración de ginsenósido Rg1
alcanzó los 20 μM, se alcanzó la máxima eficacia inhibidora, que fue de
aproximadamente el 50%. Tomando los resultados anteriores en3.3en
consideración, se puede encontrar que la tasa de cambio actual de ginsenósido
Rg1 fue menor que la de atezolizumab. Aparte de la diferencia de conductividad
entre las moléculas pequeñas y los anticuerpos monoclonales, el ginsenósido Rg1
tenía una capacidad de unión deficiente con la proteína PD-1, mostrando poco
efecto sobre la interacción de PD-1/PD-L1. Por lo tanto, el ginsenósido Rg1 no era
un buen inhibidor de moléculas pequeñas de PD-1/PD-L1.
4. Discusión
loskdvalor entre atezolizumab y PD-L1 en la literatura (Deng et al., 2016)
fue de 0,433 nM, por lo que elkael valor era 2.5×109METRO−1. Este valor fue
dos órdenes de magnitud diferente del resultado obtenido en3.2(lakael valor
se calculó en 2,4×107METRO−1usando los sensores electroquímicos de
células de sobreexpresión inmovilizadas), mientras que básicamente es
consistente con el resultado medido por el inmunosensor (6.11× 109METRO−
1). Mientras tanto, su IC50fue de 7.88 ng/mL reportado por la literatura (Xie
et al., 2018), que estuvo cerca del resultado obtenido anteriormente (2,73
ng/mL). La razón de las diferencias anteriores puede deberse a la
Figura 4.(A) La relación lineal entre las respuestas de DPV y las concentraciones de bio-PD-L1; Relación entre las concentraciones de atezolizumab y las tasas de inhibición
para (C) SA-HRP/bio-PD-L1/BSA/PD-1(1.5 μg/mL)/11-MUA/Au/GCE o (D) SA-HRP/bio- PD-L1/BSA/PD-1(3,0 μg/mL)/11-MUA/Au/GCE; (D) Relación entre las concentraciones de
ginsenósido Rg1 y las tasas de inhibición.
6
Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146
diferencia entre la proteína PD-L1 purificada y la proteína sobreexpresada
en HEK293, como los efectos del proceso de separación y purificación de
proteínas en la conformación de la proteína, el efecto de anclaje de la
membrana celular, el efecto de otras sustancias en la célula en la interacción
entre atezolizumab y la proteína PD-L1, el efecto de la inmovilización del
paraformaldehído (PFA) en la conformación de la proteína, etc.
Según la literatura (Wang et al., 2020) medida por el método SPR, lakdvalor de
ginsenósido Rg1 y proteína PD-1 es 1.87× 10−5M, entonces elkael valor podría
calcularse como 5.3×104METRO−1, que estaba relativamente cerca de 9.9×104
METRO−1obtenido en3.3. En comparación con atezolizumab, el impedimento
estérico del ginsenósido Rg1 fue menor. Por lo tanto, la diferencia entre la
capacidad de unión del ginsenósido Rg1 a la proteína PD-L1 en la superficie celular
de sobreexpresión y la proteína PD-L1 purificada fue débil, lo que resultó en una
diferencia más pequeña entre los valores medidos.kavalor y el valor de la
literatura.
Por lo tanto, las razones de la diferencia entre los resultados de estos dos
biosensores y los valores informados se pueden ver a continuación:
(1) El sensor electroquímico de células de sobreexpresión inmovilizadas
midió la constante de unión entre atezolizumab y las células PD-L1-
HEK293, mientras que el inmunosensor electroquímico midió la
constante entre atezolizumab y la proteína bio-PD-L1.
Como se mencionó anteriormente, las diferencias en los materiales biológicos dieron lugar a
diferencias en los resultados de las mediciones.
(2) El inmunosensor electroquímico fue una medida indirecta de la
constante de unión de atezolizumab y PD-L1, porque el cambio en la
corriente reflejó directamente la unión de PD-1 y PD-L1. La tasa de
cambio actual del sensor electroquímico de la celda de
sobreexpresión inmovilizada fue causada directamente por la unión
de atezolizumab a PD-L1. Además, cuando la mezcla de atezolizumab
y PD-L1 se incubó con BSA/PD-1/11-MUA/Au/GCE, en realidad hubo
un efecto de unión competitiva, que también podría afectar la
determinación de laka. Por lo tanto, la diferencia en el método de
medición condujo a la diferencia en el resultado de la medición.
(3) Los sensores electroquímicos de celdas inmovilizadas tenían una
conductividad deficiente debido al uso de celdas como matriz, lo que
reducía la sensibilidad del sensor. En particular, al comparar la tasa de
cambio actual de atezolizumab y el ginsenósido Rg1, la tasa de cambio
actual de atezolizumab fue significativamente mayor que la de este último
debido a los mayores electrones inertes y al impedimento estérico. La
matriz para el inmunosensor era proteína y el cambio actual fue causado
por la cantidad de unión de bio-PD-L1 a BSA/PD-1/11-MUA/Au/GCE, por lo
que la sensibilidad también fue mayor. Por lo tanto, la diferencia en la
sensibilidad del método condujo a la diferencia en los resultados de la
medición.
En resumen, los sensores electroquímicos de células inmovilizadas pueden detectar
compuestos a nivel molecular en un estado casi fisiológico, mientras que los
inmunosensores electroquímicos pueden evaluar simultáneamente compuestos a nivel
de proteína desde la perspectiva de la capacidad de unión y la potencia. Ambos de estos
dos métodos electroquímicos originales se pueden utilizar
J. Zou et al.
como medio eficaz para detectar inhibidores de molécula pequeña de PD-1/PD-L1.
Los resultados pueden ser una corroboración y un complemento mutuos, lo que
hace que la selección y evaluación de los inhibidores sea más precisa. Además, el
nuevo método tiene las ventajas de una síntesis de materiales simple y pasos de
preparación de sensores a bajo costo.
5. Conclusión
En resumen, este artículo estableció el sensor electroquímico de células de
sobreexpresión inmovilizadas BSA/Cells/PANI/NGR–CS–PtNPs y el inmunosensor
electroquímico SA-HRP/bio-PD-L1/BSA/PD-1/11-MUA/Au/ GCE para estudiar la
interacción entre atezolizumab y las proteínas PD-L1-HEK293 o PD-1/PD-L1
mediante constante de unión o IC50. Se seleccionaron 18 componentes principales
en ADI usando este método, se confirmó que el ginsenósido Rg1 podría unirse a
PD-1, lo que dificulta la unión de la proteína PD-1/PD-L1. Pero la máxima eficacia
de inhibición, que fue de alrededor del 50 %, indicó que el ginsenósido Rg1 no era
un inhibidor ideal de moléculas pequeñas de PD-1/PD-L1. Sin embargo, se ha
establecido con éxito un método para detectar la inhibición de moléculas
pequeñas de PD-1/PD-L1, que no solo puede determinar la constante de unión
entre fármacos y proteínas de la superficie celular en un estado casi fisiológico,
sino también evaluar la eficacia de los compuestos basados en en circuito
integrado50, aunque todavía hay margen de mejora en la sensibilidad del método.
Aparte de una mayor optimización mediante la sustitución de materiales de
matriz, este método también se puede utilizar más ampliamente mediante la
sustitución de proteínas y células de sobreexpresión.
Declaración de contribución de autoría CRediT
Juncheng Zou:Metodología, Análisis formal, Investigación,
Redacción – borrador original.Cong Li:Conceptualización, Redacción –
revisión y edición.Xinyue Zhang:Recursos.Tao Huang:Recursos.
Nurmuhammat Kehriman:Recursos.Wen Kuang:Recursos.XinHu:
Recursos.Yoqi Yan:Recursos.Xiaomei Ling:Conceptualización,
Redacción – revisión y edición.
Declaración de competencia de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni
relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo
informado en este documento.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de la
Juventud de China [Subvención No. 81803487] y la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China [Subvención No. 81673392].
Apéndice A. Datos complementarios
Los datos complementarios a este artículo se pueden encontrar en línea enhttps://
doi. org/10.1016/j.biosx.2022.100146.
Biosensores y Bioelectrónica: X 10 (2022) 100146
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