Prácticas de Laboratorio Avanzadas 2022-10

BONO: Análisis de un artículo científico de profundización

Bono Prácticas de Laboratorio Avanzadas

La diversidad estructural y funcional de las proteínas las hace buenas candidatas para el desarrollo de
distintas drogas, por lo que los tratamientos basados en proteínas han cogido bastante fuerza y se han
desarrollado para tratar una gran variedad de enfermedades. Sin embargo, uno de los mayores retos
que suponen estas terapias es que la mayoría de las proteínas no pueden pasar a través de las
membranas celulares, lo cual limita sus blancos biológicos a moléculas que estén presentes en la
superficie celular o en el fluido extracelular. Con esto en mente, se han desarrollado distintas
tecnologías para abordar el problema del suministro intracelular de proteínas. Los autores señalan que
una estrategia popular es el uso de agentes lipídicos o poliméricos de transfección para el suministro
de proteínas o DNA dentro de las células, pero mencionan que estos agentes de transfección por lo
general exhiben alta citotoxicidad y a veces es difícil realizar la liberación exitosa de las moléculas
en células que son difíciles de transfectar. Si bien esto último representa aún un reto gigante en la
liberación de los medicamentos, lo primero relacionado con la citotoxicidad ha tenido grandes
avances y no consideramos que sea de los mayores inconvenientes de estas estrategias, pues en el
desarrollo de vehículos de liberación controlada se han estudiado diferentes biomateriales como el
quitosano, PLGA o alginato los cuales tienen una respuesta muy poco citotóxica, son biodegradables
y biocompatibles. También, de esta estrategia nos parece interesante que en la práctica se puede
entregar el DNA que codifica para la proteína, en vez de la proteína en sí. Dado que lo que se quiere
es transfectar células eucariotas, estas cuentan con mecanismos de modificación post traduccional o
incluso sistemas de glicosilación que llevan a la expresión de una proteína bien plegada, con
conformación final funcional. Además del uso de vehículos de liberación, los autores señalan otros
métodos como la electroporación o la microinyección, pero señalan que son inadecuados para las
terapias basadas en proteínas y además requieren instrumentos especiales. También, el uso del péptido
CPP, el cual es útil para la entrega de proteínas pero presenta una eficiencia muy reducida.

Con esto en mente, los autores traen a colación la toxina del cólera, la cual es una toxina bacteriana
que se puede transportar intracelularmente. Su subunidad A es la porción tóxica del complejo,
mientras que su subunidad B se una al gangliósido GM1 de la superficie celular y media la
internalización del complejos. Teniendo en cuenta que el receptor de la toxina del cólera, el
gangliósido GM1, es el más abundante en las células del sistema nervioso, la entrega de drogas
terapéuticas mediante el uso de esta toxina tiene un tejido blanco limitado y por lo tanto sus
aplicaciones son limitadas. Por ejemplo, no sería muy útil para la liberación local y controlada de
fármacos para el tratamiento del cáncer gástrico, que es una de las mayores causas de muerte en el
mundo. Los autores también señalan que la toxina entra a la célula por endocitosis, luego es
transportada al retículo endoplásmico y posteriormente la subunidad A se transloca del retículo al
citosol. Por lo tanto, proponen un método para la administración intracelular de proteínas usando la
toxina químicamente modificada CtxB.

Los autores trabajan con la proteína verde fluorescente (GFP), la cual conjugan al péptido CtxB con
ayuda de una inteína altamente eficiente. Para esto, los autores reportan que únicamente se deben
mezclar estos 2 componentes y no es necesario incluir agentes químicos entrecruzantes adicionales,
lo cual representa una ventaja muy grande frente a otros métodos ya que no se deben remover dichos
químicos con procesos adicionales de purificación. Adicionalmente, los autores notaron que este era
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un proceso altamente eficiente, pues al cabo de 10 minutos ya era posible observar que se habían
conjugado las proteínas. Esto se pudo comprobar mediante un SDS-PAGE (Figura 1b), donde
pudieron notar que la banda obtenida correspondiente a la proteína fusión GtxB-GFP de
aproximadamente 44 kDa era bastante intensa al cabo de 10 minutos de haberse llevado la reacción
de conjugación. En este gel, los autores señalan que los péptidos CfaC y CfaN no se pueden observar
debido a que tienen un peso molecular bastante reducido. Sin embargo, es posible disminuir el tamaño
de los poros del gel aumentando la concentración de poliacrilamida del gel de separación, lo cual
aumentaría la densidad de la matriz polimérica. Alternativamente, se podría aumentar la cantidad de
entrecruzante empleado (TEMED) para aumentar el grado de entrecruzamiento del gel. No obstante,
toca tener cuidado para que, después de realizar esto, aún sea posible distinguir las bandas más
pesadas en el gel.

Para ver que la GFP se ha internalizado en la célula correctamente, los autores emplean microscopía
confocal. Tiñen el DNA de azul con Hoechst, el RE de rojo con ER tracker Red y visualizan la
internalización de la GFP que emite luz verde. Esto les permite concluir que el GFP se adhiere a la
membrana celular un buen tiempo debido a la afinidad de la GtxB por los gangliósidos membranales,
pero luego se distribuye intracelularmente. Al ver la superposición de los canales de fluorescencia,
los autores notaron que la GFP se había distribuido en el RE, el citosol y los lisosomas o endosomas.
El uso de estas técnicas en aplicaciones reales de investigación demuestran la utilidad de los
contenidos aprendidos en los cursos de prácticas de laboratorio, pues en el curso de prácticas básicas
tuvimos un acercamiento inicial a este tipo de microscopía.

Adicionalmente, los autores señalaban los problemas de citotoxicidad del uso de vehículos de
liberación lipídicos o poliméricos, pero no realizan pruebas de citotoxicidad en las células que
emplean para evaluar el potencial tóxico del sistema de liberación que proponen. Si bien únicamente
emplean la subunidad B de la toxina y se conoce que la subunidad A es la porción tóxica del complejo,
igual habría sido valioso que realizaran la prueba de citotoxicidad para tener resultados más
completos, especialmente teniendo en cuenta que están trabajando con una toxina bacteriana que
causa enfermedad. También, podrían haber evaluado el potencial inmunogénico de su sistema, pues
para posible aplicación en terapia anticancerígena como proponen en su discusión es importante que
este sistema no genere una reacción inmune importante en los pacientes ya que puede generar efectos
contraproducentes.

Finalmente, una de las técnicas que resalta el artículo que demuestra su gran utilidad y aplicabilidad,
y que se empleó durante el curso de prácticas avanzadas fue el SDS-PAGE, un sistema electroforético
que logra separar proteínas mediante el paso de corriente, el cual le permite a cada una viajar a través
del gel hacia el electrodo. Adicionalmente, contiene un detergente iónico que se encuentra en el SDS
el cual se une a la masa de las proteínas y las hace uniformemente negativas. Esta técnica posee
grandes ventajas para el campo de la investigación de las ciencias biológicas, como determinar el
peso molecular de las proteínas de una muestra o detectar proteínas específicas, sin embargo, su uso
se ha centrado en identificar diferentes especies con base a la masa de la proteína.