SEGUIMIENTO CIENTÍFICO PROGRAMA SANTIAGO GRISOLIA

INFORME FINAL DE LA PERSONA CONTRATADA SOBRE SU TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

A DADES DE LA PERSONA CONTRACTADA

DATOS DE LA PERSONA CONTRATADA

1r COGNOM / 1r APELLIDO 2n COGNOM / 2º APELLIDO NOM / NOMBRE DNI / NIF/ NIE

BOADA ACOSTA LISSETTE ANAHÍ Y9076677V

B DADES DE LA PERSONA RESPONSABLE DEL PROJECTE

DATOS DE LA PERSONA RESPONSABLE DEL PROYECTO

1r COGNOM / 1r APELLIDO 2n COGNOM / 2º APELLIDO NOM / NOMBRE Ref. Projecte

Ref. Proyecto
CAMPS HERRERO CARLOS JESUS
2021/016

ORGANISME (UNIVERSITAT, CENTRE D’INVESTIGACIÓ)

ORGANISMO (UNIVERSIDAD, CENTRO DE INVESTIGACIÓN)

FUNDACIÓN DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO DE VALENCIA (FIHGUV), Unidad

Mixta TRIAL (CENTRO DE INVESTIGACIÓN PRÍNCIPE FELIPE- FIHGUV) y LABORATORIO DE ONCOLOGÍA
MOLECULAR (FIHGUV).

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1. TÍTULO: “APROXIMACIÓN MULTIDIMENSIONAL PARA LA CARACTERIZACIÓN DEL ESTATUS IN-

MUNE EN CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO. BÚSQUEDA DE BIOMARCADORES.”

2. RESUMEN:

El cáncer de pulmón representa un problema y a la vez un desafío por solventar en la salud

pública. La principal causa del desarrollo tumoral se asocia con el hábito tabáquico. El efecto de
fumar que causa en el organismo es una reacción en cadena el cual, dentro del sistema
inmunitario, genera una alta carga mutacional, permitiendo detectar nuevos antígenos presentes
en el tumor, y así, eliminar a las células tumorales. Sin embargo, los tumores poseen la capacidad
de evadir la inmunovigilancia por diversos mecanismos, que van desde la presentación antigénica
disfuncional hasta la regulación del microambiente tumoral (TME), ejerciendo un efecto
inmunosupresor que inhiben la funcionalidad de las células inmunes o el reclutamiento de células
con capacidad inmunosupresora. Recientemente, una nueva aproximación terapéutica dirigida a la
regulación de las células inmunes ha demostrado ser efectiva en un grupo de tumores sólidos,
entre ellos en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). A pesar de obtener remisiones
completas y prolongadas, no todos los pacientes se benefician de esta terapia, por lo que es
necesario la identificación de nuevos biomarcadores que permitan seleccionar aquellos pacientes
capaces de responder a este tipo de tratamientos. En la actualidad, el biomarcador predictivo más
utilizado es PD-1/ PD-L1 (ligando 1 de muerte programada y su ligando), y más recientemente la
 carga mutacional tumoral y la inestabilidad de microsatélites, que han logrado definir grupos de
pacientes con mayor beneficio clínico. Sin embargo, no es suficiente dada la complejidad de las
interacciones tumor/TME para caracterizar de manera exhaustiva el estatus inmune en cáncer de
pulmón. Por lo tanto, en este proyecto se plantea un abordaje multidimensional basado en el
desarrollo de organoides tumorales derivados de pacientes con CPNM de nueva generación.
Mediante el uso de citometría de flujo multiparamétrica, perfiles de citocinas, análisis de la carga
mutacional, y secuenciación de los receptores de las células T, se espera obtener una
caracterización más integral del escenario inmune que ocurre en cada tumor. De manera que, a
través de esta visión integral se puedan alcanzar resultados más concluyentes en cuanto a la
selección de nuevos y mejores biomarcadores que permitan predecir de forma más precisa la
respuesta a los tratamientos basados en la modulación del sistema inmunológico.

3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

El objetivo principal del proyecto persigue estudiar la complejidad del estatus inmune en muestras
de pacientes con CPNM, basado en el análisis de factores intrínsecos del tumor, factores relativos
al microambiente tumoral que pueda influir en el comportamiento y curso clínico de este tipo de
cáncer que conduzcan a encontrar nuevos biomarcadores para un mejor manejo terapéutico de los
pacientes.
El uso de cultivo de PDTOs in vitro representa un nuevo enfoque para el estudio de la biología
tumoral. La interacción del tumor con su microambiente es un tema crítico que implica el uso de
modelos preclínicos más complejos. Debido a que, las células inmunitarias infiltrantes juegan un
papel crucial en la generación de diferentes respuestas inmunitarias que van desde la citotoxicidad
hasta la inhibición completa de la actividad inmunitaria antitumoral, lo cual, clínicamente es de
particular interés en el caso de CPNM donde un porcentaje significativo de pacientes tratados con
inmunoterapia todavía no muestran beneficios de supervivencia.
Por lo tanto, el objetivo principal de esta propuesta es la creación de un repositorio de PDTO
inmunocompetentes de CPNM para la identificación y validación de células T reactivas a tumores y
posibles neoantígenos. Esta información se utilizará para el estudio traslacional de biomarcadores
potenciales para la inmunoterapia en CPNM y también para diseñar enfoques inmunoterapéuticos
más racionales en este contexto.

Por tanto, a continuación, se presentan los siguientes objetivos concretos:

 Objetivo 1. El desarrollo de un repositorio de PDTO inmunocompetentes de CPNM de próxima

generación que pueden recrear de forma reproducible las interacciones entre el tumor y células
inmunes. Esto incluye la prueba de nuevas matrices y validación de protocolos.
 Objetivo 2. Estudio del fenotipo inmune de los tumores, a través de análisis de expresión de
genes inmuno-relacionados en PDTOs y subpoblaciones de células inmunes obtenidos de pa-
cientes con CPNM
  Objetivo 3. Analizar el repertorio TCR en linfocitos en co-cultivo con PDTOs.
 Objetivo 4. Trasladar los modelos PDTOs inmunocompetentes para la evaluación de la efica-
cia de nuevas terapias en el campo de la inmunooncología.
 Objetivo 5. Estudios de correlación entre variables analíticas y variables clínico-patológicas y
pronósticas. Validación de posibles marcadores.

4. INFORME DEL TRABAJO REALIZADO Y RESULTADOS OBTENIDOS

4.1 Grado de cumplimiento de objetivos

En esta tesis se plantea un análisis exhaustivo del microambiente tumoral en muestras derivadas
de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), esto, a partir del desarrollo y aplicación
multidimensional de diferentes tecnologías biotecnológicas. El análisis en el cual se enmarca esta
investigación pretende alcanzar resultados más concluyentes de los linfocitos específicos de
neoantígenos para la selección de posibles biomarcadores que permitan predecir respuestas más
precisas en tratamientos enfocados en inmunoterapia.
En este primer y segundo semestre, se han podido cumplir los siguientes objetivos concretos de la
fase exploratoria:

 4.1.1. Objetivo 1. El desarrollo de un repositorio de PDTO (patient-derived tumor organoids)

inmunocompetentes de CPNM de próxima generación que pueden recrear de forma reproduci-
ble las interacciones entre el tumor y células inmunes. Se realiza la recolección y congela-
miento de muestras de resección quirúrgica de tejido tumoral y células mononucleares de san-
gre periférica (PBMCs) de pacientes con CPNM de manera continua. El motivo se debe a que
parte del diseño del proyecto, es de manera prospectiva, por lo que es necesario seguir con
desarrollo del repositorio de PBMCs y las muestras de tejido tumoral para la terminación de la
cohorte de pacientes.
 Durante este segundo año de proyecto, se han llevado a cabo varios ensayos de PTDOs a
partir de cultivos primarios establecidos de las muestras de resección quirúrgica. Se está utili-
zando matrigel como matriz control, que representa la membrana basal de señalización com-
pleja tumoral y se ha estado probando una nueva formulación de medio de cultivo que optimi-
zará el desarrollo, viabilidad y conservación de PDTOs.
 De igual forma, se continúa realizando ensayos con nueve matrices con diferentes caracterís-
ticas. Este ensayo tiene como finalidad el estudio y encapsulamiento de los PTDOs y su inte-
racción con matrices de nueva generación. En colaboración con el Instituto de Ciencia de Ma-
teriales de Barcelona (ICMAB), se desarrollaron matrices a base de Polietilenglicol Hidrogel
(PEG) y heparina, (Bulk, IOPAL80um, IOPAL120um) que recrea el entorno microtumoral 3D
del ganglio linfático, proporcionando mayor porosidad, interconectividad, rigidez, carga bioquí-
mica y mejor distribución celular. Además, para mejorar la adhesión celular, se han añadido
péptidos de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) (Bulk+RGD, IOPAL80um+RGD, IOPA-
 L120um+RGD). Por otro lado, en colaboración con el Instituto de Bioingeniería de Cataluña
(IBEC), se probaron matrices basadas en colágeno tipo I a diferentes concentraciones (4mg/
ml y 2mg/ml), que es el principal determinante de la resistencia a la tracción de la matriz extra-
celular (MEC) y se ha utilizado ampliamente en cultivo celular.
 Los PDTO se han estado cultivando a partir de diferentes líneas celulares de pacientes con
NSCLC establecidas en el Hospital General Universitario de Valencia en los diferentes tipos
de matrices. La viabilidad celular se evalúa utilizando ensayos “vivo/muerto” y Cell Titer Glo
3D a diferentes días. Se ha estado evaluando la morfología, el tamaño y la complejidad de los
PDTOs con microscopía confocal entre las diferentes matrices que sean capaz de recapitular
la complejidad del microambiente del tumor de pulmón humano de forma más reproducible
que Matrigel. El avance de este objetivo en general es del 70% de cumplimiento.

 4.1.2. Objetivo 2. Estudio del fenotipo inmune de los tumores, a través de análisis de expre-
sión de genes inmuno-relacionados en PDTOs y subpoblaciones de células inmunes obteni-
dos de pacientes con CPNM. Para llevar a cabo este objetivo fue necesario continuar con el
repositorio de PBMCs del FiHgUV. Continuamente se ha realizado el aislamiento de PMBCs
que se han aislado de forma estéril por gradiente de Ficoll-Paque® para su posterior conser-
vación en N2 líquido, teniendo en cuenta la preservación de la viabilidad de estas células. Se
han comparado diferentes condiciones de criopreservación que garanticen la máxima viabili-
dad de las células tras su descongelación.
 Durante este segundo año, se han realizado los ensayos en co-cultivos a partir de Tumoresfe-
ras para analizar el tipo de medio (Medio XVIVO20 y RPM1640), la línea celular (H1650) y tipo
de linfocito (PBMCs y TCD4+), el tipo de placa (redonda y plana) y con o sin activador de linfo-
citos Interleuquina 2 (IL-2) con la finalidad de estudiar las interacciones entre las células tumo-
rales y comprender de mejor manera las características y el comportamiento de estas células.
Estas pruebas fueron satisfactorias.
 De la misma manera, se cuenta un repositorio con material e información genética ya aislada y
analizada proveniente tanto del tejido normal como de tejido tumoral recolectado del objetivo
uno y que forma parte de una base de datos con los pacientes con CPNM del proyecto FIS y
que sigue aumentando continuamente. El avance de este objetivo es del 40%.

4.2. Resumen de los resultados obtenidos

4.2.1. Formación de la doctoranda

A partir del mes de noviembre del 2022 la doctoranda asistió al congreso:

 Tipo de participación: Asistencia presencial

 Nombre del congreso: Desafío oncológico Nº13

 Ciudad de celebración: Valencia, España

  Fecha: 29-30/11/2022 al 1/12/2022

 Entidad organizadora: Hospital General Universitario de Valencia y el Hospital 9 de octubre

(Valencia)

Como parte de mi formación como doctoranda desde el 11 de octubre del 2022 he comenzado con
un Curso presencial de inglés desarrollado en la Universidad Politécnica de Valencia hasta julio del
2023.

En el mes de marzo la doctoranda asistió a la Jornada:

 Tipo de participación: Asistencia Presencial
 Nombre del congreso: XIII Jornada GIDO Heterogeneidad tumoral en cáncer de
 pulmón amenaza y oportunidad de mejora.
 Ciudad de celebración: Valencia, España.
 Fecha: 10/03/2023
 Entidad organizadora: GIDO

Además, en el mes de abril adquirí nuevas competencias en el área de citometría de flujo desarro-
llando el curso:
 Tipo de participación: Asistencia virtual
 Nombre del Curso: “Citometría de flujo aplicaciones clínicas.”
 Ciudad de celebración: Quito, Ecuador-Colombia
 Fecha de celebración: Abril, 10/12/2022 Fecha de finalización: 28/12/2022
 Entidad organizadora: CEBIO-ECUADOR
Con este curso pretendo desarrollar los ensayos posteriores para analizar el número de células, el
porcentaje de células vivas y ciertas características de las células (como el tamaño y la forma) a
partir de los organoides obtenidos en las matrices que fueron optimizadas. Además, se pretende
identificar marcadores tumorales, antígenos, en su superficie celular.

En cuanto a la colaboración en otras actividades por parte de la Universidad Politécnica de Valencia

y como parte de actividades de difusión científica, he participado en el desarrollo de un artículo
científico actividades enfocado en que se mencionan a continuación.
 Título: Advancements in synthetic biology-based bacterial cancer therapy: A modular design
approach
 Autores: Andrés Arboleda-García, Ivan Alarcon-Ruiz, Lissette Boada-Acosta, Yadira Boada,
Alejandro Vignoni, Eloisa Jantus-Lewintre.
 Revista: Critical Reviews in Oncology/Hematology, Vol. 190, October 2023, 104088.

En el mes de octubre empecé un curso de Excel avanzado enfocado en tablas dinámicas y POWER
BI otorgado por la cámara de comercio (Quito-Ecuador) de manera virtual, y actualmente lo me en-
cuentro en la fase final.

A la par con la investigación, me he estado capacitando y apoyando continuamente al Laboratorio

de Oncología Molecular perteneciente al FiHgUV en el desarrollo de técnicas moleculares como:
 Recepción de muestras biológicas, procesamiento, acondicionamiento, y almacenamiento.
 Inclusión de datos en bases de datos específicas del proyecto.
 Aislamiento, extracción y cuantificación de material genético (DNA, RNA, ctDNA) a partir de
diferentes técnicas.
 Análisis de mutaciones en muestras de tejido y biopsia líquida.
 PCR y RT-PCR.
 Análisis de mutaciones puntuales por PCR-Digital (QuantStudio)
 Secuenciación de Librerías.
 Inmunohistoquímica
 Aislamiento de PMCS de pacientes derivados de CPNM
 Análisis de las citoquinas mediante la tecnología Luminex xMap®
 Manejo de la base de datos a partir del software SPSS.
De igual forma, ahora también soy parte del equipo del Laboratorio de “Inmunología y Oncología tu-
moral-Unidad Mixta TRIAL” del “Centro de Investigación Príncipe Felipe” (CIPF), que forma parte
del Laboratorio de Oncología Molecular del Fundación de Investigación del Hospital General Univer-
sitario de Valencia (Fi-HgUV) de en el cual he estado adquiriendo experticia con las siguientes téc-
nicas.
 Cultivo de Tejidos: manipulación en cultivos en células adherentes, cultivos 3D, tumoresfe-
ras, ensayos de luminiscencia y viabilidad celular.
 Desarrollo de Co-cultivos.
 Extracción de Proteínas, ARN.
 Microscopía de Fluorescencia y Confocal
 Western Blotting.
4.2.2. Desarrollo de la investigación

O1. Establecimiento de Hidrogeles: Los hidrogeles de PEG mostraron un mayor crecimiento

celular que en matrigel en el tiempo analizado, la máxima cuantificación de viabilidad celular medida
por título celular se obtuvo en las matrices BULK, seguidas de IOPAL 80, IOPAL80+RGD y
BULK+RGD. La viabilidad celular en la matriz de colágeno a una concentración de 2 mg/ml fue
major que la de la matriz de colágeno a la concentración 4 mg/ml. La matriz de matrigel demostró la
viabilidad cel·lular más baja de todas la matrices. Por su parte, en el anàlisis de microscopía
confocal al último día de ensayo, reveló un mayor número de organoides en las matrices BULK,
BULK+RGD, IOPAL80+RGD e IOPAL120. Además, las matrices de colágeno mostraron los niveles
más altos de muerte celular y porosidad por lo que, se concluyó que no pasarán a la siguiente fase.

Por otro lado, la matriz de matrigel tiene aunque tanga la menor cantidad de organoides y su
crecimiento celular va más lento que las demàs matrices, la muerte celular aparece más tarde que
en las otras matrices.
En conclusión, los resultados obtenidos en la segunda anualidad de esta investigación, mostraron
que las matrices extracelulares artificiales (ECM) pueden formar PDTOs de manera más
reproducible que Matrigel. Además, la matriz de BULK produce los mejores resultados en cuanto a
viabilidad celular, tamaño de organoides y estructura por lo que, continuaremos los siguientes
ensayos con esta matriz. (FIGURA 1).

A) MATRIGEL B) BULK C) BULK+RGD D) IOPAL 80uM

E) IOPAL F) IOPAL 120uM G) COLLAGEN H) COLLAGEN

80uM+RGD (4mg/ml) (2mg/ml)

Figura 1. Fotografías de BF e IF con C/PI a los 14 días en las diferentes matrices; A. Matrigel; B.
BULK, C. A BULK+RGD, D. IOPAL80μm, E. IOPAL80μm+RGD, F. IOPAL120μm, G y H. Colá-
geno murino tipo I a 4 mg/m y 2 mg/ml respectivamente. (RGD, arginina-glicina-aspártico ácido;
BF, microscopía Bright Fieldd; IF, Inmunofluorescencia; C/PI, Calceína y Yoduro de Propidio).

Establecimiento de Co-cultivos: Los resultados preliminares en tumoresferas, PBMCs y TCD4+

fueron favorables por lo que se daría paso a iniciar los ensayos con PDTOs.
 En cuanto al tipo de placa con fondo plano se observó con microscopía confocal que las cé-
lulas presentaban un desarrollo favorable en cuanto a su morfología y en placa de fondo re-
dondo la formación de la tumoresfera presentaba una morfología esferoidal simétrica.
 Por microscopia de fluorescencia se pudo observar una mayor infiltración con PBMCS que
con células T CD4+ enriquecidas en la tumoresfera.
 En cuanto al tipo de medio, se observó a los linfocitos rodeando por completo el esferoide y
 que han infiltrado en menor cantidad la esfera con RPMI. Con el medio XVIVO20 se obtuvie-
ron mejores resultados (Figura 2). Se observa mayor infiltración de los linfocitos con medio
de cultivo XVIVO20 en los todos los ensayos. La interrupción de la integridad del esferoide
parece ser mayor con este medio que con el medio RPMI1640 al estar en contacto con
PBMC alógenas (Figura 2). El medio XVIVO20 es específico para células reactivas T por lo
que, es una opción viable para utilizarlo a futuro en los siguientes experimentos como activa-
dor de Linfocitos T.
 La adición o no de IL-2 no evidenció diferencias significativas con PBMCs con el medio
RPMI-1640 o el medio XVIVO20 por microscopía de fluorescencia, por lo que, es necesario
más ensayos con otro tipo de pruebas (Figura 2).

Figura 2. Co-Cultivo de Esferas a los 7 días. Infiltración de esferoides por PBMCs alogénicos conduce
a la destrucción de esferoides de la línea celular H1650. A) Con medio RPMI 1640 + Suero Bovino Fetal
(FBS) sin PBMCs; B) Con RPMI+ FBS sin Interleuquina 2 (IL-2) ni PBMCs; C) RPMI + FBS+ IL-2 + PBMCs;
D) Con medio XVIVO20 y sin PBMCs; E) XVIVO20 sin IL-2 ni PBMCs y F) XVIVO20 + IL-2 y PBMCs.
Fotografía 10X.

O2. Se sigue ampliando diariamente el repositorio de muestras tanto de tejido como de PMBC,
obteniendo células y material genético en excelentes condiciones para su análisis posterior.
Además, se ha ampliado la base de datos del FIS con información genética valiosa para los análisis
posteriores. Además, se comenzó el análisis de posibles marcadores a analizar en los organoides
de las matrices que se obtengan los mejores resultados en número, tamaño, forma y viabilidad
celular.

4.2.3. Difusión de los resultados

Los primeros ensayos con PTDOs han sido revisados por los grupos colaborativos que forman
parte de la investigación y han aprovados para avanzar a la siguiente fase del proyecto. Por tanto,
los primeros resultados obtenidos con las diferentes matrices para el desarrollo de PTDOs ya se
han difundido con la participación en el congreso nacional que se menciona a continuación:
  Título: Optimization of extracellular matrices as an alternative to Matrigel for Patient
Derived Tumor Organoids (PDTO) development.
 Autores: Lissette Anahí Boada-Acosta, Susana Torres-Martínez; Adrian Rodriguez-
Rodriguez; Miquel Castellote-Borrell; Eva Escorihuela; Ester Munera-Maravilla; Barbara
Blanco; Nuno Miranda; Silvia Calabuig-Fariñas; Patricia Pérez Galán; Judith Guasch; Carlos
Camps y Eloisa Jantus-Lewintre.
 Nombre del congreso: Workshop Workmodules: Immuno-Oncology, Experimental Models
and Liquid Biopsy.
 Ciudad de celebración: Sevilla-España.
 Fecha de celebración: 25/05/2023.
 Fecha de finalización: 26/05/2023.
 Entidad organizadora: Internacional Society of Liquid Biopsy (ISLB).
 Formato: Póster

En cuanto a la colaboración en otras actividades del laboratorio, he participado en actividades de

difusión en congresos nacionales e internacionales que se mencionan a continuación.
 Title: Soluble immune-related factors are associated with response to neoadjuvant
chemotherapy in triple-negative breast cancer
 Authors: Susana Torres-Martínez, Anahí Boada-Acosta, Martín Núñez, Eva Escorihuela,
J.A. García García, M. José Godes, Camps, E. Jantus Lewintre, Vega Iranzo, Silvia
Calabuig-Fariñas.
 Nombre del congreso: “4th Annual Congress ISLB Congress”
 Ciudad de celebración: Miami, Florida
 Fecha de celebración: Octubre 20/10/2022 Fecha de finalización: 22/10/2022
 Entidad organizadora: Internacional Society of Liquid Biopsy (ISLB).

Valencia, 22 de enero de 2024

La persona investigadora contractada

La persona investigadora contratada
 Signatura/firma: ______________________________

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part de la Direcció General de Ciència.i Investigació
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