MABS

2018, VOL. 10, núm. 2, 315–324

https://doi.org/10.1080/19420862.2017.1409319

REPORTE

Eliminación del tumor por la proteína de fusión de doble orientación CD47/PD-L1 que involucra
respuestas inmunitarias innatas y adaptativas

Deshuesando a Liu* ,a,b,f,†, Huaizu Guoc,†, Jin Xuc,†, Ting Qinab , Qingcheng Guoc , nana gud , Dapeng Zhangad , Weizhu Qianag ,
Jianxin Daic , Sheng Houc , Hao Wanga,d ,y Yajun Guoa,e,g
a b
Departamento de Biología Molecular, Laboratorio Estatal Clave de Medicina de Anticuerpos y Terapia Dirigida, Shanghái, China; Departamento de Molecular
C
Biología, Escuela de Biociencia y Bioingeniería, Universidad Tecnológica del Sur de China, Guangzhou, China; Departamento de I+D, Shanghái Sinomab
d mi
Biotechnology Co., Shanghái, China; Ciencias, Facultad de
Departamento deFarmacia, Universidad
I+D, Shanghai de Liaocheng,
Zhangjiang Liaocheng,
Biotechnology China; y China;
Co., Shanghai, Departamento de Biofarmacia
F
Administración de Drogas, Beijing, China; Departamento de Farmacia para Productos Biológicos, Centro de Evaluación de Medicamentos, China Food
Departamento de AIMBL, Instituto de Biología Molecular y Celular, Proteos, Singapur
gramo

RESUMEN El HISTORIA DEL ARTÍCULO

Recibido el 18 de julio de 2017
sistema inmunológico del huésped generalmente sirve como barrera contra la formación de tumores. El ligando de muerte programada 1 (PD-L1) es una señal crítica de "no me
Revisado el 29 de octubre de 2017
encuentres" para el sistema inmunitario adaptativo, mientras que el CD47 transmite una señal antifagocítica, conocida como la señal de "no me comas", al sistema inmunitario
Aceptado el 19 de noviembre de 2017
innato. sistema inmunitario. Estos y otros puntos de control inmunitarios similares a menudo se sobreexpresan en los tumores humanos. Por lo tanto, la orientación dual tanto de
los puntos de control inmunitarios innatos como adaptativos probablemente maximizaría el efecto terapéutico antitumoral y provocaría respuestas más duraderas. En este PALABRAS
documento, en función de la región variable de atezolizumab y el monómero de la variante de consenso 1 (CV1), construimos una proteína de fusión de doble orientación dirigida CLAVE inmunidad adaptativa;
tanto a CD47 como a PD-L1 utilizando la tecnología "Perillas en agujeros", denominada IAB. Fue eficaz para inducir la fagocitosis de las células tumorales, estimular la activación CD47; proteína de fusión de doble
de las células T y mediar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos in vitro. No se observaron signos evidentes de toxicidad hematológica en ratones a los direccionamiento; inmunidad innata;

que se administró IAB en una dosis de 100 mg/kg, y IAB mostró una potente actividad antitumoral en un modelo de ratón inmunocompetente de MC38. Además, el efecto punto de control inmunológico; PD-L1

antitumoral de IAB se vio afectado por el anticuerpo anti-CD8 o los liposomas de clodronato, lo que implicaba que tanto las células T CD8C como los macrófagos eran necesarios
para la eficacia antitumoral de IAB y IAB desempeña un papel esencial en la participación de los innatos. y respuestas inmunitarias adaptativas. En conjunto, estos resultados
demuestran la capacidad de una respuesta inmunitaria endógena provocada contra los tumores y aclaran las características esenciales de la respuesta inmunitaria innata y
adaptativa sinérgica, e indican que el bloqueo dual de CD47 y PD-L1 por IAB puede ser una terapia sinérgica que activa tanto la innata como la adaptativa. respuesta inmune
contra los tumores.

Introducción

Cuando el sistema inmunitario del huésped no logra bloquear la formación de logró una tasa de respuesta objetiva (ORR) de alrededor del 30 % en varios

tumores, la activación de la respuesta inmunitaria podría contribuir a la regresión tumores sólidos, y la mayoría de los pacientes son resistentes o recaen después

del tumor.1 Las terapias de bloqueo del punto de control inmunitario demuestran de un período de tratamiento, lo que destaca la necesidad de combinar anticuerpos
anti-PD-1/L1 con otros moléculas antagonistas del punto de control inmunitario o
que una respuesta inmunitaria endógena puede hacer retroceder los tumores
humanos, pero las respuestas significativas permanecen restringidas a una minoría terapias convencionales.2,7,8 La fagocitosis es un proceso esencial utilizado por

de pacientes.2 ,3 La PD-1 (muerte programada-1) expresada en las células T un organismo para la eliminación de patógenos o células apoptóticas; sin

efectoras participa en la tolerancia periférica y desempeña un papel clave en la embargo, se propone que el aumento de la expresión de CD47 es un mecanismo

supresión inmunitaria en el cáncer y las enfermedades infecciosas crónicas. a través del cual las células cancerosas evaden la detección inmunitaria y la

Cuando se une a su ligando PD-L1, que se expresa en gran medida en la superficie fagocitosis. CD47, una proteína transmembrana ampliamente expresada, transmite

de las células tumorales, PD-1 podría enviar al sistema inmunitario una señal de una señal de "no me comas" a los macrófagos circulantes a través de su receptor

"no me encuentres"4 que inhibe la respuesta inmunitaria mediada por células T y regulador de señales. proteína latoria-a (SIRPa). SIRPaligation en macrófagos y

contribuye a la formación de tumores. evasión inmune. células dendríticas inicia una cascada de señalización que culmina en la inhibición

Varios anticuerpos monoclonales (mAb) anti-PD-1 o anti-PD-L1 actualmente están de la fagocitosis de las células tumorales.9,10 Los cánceres humanos expresan

proporcionando evidencia de beneficio clínico en subgrupos de pacientes con ampliamente CD47, y se ha demostrado que los niveles de expresión de ARNm de

cáncer.5 Atezolizumab (MPDL3280A), un anticuerpo anti-PD-L1, ha mostrado CD47 se correlacionan con malos resultados clínicos en neoplasias malignas

resultados prometedores en pacientes con tumores localmente avanzados o hematológicas11,12 y la mayoría de los tumores sólidos.13 Se ha demostrado que
metastásicos6. Sin embargo, cada modalidad de tratamiento tiene limitaciones. los anticuerpos anti CD47 promueven la fagocitosis en

Tratamiento con bloqueo de PD-1/PD-L1

CONTACTO Hao Wang hwang_smmu@163.com; Yajun Guo yajun.guo@sinomabtech.com Se puede acceder a los datos complementarios

de este artículo en el sitio web del editor.

*Dirección actual: Centro para la Evaluación de Medicamentos, Administración de Alimentos y Medicamentos de China, Beijing China. y
Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo. © 2018 Taylor & Francis Group, LLC
316 B. LIU Y AL.
in vitro e inhibir el crecimiento del tumor, e incluso simultáneamente
indujo una respuesta inmunitaria de células T antitumorales in vivo.14 En consecuencia,
los mAbs dirigidos a CD4711,13 o SIPRa de alta afinidad (CV1)15
fueron desarrollados. Dada la expresión omnipresente del objetivo, el
“sumidero de drogas” representado por eritrocitos, plaquetas y otros
Las células que expresan CD47 pueden conducir a una rápida eliminación de mAb
anti CD47 y toxicidades en el objetivo, como la anemia. Para superar estas
limitaciones, el bloqueo de la interacción de CD47-SIRPa con
fragmentos variables monocatenarios,16 Monómero CV1 sin Fc,15
Velcro-CD47,17 y anticuerpos biespecíficos dirigidos tanto a CD47
y se desarrollaron otros antígenos relacionados con tumores18 . CD47 tiene
surgió así como un objetivo prometedor para la inmunoterapia contra el cáncer.
Aunque la interacción SIRPa-CD47 puede servir como principal
señal reguladora de "no me comas" en macrófagos, trabajo reciente
había demostrado que la sobreexpresión de PD-1 en ratones y
macrófagos asociados a tumores humanos (TAM) inhibidos
fagocitosis de células cancerosas por TAMs.19,20 Además, MYC
Se descubrió que el oncogén induce la expresión de CD47 y PD L1, y la inactivación
de MYC en tumores de ratón está regulada negativamente.
Expresión de CD47 y PD-L1 y mejoró el antitumoral
respuesta inmune.4 Moléculas antagonistas de CD47 y PD-L1
sinergia para controlar el crecimiento tumoral B16F10 y prolongar la supervivencia
in vivo,21 y la combinación de consenso de alta afinidad (HAC) anti-PD-L1 humano y
anticuerpo anti-CD47 mostró una tendencia
hacia el aumento de la supervivencia en el modelo de xenoinjerto DLD-1
más que la monoterapia.19 Juntos, estos hallazgos sugirieron
que la combinación de la inmunoterapia dirigida a CD47
y el anticuerpo anti-PD-L1 puede ser esencial en la inmunoterapia posterior para
impulsar la respuesta antitumoral del huésped mediante la activación
de macrófagos y restauración de las funciones de las células T efectoras.
Aquí, con base en la región variable (VH y VL) del anticuerpo anti-PD L1
(atezolizumab) y el monómero CV1, desarrollamos un
Proteína de fusión de orientación dual (indicada como IAB) que utiliza tecnología de
"perillas en agujeros". Estudiamos la capacidad de IAB para activar macrófagos y
células T in vitro, y su efecto antitumoral en
modelo de ratón inmunocompetente de MC38. Nuestros resultados muestran
que tanto las células T CD8C como los macrófagos eran necesarios para la
eficacia antitumoral de IAB. En conclusión, el bloqueo dual de PD L1 y CD47 por
parte de IAB representa un potencial inmunoterapéutico.
modalidad en la terapia del cáncer.
Resultados
CD47 y PD-L1 se coexpresaron en células tumorales
Se ha demostrado que los tumores sólidos evaden la inmunidad antitumoral del huésped.
a través de la regulación al alza del punto de control inmunitario PD-L1. CD47
se ha encontrado que se expresa en múltiples tipos de tumores humanos;
la regulación positiva de la expresión de CD47 en cánceres humanos también permite
tumores para evadir la vigilancia del sistema inmunitario innato.9 Como todos
Las células tumorales sólidas y sanguíneas humanas requieren la expresión de CD47 para
suprimir la vigilancia y eliminación de la inmunidad innata fagocítica,
Por lo tanto, CD47 es un objetivo validado para las terapias contra el cáncer.13
Investigamos los niveles de expresión de CD47 y PD-L1 en
las células tumorales sólidas de ratón (4T1, MC38 y CT26) in vivo,
que se han utilizado ampliamente para la evaluación preclínica de
anticuerpos anti-PD-1/L1. Se inocularon líneas de células tumorales de ratón
subcutáneamente en ratones BALB/c o C57BL/6, y el día 10, el
los tumores se extirparon y analizaron por citometría de flujo. Como se muestra
en la Fig. 1, tanto CD47 como PD-L1 se expresaron en el tumor
células. Nuestros resultados anteriores también demostraron la coexpresión de
PD-L1 y CD47 en pacientes con melanoma en la clínica mediante inmunohistoquímica
(Fig. S1). Por lo tanto, concluimos que tanto CD47 como
PD-L1 también puede contribuir al microambiente tumoral
a través de la influencia sobre la fagocitosis de los macrófagos y la activación de las
células T. En consecuencia, especulamos que apuntar tanto a los innatos como a los
los puntos de control inmunitarios adaptativos (CD47 y PD-L1) por una proteína de
fusión de diana dual probablemente maximizarían el efecto terapéutico antitumoral y
provocarían respuestas más duraderas.
Construcción, expresión y caracterización de IAB
Atezolizumab (TECENTRIQ), una IgG1 humana derivada de fagos
Se ha demostrado que el anticuerpo dirigido a PD-L1 tiene propiedades antitumorales.
actividad en ensayos no clínicos y en estudios clínicos, y fue el primero
aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. en mayo
2016.6,22 En relación con SIRPa de tipo salvaje, CV1 es una variante de SIRPa de
alta afinidad diseñada, con afinidad por CD47 » 50 000 veces
aumentado, que exhibió una sinergia notable con todos los mAbs específicos de
tumores probados al aumentar la fagocitosis in vitro y
mejorando las respuestas antitumorales in vivo.15 En este estudio, construimos un
sistema biespecífico dependiente de la inmunidad innata y adaptativa
proteína de fusión (indicada como IAB) basada en la región variable de
atezolizumab y monómero CV1 en un esqueleto de IgG1 utilizando
Tecnología de “perillas en agujeros” (como se muestra en la Fig. 2A).
El IAB se expresó de manera estable por ovario de hámster chino
(CHO) células. El compuesto final contenía aproximadamente un 5 % de homodímeros
y agregados, según lo medido por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Fig.
2B), en línea con otros "Perillas en agujeros"
anticuerpos producidos por células CHO.23,24 IAB luego se caracterizó por SDS-
PAGE no reductora y reductora (Fig. S2), y se
también se analizó a nivel de proteína intacta mediante cromatografía líquida-
espectrometría de masas (LC-MS). Como se muestra en la Fig. 2C, la masa
de los picos principales estaban en buen acuerdo con el heterodímero esperado
con modificaciones postraduccionales.
Para confirmar la actividad de unión dual de IAB a cada antígeno,
la actividad de unión de CD47/PD-L1 de IAB se evaluó mediante un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) competitivo. Como se muestra
en la Fig. 3A-B, la afinidad de IAB por CD47 (IC50 D 2.897) fue de aproximadamente
» Disminución de 3 veces en comparación con la avidez de CV1Fc (dos CV1
dominios) (IC50 D 0.918), mientras que la afinidad de IAB a PD-L1 (IC50
D 11.76) se redujo aproximadamente 10 veces en comparación con la avidez de
atezolizumab (IC50 D 0,948). Dado que IAB tenía un fragmento de unión al antígeno
anti-PD-L1 y un dominio CV1, se consideró que
IAB tenía menor afinidad por cada antígeno que los clones parentales,
lo cual era consistente con el informe anterior.25 Adicionalmente, el
actividad de unión de IAB con células tumorales de ratón (MC38) y
Las células tumorales humanas (HL60) se investigaron mediante un ensayo de unión
basado en citometría de flujo (Fig. S3).
Estos resultados demuestran que IAB, proteína de fusión heterodimérica
aglicosilada Fc, se preparó con éxito usando el
Plataforma “Pomos en agujeros”.
Células mononucleares de sangre periférica humana in vitro
y activación de macrófagos murinos
Debido a que IAB mostró un comportamiento de unión de CD47/PD-L1 que era
similar a las proteínas parentales, investigamos si el
 MAB 317

Figura 1. Coexpresión de CD47 y PD-L1 en células tumorales de ratón in vivo. Análisis de citometría de flujo representativo después de la tinción con anticuerpo anti-PD-L1 o anti-CD47 (línea
continua) y anticuerpo de isotipo como control negativo (línea de puntos). A y D: células tumorales 4T1; B y E: células tumorales MC38; C y F: células tumorales CT26.

los efectos de activación de IAB permanecieron. En primer lugar, la estimulación de o IAB mejoró significativamente la IL-2 de PBMC estimulada por SEB
células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con BIA secreción. Posteriormente, investigamos si IAB promueve
y superantígeno Staphylococcal enterotoxin B (SEB) se llevó a cabo. Como se fagocitosis de macrófagos. murino marcado con fluorescencia
muestra en la Fig. 3C, bloqueo de PD-L1 por atezolizumab células tumorales MC38 y macrófagos (RAW264.7) fueron co

Figura 2. Diseño y caracterización de BIA. (A) El diagrama esquemático de IAB. (B) Cromatograma SEC (SEC-UPLC) de IAB. (C) El análisis de MS indica la masa de los picos principales
estaban en buen acuerdo con el heterodímero esperado con modificaciones postraduccionales. -2K,G0F(2): IAB-Lisina C-TERM(2), Glicosilación G0F(2), Masa esperada:
113784Da, error de masa: 9,94 ppm; -2K,G0F,G1F: IAB-Lisina C-TERM(2), Glicosilación G0F, Glicosilación G1F, Masa esperada: 113946Da, Error de masa: 26,88 ppm; -2K,G1F(2):
IAB-Lisina C-TERM(2), Glicosilación G1F(2), Masa esperada: 114108Da, Error de masa: 48,54Da.
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Figura 3. Ensayo de unión competitiva y activación in vitro de PBMC humanos y macrófagos murinos. La inhibición competitiva de la unión de IAB a PD-L1 (A) o CD47 (B) se evaluó mediante un
ensayo ELISA competitivo (n D 2). (C) Aumento de la dosis en la secreción de IL-2 inducida por IAB en comparación con CV1 y atezolizumab en PBMC estimuladas por SEB de forma dependiente
de la dosis (n D 3). (D) Fagocitosis mediada por IAB de MC38, las células MC38 marcadas con CFSE se incubaron con macrófagos murinos (RAW264.7) y se indicaron anticuerpos/proteínas, el
índice de fagocitosis se determinó mediante citometría de flujo (n D 5). Los datos se reportan como los medios § SD, : p < 0,001; NS: no significativo (prueba t de Student no apareada).

cultivadas en presencia de IAB o proteínas parentales, y el índice
fagocítico se calculó como el porcentaje de células CFSEC fagocitadas.
Como se muestra en la Fig. 3D, los macrófagos fagocitaron células
tumorales MC38 a baja frecuencia en presencia de atezolizumab (5,4%).
Sin embargo, CV1Fc (50,2%) e IAB (31,8%) aumentaron significativamente informados previamente.6 Además, se asumió que la menor afinidad de
la fagocitosis de MC38. Estos resultados fueron consistentes con nuestro
estudio preliminar de que CV1 aumentó la fagocitosis de células tumorales una menor actividad de ADCC inducida por IAB en comparación con CV1
por macrófagos de ratón in vitro,26 y validados por macrófagos derivados
de médula ósea de ratón mediante microscopía de inmunofluorescencia
(Fig. S4). Estos datos revelaron que IAB fue eficaz para inducir la
fagocitosis por macrófagos y estimular la activación de células T in vitro.
El BIA exhibe una actividad de citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos superior in vitro y una toxicidad sanguínea
mínima in vivo Hasta donde sabemos, la mayoría de los anticuerpos anti-
PD-1/PD-L1 en desarrollo clínico son del isotipo IgG4 (nivolumab,27
pembrolizumab28) , que no media la citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos (ADCC), o del isotipo IgG1 deficiente en
unión a FcgR (atezolizumab,6 MEDI473629), que está diseñado para
eliminar la actividad de ADCC.30,31 Sin embargo, un estudio reciente ha
demostrado que avelumab (MSB0010718C) media eficazmente la ADCC
de células tumorales que expresan PD-L1 in vitro; solo se observaron
niveles menores de lisis por ADCC cuando se usaron PBMC no
estimuladas como objetivos.32 Además, también se demostró que la
participación del receptor Fcg aumenta la actividad antitumoral de los
anticuerpos anti-PD-L1,30 lo que apoyó el uso de anticuerpos anti-PD .
-Anticuerpo L1 con potente actividad ADCC. Dado que en este estudio
se eligió el esqueleto de IgG1 de tipo salvaje para IAB, el potencial de
ADCC de IAB también se evaluó en un ensayo de gen indicador, que es
equivalente a un bioensayo de ADCC con lactato deshidrogenasa para
evaluar la actividad de ADCC. Como se muestra en la Fig. 4A, IAB fue
más potente que el anticuerpo anti-PD-L1 original para inducir ADCC en
baja concentración. Además, el ensayo ADCC
mostró que IAB era capaz de activar la señalización del indicador de
luciferasa ADCC de una manera marcadamente dependiente de la dosis
que es similar a CV1 Fc. Atezolizumab con mutación IgG1 principal
(N297A) no indujo ADCC in vitro, lo que concuerda con los resultados
IAB por las células MC38 en comparación con CV1 Fc puede resultar en
Fc.
Debido a la expresión generalizada de CD47 en células tumorales y
células normales, estas estrategias dirigidas a CD47 (anticuerpos anti-
CD47 o CV1 Fc) se ven obstaculizadas por grandes sumideros de
antígenos in vivo y unión celular indiscriminada. Aún más, estos factores
reducen la biodisponibilidad de mAb anti-CD47 y aumentan el riesgo de
toxicidad sanguínea in vivo. PD-L1 muestra un amplio perfil de expresión
desde células tumorales hasta células inmunitarias, particularmente alto
en sitios inmunoprivilegiados del cuerpo. Su expresión relativa podría ser
mayor en tejidos tumorales. Por lo tanto, la administración específica del
tumor del antagonista de CD47 generaría un mejor efecto antitumoral
con menos efectos secundarios que la administración sistémica. Para
evaluar la toxicidad hematológica de IAB in vivo, se analizaron muestras
de sangre de ratones BALB/c sanos tratados con altas dosis de IAB o
proteína original (100 mg/Kg). Como se ilustra en la Fig. 4 BD, no se
observó ningún signo evidente de toxicidad hematológica para IAB
inyectado en ratones a la dosis de 100 mg/kg, mientras que los glóbulos
rojos, el hematocrito y la hemoglobina se redujeron drásticamente para
los ratones inyectados con CV1 Fc. Nuestros resultados también
concuerdan con los informados para otras moléculas antagonistas de
CD47 en formato biespecífico de doble diana.18,33
Tanto la inmunidad innata como la adaptativa son esenciales
para la regresión tumoral mediada por BIA
Anteriormente, se informó que las moléculas antagonistas de CD47 se
sinergizan con otros anticuerpos específicos de tumores para promover
la erradicación de tumores mediada por macrófagos en una variedad de
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Figura 4. IAB muestra una actividad ADCC superior in vitro y una toxicidad sanguínea mínima in vivo. (A) Actividad relativa de ADCC de IAB, CV1 Fc y atezolizumab en el ensayo de
indicador ADCC. (n D 3); Análisis de glóbulos rojos (B), hematocrito (C) y hemoglobina (D) en ratones inyectados intraperitonealmente con 100 mg/Kg de IAB o proteínas parentales (n D
5). Los datos se informan como las medias § SD, : p<0,05, : p <0,01, : p <0,001; NS: no significativo (prueba t de Student no apareada).

modelos de ratón xenogénicos de cáncer humano.21 Sin embargo, el los modelos tumorales se generaron utilizando anticuerpos anti-CD8
uso de huéspedes inmunocomprometidos (células T, células NK y o clodronato liposomal. En ausencia de células T CD8C o macrófagos,
células B deficientes) ha impedido la evaluación del papel de la el efecto terapéutico de IAB se anuló drásticamente (se muestra en la
inmunidad adaptativa. Para explorar los efectos antitumorales Fig. 5 CD), lo que implicaba que tanto las células T CD8C como los
sinérgicos del IAB in vivo, en nuestro estudio se utilizó un huésped macrófagos eran necesarios para la eficacia antitumoral de IAB y IAB
inmunocompetente que albergaba un tumor singénico (MC38). juega un papel esencial para activar las respuestas inmunitarias innatas
Después de implantar células tumorales MC38 por vía subcutánea en y adaptativas.
el flanco de ratones C57BL/6, IAB, se administraron anticuerpos
indicados (10 mg/Kg) o IgG de control mediante inyección intratumoral
Discusión
(en los días 7, 10), lo que podría evitar el “antígeno”. sumidero”
inducido por células normales que expresan CD47. Como se muestra Aprovechar el sistema inmunitario contra el cáncer se está convirtiendo
en la Fig. 5A, tanto CV1Fc como atezolizumab fueron eficaces para en una opción de terapia cada vez más eficaz que puede generar
retrasar la progresión del tumor MC38 (824§ 113 mm3 o 280§ 61 respuestas drásticas y duraderas en varios tipos de cáncer . estos dos
mm3 ). Es particularmente notable que el tratamiento con BIA dio como objetivos podrían tener efectos antitumorales duraderos y una toxicidad
resultado una regresión tumoral rápida y casi completa (58 x 37 mm3 ). relacionada con el sistema inmunitario tolerable. No obstante, es
Estos resultados indican que IAB exhibió una potente actividad importante recordar que al menos el 70 % de los pacientes con cáncer
antitumoral en un modelo de ratón inmunocompetente y que IAB pudo no han respondido muy bien al tratamiento con anticuerpos anti-
recapitular el efecto sinérgico de anti-CD47 y anti-PD-L1. PD-1,36 lo que sugiere que el bloqueo de PD-1 como monoterapia
Para investigar si la respuesta inmunitaria activada por IAB podría puede tener éxito en el contexto de un tratamiento previo . respuesta
provocar una inmunidad antitumoral duradera, los ratones que inmune antitumoral existente en el paciente.37 Estudios clínicos o
sobrevivieron después de un ciclo inicial de tratamiento con IAB se volvieron a
preclínicos recientes sugirieron que los anticuerpos anti-PD-L1 en
desafiado con células MC38 (1 £ 106 células) en el flanco contralateral. combinación con antagonistas de otros puntos de control, como
Como se muestra en la Fig. 5B, todos los ratones que sobrevivieron a CTLA-4,38 LAG-3,39 pueden producir inmunidad antitumoral aditiva o
un desafío primario rechazaron un desafío secundario con MC38. Los sinérgica. . En nuestro estudio, se aplicó el bloqueo dual de CD47 y
resultados demuestran que el tratamiento con BIA puede provocar una PD L1 para aumentar la inmunidad innata y adaptativa del huésped,
memoria inmunitaria sistémica duradera para prevenir recaídas, lo que según los hallazgos de que las células cancerosas en el microambiente
también coincidía con observaciones anteriores de que dirigirse tanto tumoral pueden regular al alza CD47 y PD-L1 simultáneamente.
a CD47 como a PD-L1 puede potenciar el efecto vacunal de la
respuesta antitumoral.21,34 Para probar el papel esencial de la Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) representan una clase
respuesta antitumoral innata y sistema inmunitario adaptativo para emergente de terapias de anticuerpos que exhiben una unión específica
el control tumoral mediado por IAB en tumores de ratón, ratones C57BL/ a 2 antígenos diferentes. Se han diseñado muchos formatos de BsAbs
6 sin células CD8CT o sin macrófagos utilizando enfoques recombinantes, incluidos BsAbs similares a IgG, dual
320 B. LIU Y AL.

Figura 5. El efecto antitumoral duradero del IAB depende tanto de la inmunidad innata como de la adaptativa. (A) Efecto antitumoral: a los ratones C57BL/6 (n D 5/grupo) se les inyectaron sc 2 £
105 células MC38 y se trataron intratumoralmente con los anticuerpos indicados a la dosis de 10 mg/kg los días 7 y 10. (B ) El experimento de reexposición: ratones C57BL/6 previamente
administrados con IAB o ratones C57BL/6 salvajes (n D 5/grupo) fueron expuestos sc con 1 £ 106 células MC38. (C) El experimento de agotamiento de CD8C: el tumor MC38 con C57BL/6 (n D 5/
grupo) se trató intratumoralmente con IAB (10 mg/kg) y se inyectó ip con 400 mg de anticuerpo anti-CD8 los días 7 y 10. (D) El experimento de depleción de macrófagos: el tumor MC38 portador de
C57BL/6 (n D 5/grupo) se trató intratumoralmente con IAB (10 mg/kg) los días 7 y 10. Se administraron ip 200 ml de clofosoma o liposoma de control el día 5 y cada 4 días después. Los datos se
reportan como medios § SEM. : p < 0,05, : p < 0,01, : p < 0,001 (prueba t de Student no apareada).
Nota: Para los controles negativos que se muestran en la Figura 5C (grupo de control de IgG) y 5D (grupo de liposomas neutros de control de IgGC), se excluyeron los ratones que tenían un tumor
demasiado grande o pequeño después de la inoculación con MC38; el día 7 después de la inoculación del tumor, los ratones con tumor medible (~100 mm3) se asignaron al azar al grupo de
tratamiento. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). En la Figura 5C, la media§SEM del grupo de control de IgG en los días 7, 10, 14, 17 y 21 fue 89§10, 185§31,
399§51, 726§87, 1297§130, respectivamente. En la Figura 5D, la media §SEM del grupo de liposomas neutros de control de IgG en los días 7, 10, 14, 17 y 21 fue 92§12, 193§20, 410§35, 800§55,
1403§122, respectivamente.

moléculas de dominio variable (DVD) y activadores de células T
biespecíficas (BiTE).40 Aunque la molécula BiTE blinatumomab
(BLINCYTO) está aprobada en los EE. La tecnología "en agujeros"
demuestra propiedades farmacocinéticas más similares a las del
anticuerpo convencional.41 Por lo tanto, construimos el IAB utilizando la
tecnología "Perillas en agujeros". Debido a la abundante expresión de
CD47 en células sanas, la eficacia y la seguridad de estas estrategias de
bloqueo de CD47 pueden verse afectadas negativamente por la sumidero
de antígenos, lo que reduciría la biodisponibilidad y aumentaría el riesgo
de toxicidad hematológica in vivo. La ventaja del formato de proteína de
fusión de direccionamiento dual era que la administración específica del
tumor de un antagonista de CD47 generaría mejores efectos antitumorales
con menos efectos secundarios que la administración sistémica. Por
ejemplo, un anticuerpo biespecífico DVD-Ig (inmunoglobulina de dominio
variable dual) dirigido a CD47 y CD20 se une selectivamente y elimina
células de linfoma que expresan antígenos duales, pero se une mal a los
glóbulos rojos humanos.33 De manera similar, IAB fue capaz de inducir
ADCC in vitro , pero no se observó ningún signo evidente de toxicidad
hematológica in vivo, incluso a una dosis alta (100 mg/Kg).
El bloqueo de CD47 mejora la absorción de las células tumorales por
parte de los macrófagos y permite que las células dendríticas procesen y
presenten antígenos tumorales, como lo muestran los hallazgos publicados lo que puede tener un gran impacto en el desarrollo de fármacos
anteriormente.14,34 34 levantando el
posibilidad de combinar terapias dirigidas a CD47 con bloqueo de puntos
de control de células T para desencadenar una respuesta antitumoral
tanto innata como adaptativa. Usando un modelo de ratón
inmunocompetente singénico de MC38, revelamos que IAB podría
recapitular la sinergia terapéutica de la terapia de combinación anti-CD47
y anti-PD-L1. Además, el tratamiento de tumores portadores de ratones
con IAB podría provocar una memoria inmunitaria sistémica duradera
para prevenir la recaída y potenciar el efecto vacunal de la respuesta
antitumoral. Finalmente, demostramos que tanto los macrófagos como
las células T CD8C eran necesarios para la eficacia antitumoral de IAB, y
IAB desempeña un papel esencial para activar las respuestas inmunitarias
innatas y adaptativas.
Recientemente, se ha demostrado que el efecto terapéutico del
anticuerpo anti-HER2/neu42 o cetuximab43 depende tanto de las células
NK como de las células T. Además, las combinaciones de terapia con
anticuerpos e interferón-beta dirigidas al microambiente tumoral podrían
unir las respuestas inmunitarias innata y adaptativa, que es más potente
que la primera generación de anticuerpos para controlar tumores
resistentes a anticuerpos.44 También se informó que Fc/ IL-2 se sinergizó
con el anticuerpo TA99 para controlar el crecimiento de B16F10 mediante
la inducción de una respuesta inmunitaria tanto innata como adaptativa.45
En conjunto, las estrategias utilizadas en este estudio abren caminos para
una respuesta inmunitaria innata y adaptativa sinérgica contra los tumores,
antitumorales. descubrimiento. También se demostró que el IAB dirigido
a PD-L1 y CD47 es un posible candidato a fármaco para el tratamiento del cáncer.

materiales y métodos
Líneas celulares, animales y otros reactivos
La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 se obtuvo del
State Key Laboratory of Antibody Medicine and Targeted Therapy (Shanghai,
China). Se obtuvieron la línea celular de carcinoma de colon metastásico
murino CT26 (CRL-2638), la línea celular de tumor de mama de ratón 4T1
(CRL-2539) y los macrófagos murinos RAW264.7 (TIB-71TM), células de
leucemia promielocítica humana HL 60 (CCL-240) de la American Type
Culture Collection.
Shanghai Sinomab Biotechnology Co (Shanghai, China) produjo CV1
Fc con esqueleto de IgG1 y atezolizumab, como se describió anteriormente.15
IgG antihumano de cabra conjugado con FITC (62-8411) se adquirió de
Thermo Fisher.
El anticuerpo anti-CD8 que agota (cloneLyt2) se produjo internamente. Se
compraron ratones BALB/c o C57BL/6 hembra de tipo salvaje de seis ocho
semanas de edad en el Centro de Animales de Laboratorio de Shanghái
(Institutos de Ciencias Biológicas de Shanghái, Academia de Ciencias de
China; Shanghái, China).
Los ratones fueron sacrificados con asfixia con CO2. Todos los animales
fueron tratados de acuerdo con las directrices del Comité de Animales del
Centro de Investigación de Organismos Modelo de Shanghai. Todos los
experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y bajo
un protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Análisis de coexpresión de PD-L1 y CD47
Se inocularon células tumorales (5 £ 105 ) por vía subcutánea en el dorso
izquierdo afeitado de ratones BALB/c o C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad. En
el día 10, se extirparon los tumores sólidos (>800 mm3 ), se trituraron para serie de enterotoxina estafilocócica B (SEB; Shanghai Sinomab Biotech Co.,
preparar suspensiones de células y se digirieron con colagenasa IV (Invi
trogen, 17104-019) y DNasa I (Stemcell, 07900). Luego, las suspensiones
de células individuales se incubaron posteriormente. con atezolizu mab o
CV1 Fc y control de isotipo (CMAB801, Shanghai Sino mab Biotechnology
Co.). Se usó IgG antihumana de cabra conjugada con FITC (Thermo Fisher)
como anticuerpo secundario, se realizó un análisis de citometría de flujo
adicional en un sistema BD FACSCa libur (BD Biosciences). Todos los
análisis posteriores se realizaron en FlowJo (Treestar Inc.).
Expresión y purificación de proteínas de fusión biespecíficas
La cadena ligera k y la cadena pesada de la subclase de IgG1 humana se
eligieron como el marco básico para IAB utilizando la tecnología de "perillas
en agujeros"; la secuencia de aminoácidos de IAB se proporcionó en el
material complementario (Apéndice 1, 2, 3).
La región variable de atezolizumab se fusionó con los “Perillas”
(T366W) brazo, y CV1 se fusionó con el brazo "Agujeros" (T366S, L368A,
Y407V) (Fc CH2 CH3). La cadena ligera, la cadena pesada (botones) y la
cadena CV1-Fc (agujeros) mencionadas anteriormente se clonaron cada una
en un vector pcDNA3.1 (C).
Luego, los vectores de expresión se cotransfectaron en células CHO K1.
Posteriormente, el IAB se expresó y purificó de acuerdo con los métodos
anteriores.23,46
MAB 321
Caracterización de IAB por SEC-UPLC, LC-MS y ELISA
competitivo
La homogeneidad de IAB se verificó mediante cromatografía de exclusión
por tamaño-cromatografía líquida de ultra rendimiento (SEC UPLC) y el
peso molecular se midió con precisión mediante LC-MS, como se describió
anteriormente.47,48 Se evaluó la actividad de unión de CD47/PD-L1 de
IAB. por ELISA competitivo. Brevemente, las placas ELISA (Costar) se
recubrieron durante la noche a 4 °C con hPD-L1 Fc (Shanghai Sinomab
Biotech Co., ZJ-01-041) o hCD47 Fc (Shanghai Sinomab Biotech Co.,
ZJ-01-053) en solución salina tamponada con fosfato. tampón (PBS). Seguido
de bloqueo con leche en polvo sin grasa al 10% (Bright Dairy, China).
Se aplicaron las concentraciones indicadas de BIA competidor (0,02»1000
ng/mL) a la placa ELISA que contenía atezolizumab conjugado con biotina o
CV1 Fc (Shanghai Sinomab Biotechnology Co., ZJ-01-055), y se incubaron
durante 2 horas a 37 °C. Después de lavar con solución salina tamponada
con fosfato con Tween 20 (PBST, interna), se agregó avi din-HRP
(eBioscience) y se incubó a 37 °C durante 1 h, la detección se realizó
mediante la adición de 3,30,5,50 - tetrametilbencidina reactivo sustrato (TMB)
durante 15 minutos seguido de ácido clorhídrico 2 M. La absorbancia a 450
nm se midió con un lector de placas multimodo SpectraMax M5 (Molecular
Devices) y los datos se ajustaron usando una curva sigmoidal de 4 parámetros
de SoftMaster (Honeywell).
Activación de macrófagos murinos y PBMC humanos in vitro
Se cultivaron PBMC (1 £ 105 /pozo) de donantes sanos independientes (ND
3) usando un kit de purificación de monocitos (Miltenyi Biotec) durante 3 días
a 37C con medio RPMI 1640, anticuerpo indicado (IAB, Atezolizumab, CV1
Fc) e isotipo control (CMAB801, Shanghai Sinomab Biotechnology Co.) a 20
mg/ml en una placa de 96 pocillos (Corning), se añadieron diluciones en
ZJ-01-051) a el inicio del ensayo. Después de 3 días, los niveles de IL-2 en
los sobrenadantes de cultivo se midieron utilizando un kit ELISA para IL-2
humana (eBioscience), como se describió anteriormente.27 Para el ensayo
de fagocitosis in vitro, 5 £ 104 células/pocillo de macrófagos murinos
(RAW264.7 ) se colocaron en placas con 2 £ 105 células MC38 marcadas
con carboxifluoresceindiacetatosuccinimidil éster (CSFE) 0,5 mM en
medio RPMI sin suero en una placa de 96 pocillos de adherencia ultrabaja
(Corning). Se añadieron los 10 mg/ml de anticuerpos indicados (atezolizumab,
CV1Fc o IAB) o el control de isotipo (CMAB801, Shanghai Sinomab
Biotechnology Co.) y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Luego, las células
se lavaron dos veces con PBS, los macrófagos se tiñeron con anticuerpo anti-
ratón F4/80-PE (eBioscience, 12-4801-80) para análisis FACSCanto II (BD
Biosciences). El índice fagocítico se calculó como el porcentaje de células
CFSEC fagocitadas, como se describió previamente14.
ADCC de BIA in vitro
El bioensayo del gen informador ADCC se realizó de acuerdo con el informe
anterior.46,49 Se sembraron células MC38, que sobreexpresaban PD-L1 y
CD47, a razón de 1 £ 104 /pocillo en una placa opaca de cultivo de tejidos
de 96 pocillos. IAB, CV1 Fc o atezolizumab se diluyeron en serie
322 B. LIU Y AL.
y se incubaron con las células MC38 durante aproximadamente 1 h a 37 °C, 5
% de CO2. Después de la incubación, se añadieron células indicadoras de
luciferasa FcgRIIIa que expresan Jurkat (Shanghai Sinomab Biotech Co) (5 £
104 /pocillo) a la mezcla MC38/anticuerpo por pocillo. La mezcla se incubó
durante aproximadamente 4 h a 37 °C, CO2 al 5 % y luego se midió la
producción de luciferasa usando un sustrato luminiscente (Promega Bright Glo).
Toxicidad hematológica del BIA in vivo
A ratones BALB/c sanos de 6 a 8 semanas de edad se les inyectaron
intraperitonealmente (ip) los anticuerpos indicados (atezolizumab, CV1Fc o
IAB) o el control de isotipo (CMAB801, Shanghai Sinomab Bio Technology Co.)
a una dosis de 100 mg/ Kg (n D 5). Al día siguiente, se extrajo sangre del plexo
retroorbitario y se recolectó en tubos de dipotásico-EDTA (BD Biosciences), y
se analizó mediante UniCel DxH800 Coulter Cellular Analysis (Beckman Coulter,
Inc.) en Shanghai Biomodel Organismo Ciencia y Tecnología Development Co.
Efectos antitumorales de IAB y células T CD8 o agotamiento de macrófagos
en ratones inmunocompetentes C57BL/6
El modelo de ratón inmunocompetente se estableció en C57BL/6 hembra de 6
a 8 semanas de edad mediante la implantación subcutánea de 2 £ 105 células
MC38. El día 7 después de la inoculación del tumor, los ratones con tumor
medible (ÿ100 mm3 ) se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento
(n D 5). Los anticuerpos indicados (atezolizumab, CV1Fc o IAB) o el control
negativo (CMAB801, Shanghai Sinomab Bio Technology Co.) en dosis de 10
mg/Kg se administraron intratumoralmente los días 7 y 10. En el experimento
de reexposición al tumor, los ratones que sobrevivieron después de un ciclo
inicial de tratamiento con BIA se volvieron a exponer a células MC38 (1 £ 106
células) en el flanco contralateral. El tamaño del tumor se calculó como longitud
£ anchura2 £ 0,5 mm3
. PD-1
La depleción de células T CD8C o macrófagos en ratones
inmunocompetentes C57BL/6 (n D 5) se logró usando anticuerpos anti CD8 o
clodronato liposomal (FormuMax Scientific) ip, respectivamente, como se
describió previamente.12,34 En experimentos de depleción de CD8C, 400 Se
inyectaron mg de anticuerpo anti-CD8 (clon Lyt2) ip al mismo tiempo que el
tratamiento de BIA. En los experimentos de depleción de macrófagos, se
administraron ip 200 ml de clofosoma o liposomas de control 2 días antes del
tratamiento, y luego se inyectaron 100-200 ml de clofosoma o liposomas de
control cada 4 días en los períodos del tratamiento.
Los ratones fueron sacrificados con asfixia con CO2. Todos los
experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y bajo
un protocolo IACUC.
análisis estadístico
Todos los datos se presentan como medios § SD o SEM. El análisis estadístico
y la preparación de gráficos se realizaron utilizando Prism 6 (GraphPad
Software). Los valores de p se calcularon usando la prueba t de Student
paramétrica no pareada, asumiendo varianzas iguales. Las diferencias
estadísticamente significativas se marcan como p < 0,05, p < 0,005, p < 0,0001.
Divulgación de posibles conflictos de interés
YJ Guo, WZ Qian, HZ Guo, J Xu son coinventores de la patente china No.
CN2016103729544 titulado “Una proteína de fusión de orientación dual dirigida a
CD47 y PD-L1”.
Expresiones de gratitud
Agradecemos el asesoramiento del profesor Yangxin Fu y Yang Pu, Departamento
de Patología y Comité de Inmunología de la Universidad de Chicago. Agradecemos
a Yimei Wu, Huiyong Zhang de Shanghai Sinomab Biotechnology Co., Ltd. por la
preparación de proteínas IAB, y Xiaolian Yang, RuoyuXu de Shanghai Sinomab
Biotechnology Co., Ltd. por su ayuda con los experimentos con animales. Este
trabajo fue apoyado por subvenciones de National Science and Technology Major
Projects para "Major New Drugs Innovation and Development" (2015ZX09101038);
Programa Shanghai Rising-Star (16QB1404300); Programa de I+D de Shanghai
Key Technologies (15431906100, 16431901200, 16431904700, 16142201700,
16430730400, 16DZ1910400); Plataforma de servicio público de desarrollo de
fármacos de anticuerpos de Shanghái (16DZ2292900).
abreviaturas
ADCC Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
Morder Activador biespecífico de células T
Anticuerpos biespecíficos BsAbs
CSFE Carboxifluoresceinsuccinimidyl éster
CV1 Variante de consenso 1
DVD Dominio de doble variable
Inmunoglobulina de dominio variable dual DVD-Ig
Consenso de alta afinidad HAC
IAB Proteína de fusión biespecífica dependiente de la inmunidad
innata y adaptativa
LC-MS Cromatografía líquida-espectrometría de masas mAbs
Anticuerpos monoclonales
ORR Tasa de respuesta objetiva
PBS Solución salina tamponada con fosfato
Solución salina tamponada con fosfato PBST con Tween 20
(Muerte Programada-1)
SEB Enterotoxina estafilocócica B
SEGUNDO
Cromatografía de exclusión por tamaño
TAM Macrófagos asociados a tumores
Cromatografía líquida de ultra rendimiento UPLC
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