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Mem Inst Oswaldo Cruz , Río de Janeiro, vol. 115 : e190407, 2020

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ARTÍCULO ORIGINAL
Detección rápida de ADN y genética de Mycobacterium tuberculosis
marcadores de resistencia a isoniazida en portaobjetos teñidos con Ziehl-Neelsen
Graziele Lima Bello 1 / + , Franciele Costa Leite Morais 1 , Sheile Pinheiro de Jesus 1 ,
Jonas Michel Wolf 1 , Mirela Gehlen 2 , Isabela Neves de Almeida 3 , Lida Jouca de Assis
Figueiredo 3 ,
Tainá dos Santos Soares 4 , Regina Bones Barcellos 5,6 , Elis Regina Dalla Costa 6,7 ,
Silvana Spíndola de Miranda 3 , Maria Lucia Rosa Rossetti 1,4,5,6
1 Universidade Luterana do Brasil, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular Aplicada à Saúde, Canoas, RS, Brasil
2 Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Pneumologia,
Porto Alegre, RS, Brasil
3 Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina, Laboratório de Pesquisa em
Micobactérias, Belo Horizonte, MG, Brasil
4 Universidade Luterana do Brasil, Graduação em Biomedicina, Canoas, RS, Brasil
5 Secretaria do Estado do Rio Grande do Sul, Centro de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico, Porto Alegre, RS, Brasil
6 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Rio
de Janeiro, RJ, Brasil
7 AstraZeneca do Brasil, Cotia, SP, Brasil
ANTECEDENTES Diagnóstico precoz de tuberculosis (TB) e identificación de cepas
de Mycobacterium tuberculosis resistentes a anti-
Los medicamentos antituberculosos se consideran los principales factores para el control de la
enfermedad.
OBJETIVOS Estandarizar una técnica de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en
tiempo real (qPCR) y aplicarla para identificar mutaciones.
involucrado en la resistencia de M. tuberculosis a isoniazida (INH) directamente en portaobjetos
teñidos con Ziehl-Neelsen (ZN).
MÉTODOS Se analizaron 55 muestras de ADN independientes extraídas de aislados clínicos
de M. tuberculosis mediante secuenciación. Para
aplicación en el diagnóstico de TB de resistencia, se utilizaron 59 portaobjetos teñidos con
ZN. La sensibilidad, especificidad e índice Kappa, con un 95%
Se determinó el intervalo de confianza (IC95%).
RESULTADOS La concordancia entre las pruebas fue, para el objetivo katG , el índice Kappa
de 0,89 (IC95%: 0,7-1,0). La sensibilidad y
la especificidad fueron 97,6% (IC95%: 87,7-99,9) y 91,7% (IC95%: 61,5-99,5),
respectivamente. Para inhA , el índice Kappa fue 0,92 (IC95%:
0,8-1,0), la sensibilidad y la especificidad fueron 94,4% (IC95%: 72,7-99,8) y 97,3% (IC95%:
85,8-99,9), respectivamente. El uso de ZN-
los portaobjetos teñidos para la detección de tuberculosis resistente a los medicamentos
mostraron resultados significativos en comparación con otras pruebas estándar de resistencia a
los medicamentos.
CONCLUSIONES PRINCIPALES El genotipado de qPCR demostró ser un método eficaz
para detectar genes que confieren resistencia a M. tuberculosis
a INH. Por tanto, la genotipificación de qPCR puede ser una alternativa en lugar de la
secuenciación.
Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis - Resistencia a isoniazida - Genotipado - PCR en
tiempo real
doi: 10.1590 / 0074-02760190407
GB y JMW fueron apoyados por CAPES (MEC / Brazil-Fellowship. Financiamiento
código 001).
+ Autor para correspondencia: grazilbello@gmail.com
 https://orcid.org/0000-0001-8537-8413
Recibido el 31 de octubre de 2019
Aceptado el 06 de marzo de 2020
Tuberculosis farmacorresistente y multirresistente
(DR / MDR-TB) ha aumentado en todo el mundo, exigiendo la
desarrollo de nuevos ensayos de detección de resistencia a fármacos.
Los principales fármacos utilizados en el tratamiento de primera línea de la tuberculosis son
Isoniazida (INH) y rifampicina (RIF) y resistencia a
ambos medicamentos significa MDR-TB. Hasta hace poco, RIF era
considerado un marcador de MDR-TB, porque con frecuencia
esa resistencia está asociada con la resistencia a INH. Allí
Se han realizado estudios recurrentes que muestran que el agente Myco-
bacteria tuberculosis resistente a INH y sensible a
RIF; es decir, un factor de riesgo de resultados desfavorables. (1)
A nivel mundial, la monoresistencia a INH presentada en 2014
una media global del 9,5% en casos nuevos y del 14% en
TB mal tratada. Se estima que más de 1 millón
las personas desarrollan resistencia a la INH cada año. (2) Sin embargo,
Las pruebas de rutina para la resistencia a INH no se utilizan como primera línea.
pruebas en la mayoría de los escenarios. (3) En Brasil, la prueba más utilizada
para el cribado rápido de la resistencia a los medicamentos antituberculosos (principalmente
centros de salud) es el Gene Xpert MTB / RIF, sin embargo,
solo detecta resistencia a RIF. Molecular comercial
pruebas de hibridación para la detección de resistencia a INH, como
Ensayos de sonda de línea GenoType MTBDR plus ® (Hain Life-
ciencia, Nehren, Alemania), son sensibles y específicos,
pero, en Brasil, solo unos pocos sitios lo utilizan de forma rutinaria y
No se ha evaluado el impacto clínico de esta prueba. (4)
La resistencia a INH se asocia con una amplia variedad
de mutaciones que afectan a uno o más genes, como katG ,
genes inhA , ahpC . En general, las mutaciones en katG y
Los genes inhA se encuentran en el 75-85% de los aislamientos resistentes
a esta droga. (5) La mutación más común en katG
El gen surge en el codón 315 reemplazando el amino de serina.
ácido (AGC) a treonina (ACC), con una disminución en la
acción de la catalasa, importante para la activación de la droga. (6) En
varios estudios en todo el mundo, la frecuencia de INH
cepas resistentes varía de 50 a 100% con la mutación
ción en el codón 315 del gen katG . (7) El gen inhA en-
codifica el portador de ácido graso enoil-ACP reductasa (NADH)
er proteína, que es esencial en la síntesis de micólicos
ácidos en la pared celular de la bacteria. La mutación de
el gen inhA modifica la enzima, que pierde afinidad
para NADH, resultando en resistencia a INH. (8)
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Una de las limitaciones de realizar pruebas moleculares
es el almacenamiento y transporte seguro de muestras de esputo
(potencialmente infeccioso) desde centros de salud remotos hasta
laboratorios centrales. Además, el alto costo y la adecuada
logística de transporte para este tipo de muestra, así
como la devolución de los resultados de la prueba al laboratorio de origen y
para el paciente también puede ser un desafío. En vista de esto,
Portaobjetos teñidos con ZN (que es la primera prueba que se realiza comúnmente
formado en la mayoría de los laboratorios de nivel periférico y de salud
centros en países de bajos ingresos), estarían fácilmente disponibles
capaz y podría ser la herramienta ideal para el transporte seguro del sistema
tación de esputo, análisis de pruebas moleculares y
para el manejo oportuno de los pacientes con tuberculosis. (9)
Así, ante la necesidad de realizar más estudios sobre
la identificación de la resistencia al INH y el desarrollo
tecnologías más rentables, este estudio tuvo como objetivo
para estandarizar e identificar mutaciones involucradas con M.
tuberculosis INH resistencia por polimerasa en tiempo real
Ensayos de genotipado de reacción en cadena (qPCR), utilizando ADN
extraído de aislados clínicos (estandarización) e frotis
muestras de portaobjetos (aplicación en el diagnóstico de TB de resistencia).
MATERIALES Y MÉTODOS
Estandarización del genotipado TaqMan  ® qPCR as-
dice a la detección de resistencia a INH en cultivo de M.
tuberculosis -
Este estudio se realizó utilizando un total
de 55 muestras de ADN independientes extraídas de clínicas
aislamientos cal de M. tuberculosis , según se describe
por Van Soolingen et al., (10) Las muestras se almacenaron a -80ºC
en el Laboratorio de Biología Molecular, en el Centro de
Desarrollo científico y tecnológico (CDCT) de
la Secretaría de Salud del Estado (SES), ubicada en la ciudad de
Porto Alegre, sur de Brasil. Estas muestras de ADN fueron
ya caracterizado por la secuenciación de regiones de genes
involucrado con la resistencia INH). (7) El ADN fue cuantificado por
espectrofotometría usando el SpectraMaxPlus ® (Eppen-
dorf) espectrofotómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
instrucciones. Las concentraciones de 100, 50, 20 y 10
Se evaluaron ng / µL. Las ampliaciones que mostraron
señales de fluorescencia con curvas sigmoidales más detec-
características de la aplicación por qPCR fueron las muestras cuantificadas
con una concentración final de ADN de 20 ng / µL. Esta final
La concentración fue ideal para la identificación de qPCR.
Anteriormente, todos los 55 aislamientos utilizados en el presente
estudio fueron confirmados por contener bacilos acidorresistentes por
detección de microscopía en portaobjetos teñidos con ZN. (11) Estándar
Se realizaron pruebas bacteriológicas y bioquímicas para
diferenciación de las especies dentro de la M. tuberculosis com-
plex (MTBC) y micobacterias distintas de la tuberculosis
(MOTT), incluidas las pruebas bioquímicas de niacina, parani-
ácido trobenoico (PNB) y ácido tiofeno-2-carboxílico hidra-
zine (TCH). (11) Posteriormente, se enviaron los aislamientos
a las pruebas de susceptibilidad a fármacos (DST) utilizando Bactec TM-
Sistema MGIT TM 960, según el fabricante. (12)
Aplicación de TaqMan  ® ensayos de genotipificación qPCR a
la detección de resistencia a INH en ADN extraído de
Portaobjetos teñidos de Ziehl-Neelsen : para la aplicación de
ensayos de qPCR en muestras clínicas, 59 frotis fueron
utilizado del Laboratorio de Micobacterias, Escuela de
Medicina, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG /
Brasil). Estas muestras se sometieron a las siguientes pruebas:
microscopía de frotis de tum (ZN), cultivo sólido de micobacterias
de Lowestein Jensen, identificación de especies fenotípicas
pruebas de detección, pruebas de drogas antituberculosas, (11) GeneXpert MTB / RIF, (13)
y GenoType MTBDR plus ® - Hain Tape. (14) ADN ex-
La tracción de los portaobjetos se realizó con Chelex al 5%.
de un protocolo adaptado de Van Der Zanden, (15) como
siguiente: Se agregaron 100 μL de agua ultrapura sobre la
frotis de portaobjetos para facilitar el desprendimiento de la muestra; luego
se utilizó un portaobjetos limpio para raspar el material. Esto era
transferido a otro microtubo, donde el 5% de Chelex
Posteriormente se añadió solución de reactivo. Las muestras
luego se incubaron en un termobloque a 56 ° C durante 30 min
y luego a 100ºC durante 10 min para la lisis celular. El micro
Los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 min, y
el sobrenadante se transfirió a otro microtubo. Para
mejorar la calidad, cada muestra de ADN fue sometida a
un paso de purificación utilizando columnas de sílice y lavado con
tampones específicos (adaptado de Boom et al.). dieciséis
PCR en tiempo real : se realizó el análisis qPCR
utilizando en un sistema de PCR en tiempo real StepOne (AB Applied
Biosystems) y los productos amplificados fueron detectados
por el sistema de detección TaqMan ® (AB Applied Biosys-
tems). La reacción se estandarizó en un volumen total.
de 20 μL, que contienen 10 μL de la mezcla maestra kapa, 1 μL
de solución de cebadores y sondas (AB Applied Biosystems)
a una concentración de 20X. 2 μL (10 ng / uL) de ADN se
añadido en la mezcla. El control utilizado como tipo salvaje (WT)
perfil (para ambos genes) era el ADN de M. tuber-
cepa de referencia de culosis H37Rv. Como reacción negativa
control, la mezcla de PCR que contiene ultrapura sin núcleo
se utilizó agua. Se activaron las condiciones de amplificación
ción de la enzima a 95 ° C durante 10 min (etapa de calentamiento),
40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 sy recocido
y extensión a 60ºC durante 1 min. Hubo pre-PCR
y pasos post-PCR de 60ºC durante 30 s. Estos ensayos para
detección de polimorfismos genéticos diana se han adaptado
tomados por Applied Biosystems / Thermo Fisher Scien-
tific (4332077-Ensayos de genotipado de SNP TaqMan personalizados
no humano, SM). Grandes secuencias de fragmentos de "base"
correspondiente a las regiones de destino utilizadas para la identificación
ción de M. tuberculosis resistente a INH ( katG 315 G / C
e inhA -15 C / T) se enviaron para la síntesis de los
dice. El análisis de los resultados se realizó con un
herramienta ofrecida por el fabricante: Thermo Fisher Cloud
( https://www.thermofisher.com/search/results?query=c
loud & focusarea = Search% 20All ), que proporciona más
opciones para la evaluación de los resultados.
Análisis estadísticos : los datos se analizaron utilizando el
Paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS, versión
23.0, Chicago, IL). Evaluar la concordancia entre los
resultados de las pruebas realizadas, se calculó el índice Kappa
lated (en pares). La sensibilidad, especificidad, índice Kappa
y curva de característica operativa del receptor (ROC) para el
análisis del nivel de precisión de las pruebas de genotipado, con
también se evaluó un intervalo de confianza del 95%.
Aspectos éticos - Este estudio fue aprobado por el
buscar comité de ética de la Facultad de Salud Pública /
Departamento de Salud ESP / SES / RS (número de aprobación:
1.607.182) y la Universidad Federal de Minas Gerais (núm.
ber: CAAE: 02232412.7.1001.5149).
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RESULTADOS
Procedimientos de estandarización - El perfil genotípico ob-
contenido por secuenciación caracterizó las muestras en un 9,11%
[(5/55); WT (katG) / MUT (inhA)], 12,72% [(7/55); PESO
(katG) / WT (inhA)], 52,72% [(29/55); MUT (katG) / WT
(inhA)] y 25,45% [(14/55); MUT (katG) / MUT (inhA)].
Genotipado del gen katG (315 G / C) - De los 55 ADN
extraído de cultivos resistentes a INH, 43 mutados (MUT)
y 12 WT se detectaron en la región del gen, ac-
según la caracterización por secuenciación. Genotyp-
ing por qPCR detectó 42 MUT (42/43) y 11 WT (11/12)
muestras. El valor de acuerdo del índice Kappa fue
0,89 (IC95%: 0,7-1,0) (acuerdo considerado excelente
según la calidad de clasificación). La sensibilidad
y la especificidad fueron 97,6% (IC95%: 87,7-99,9) y 91,7%
(IC95%: 61,5-99,5), respectivamente (Tabla I). En la deteccion
gráficos, el análisis de las curvas nos permite evaluar
el perfil genotípico de cada plantilla, así como para dis-
criminar la distribución de los clusters [ver Suplemento
datos tary (Fig. 1)]. La curva ROC se utilizó para evaluar
la sensibilidad (o tasa de verdaderos positivos) versus especificidad
(tasa de falsos positivos), en otras palabras, es el
tación de un índice visual de la precisión del ensayo [ver
Datos complementarios (Fig. 2)]. El área debajo de la curva,
que es un resumen estadístico para la determinación de la
nivel de precisión de la prueba, fue 0,94 (referencia = 1,0).
Genotipado del gen inhA (-15 C / T) - A partir de 55 ex-
ADN extraídos, la secuenciación identificó 18 MUT y
37 muestras WT. Genotipado por ensayo qPCR identificado
17 muestras MUT y 36 WT (una muestra discordante
para cada perfil). El valor del índice Kappa fue 0,92
(IC95%: 0.8-1.0) (acuerdo considerado excelente). Sensi-
La actividad y la especificidad fueron del 94,4% (IC95%: 72,7-99,8) y
97,3% (IC95%: 85,8-99,9), respectivamente (Tabla I). Fig.3, en
Datos complementarios , muestra las parcelas del genotipado.
experimentos. La curva ROC [ver datos suplementarios a
(Fig. 4)] mostró una precisión de prueba (área bajo la curva) de 0,96
(referencia = 1.0). Como genotipado del objetivo anterior,
el objetivo inhA mostró un rendimiento constante.
Portaobjetos teñidos con FN : todos los portaobjetos de frotis negativos
coincidente con la cultura, así como con GeneXpert MTB / RIF
(TRM - Prueba Molecular Rápida). La qPCR detectada (de
frotis negativos y cultivo) una muestra de perfil WT
ple para ambos genes estudiados. El acuerdo de qPCR con
el cultivo negativo fue del 96,7%. En portaobjetos con baciloscopia positiva que
también tuvo una prueba de cultivo positiva, la DST y la Geno-
Se realizaron tipo MTBDR plus ® . La primera prueba es
basado en la identificación fenotípica y el segundo, en
análisis de genes, por lo tanto, en DST, sólo resistencias antimicrobianas
tance (INH) se puede analizar. Una comparación de análisis genético
Ysis sólo es posible cuando se comparan qPCR en comparación con el genotipo
Escriba MTBDR plus ® . El índice Kappa para el acuerdo
entre las dos últimas pruebas citadas (casos válidos) en relación con
los genes katG e inhA eran 0,82 y 1, respectivamente. Si
comparamos las muestras para determinar la sensibilidad a los fármacos INH y
resistencia (DST) versus GenoType MTBDR plus ® / qPCR),
los índices Kappa obtenidos fueron 0,69 y 0,25, respectivamente.
tivamente [consulte Datos suplementarios (artículos 5, 6, 7)].
También se realizó una comparación entre los
portaobjetos teñidos con FN cuantificados como + (1 a 10 bacilos por
campo en 50 campos observados), ++ (10 a 99 bacilos en 100
campos observados), +++ (en promedio más de 10 bacilos por
campo en 20 campos observados), de 1 a 9 bacilos en 100 observados
campos) (11) y el ciclo de umbral (Cts) discriminado
por qPCR (Tabla II). En algunos casos, el frotis se desliza que
tenían la mayor cantidad de bacilos en los campos observados, tenían Cts más bajos,
en otros [diapositivas 10, 11 y 18 (Tabla II)], no hubo
el mismo acuerdo. La microscopía del teñido con ZN
los portaobjetos [diapositiva 1 (Tabla II)] no revelaron bacilos acidorresistentes,
aunque la muestra contenida en la diapositiva proporcionó suficiente
ADN ficiente para la amplificación por identificación de qPCR.
DISCUSIÓN
La monorresistencia a INH se ha vuelto cada vez más
común a lo largo de los años. Los estudios han encontrado altas tasas de
resistencia a este fármaco, y todavía no hay consenso sobre
cómo se puede tratar a los pacientes. Además, el tratamiento
Lo más probable es que el resultado sea desfavorable y no se identifique
tificar un aislado resistente a INH es equivalente a perder el
eficacia de uno de los fármacos y comprometer la base
TABLA I
Rendimiento de la genotipificación de los genes katG e inhA mediante la reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real (qPCR) en aislados clínicos
Ensayo
Secuenciación
(MUT)
Secuenciación
(PESO)
Total
Sensibilidad
(IC 95%)
Especificidad (CI
95%)
Índice Kappa
(IC 95%)
qPCR katG (MUT)
42
1
43
97,6
91,7
0,89
qPCR katG (PESO)
1
11
12
(87,7 - 99,9)
(61,5 - 99,7)
(0,7 - 1,0)
Total
43
12
55
qPCR inhA (MUT)
17
1
18
94,4
97,3
0,92
qPCR inhA (PESO)
1
36
37
(72,7 - 99,8)
(85,8 - 99,9)
(0,8 - 1,0)
Total
18
37
55
IC: intervalo de confianza; MUT: mutado; WT: tipo salvaje.
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régimen de tratamiento. (17) La falta de un tratamiento adecuado
para combatir un aislado resistente a INH también podría ser inducido
ing cambios a nivel de gen (mutaciones), generando MDR
clones, ya que la resistencia a RIF viene en secuencia. (2) El
Los ensayos de qPCR realizados en este estudio identificaron la mayoría
mutaciones conocidas en regiones genéticas asociadas con INH
resistencia ( katG 315 G / C e inhA -15 C / T; GenBank:
(MG995339, MG995338, MG995265 y CP023597 - Na-
Centro Nacional de Información Biotecnológica - NCBI -
https: //www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank/). Es importante
Es importante considerar que las mutaciones asociadas con INH
son más complejas y ocurren en muchos M. tuberculosis
genes. Sin embargo, los genes más utilizados como marcadores, de acuerdo con
de estudios, como una revisión sistemática reciente (Seifert
et al.), (18) que evaluaron 11.411 aislados de M. tuberculosis
en 49 países (enero de 2000 a agosto de 2013), son las
katG (315 G / C) y la región promotora inhA (-15 C / T).
Confirmando estos hallazgos, también tenemos el estudio de
Monteserin et al., (19) quienes evaluaron los mismos marcadores para
analizar el perfil de farmacorresistencia de INH y la enfermedad
contribución de los clusters en Argentina, así como el estudio de
Lopez-Avalos et al., (20) que utilizaron los mismos marcadores para
Identifique la resistencia ya descrita.
En cuanto al acuerdo de la normativa de normalización
resultados, la sensibilidad, especificidad, índice Kappa y ROC
La curva se evalúa en la mayoría de los estudios que utilizan la
análisis de pruebas de diagnóstico y / o comparación de resultados
entre técnicas (GeneXpert MTB / RIF, GeneXpert
MTB / RIF Ultra, Genotipo MTBDRplus, TB-SPRINT,
y otros). (21) Respecto a las discrepancias en el acuerdo
de las pruebas, creemos que se debe a la alternativa
mecanismos moleculares de resistencia, muchos de los cuales son
aún desconocidos, o incluso que presentan un genotípico raro
perfil, que se encuentra en unas pocas cepas de la M. tuberculosis com-
plex. (22) Otro sesgo importante a considerar es que algunos
Las pruebas tienen diferentes métodos de detección, como DST y
GeneXpert MTB / RIF (microbiológico versus molecular
detección), por lo tanto, algunas comparaciones permitieron estadísticamente
cálculos cal con mayor equidad, pero otros tenían más
análisis restringidos al método de detección. (21,23)
Con respecto al diagnóstico de TB farmacorresistente en
muestras clínicas de esputo, se sabe que en personas de bajos ingresos
TABLA II
Comparación entre la clasificación de portaobjetos teñidos de Ziehl-Neelsen (ZN) y el umbral
Ciclado (Cts) de muestras detectadas mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real (qPCR)
Muestras
Diapositivas ZN
qPCR (Cts katG)
qPCR (Cts inhA)
1
NEG
PESO (31,01)
PESO (30,84)
2
++
PESO (32,35)
PESO (35,90)
3
+
PESO (33,20)
PESO (33,64)
4
3 CAMPOS BACILLI / 100.
INDETERMINADO
INDETERMINADO
5
3 CAMPOS BACILLI / 100.
INDETERMINADO
INDETERMINADO
6
+++
PESO (32,35)
PESO (35,53)
7
3 CAMPOS BACILLI / 100.
PESO (35,23)
PESO (35,15)
8
+++
PESO (28,06)
PESO (28,41)
9
3 CAMPOS BACILLI / 100.
INDETERMINADO
INDETERMINADO
10
+
PESO (33,19)
PESO (32,55)
11
++
PESO (36,27)
PESO (36,99)
12
++
INDETERMINADO
INDETERMINADO
13
+
PESO (37,89)
PESO (36,95)
14
+
PESO (32,28)
PESO (32,01)
15
+
PESO (32,89)
PESO (35,54)
dieciséis
+
MUT (29,81)
PESO (30,53)
17
+++
PESO (36,57)
PESO (36,20)
18
+++
PESO (33,96)
PESO (36,16)
19
4 CAMPOS BACILLI / 100.
PESO (32,72)
PESO (35,91)
20
+
PESO (33,46)
PESO (34,61)
21
+
MUT (33,95)
PESO (36,00)
22
+++
PESO (32,81)
PESO (34,29)
23
+++
PESO (32,15)
PESO (33,01)
PESO (33,79 ± 2,33)
PESO (35,71 ± 0,84)
MUT (31,88 ± 2,92)
-
NEG: negativo; MUT: mutado; WT: tipo salvaje; +: 10 a 99 bacilos en 100 campos
observados; ++: 1 a 10 bacilos por campo en 50 ob-
campos servidos; +++: en promedio más de 10 bacilos por campo en 20 campos observados. 1 a
9 bacilos en 100 campos observados. Mediana
± desviación estándar.
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países existen obstáculos frecuentes en el transporte
y almacenar muestras de regiones periféricas para referencia
laboratorios que realizan análisis moleculares, restringiendo
vigilancia y población del escenario real de
la enfermedad. (24) Ante esta situación y con base en la literatura
portaobjetos de microscopía de frotis (la primera prueba más
se utiliza principalmente para la detección de tuberculosis pulmonar; cultura y
Los métodos DST no se utilizan de forma rutinaria ya que requieren más
equipos modernos y una estructura de bioseguridad más grande, que
sólo están disponibles en laboratorios de referencia) puede ser un
forma segura de transportar muestras de esputo de periféricos
sitios a laboratorios centrales que realizan pruebas moleculares
para la tuberculosis, aumentando la velocidad del diagnóstico y promoviendo
mejor manejo del paciente. (9)
Por lo tanto, mostramos que los extractos de ADN de ZN teñidos
Los portaobjetos se pueden utilizar como plantilla para la amplificación.
del ADN de M. tuberculosis mediante la técnica qPCR. Similar
Los resultados también fueron obtenidos por Gonçalves et al., (25) quienes
utilizó la misma técnica de extracción de ADN para la detección
mediante ensayos de qPCR. De Almeida et al., (26) evaluaron seis diferencias
Diferentes técnicas para la extracción de ADN de M. tuberculosis ,
incluida la extracción de ADN por Chelex de cultivos de
microorganismos y portaobjetos teñidos con FN. Uno de los resultados
obtenido fue que el método que utiliza el Chelex + NP-
40 para los reactivos de extracción de ADN proporcionó un
cantidad de ADN libre de interferencias. Por lo tanto, de acuerdo con
el Rakotosamimanana et al. (9) resultados, nuestro estudio permitió
el uso de frotis como fuente de extracción de ADN
para el diagnóstico de TB y para realizar algunos
análisis para la evaluación de la resistencia a los medicamentos.
Se sabe que los portaobjetos de microscopía de frotis son simples,
rápido y menos costoso para el diagnóstico inicial de TB, cómo-
nunca, la sensibilidad y la especificidad siguen siendo bajas. (27) Estos
Las medidas también dependen de la calidad del frotis.
realizado así como el entrenamiento de la microscopía
analizador. Encontramos la presencia de ADN de M. tuberculosis
en la muestra de pacientes 1 (Tabla II), sin embargo, la presencia de
el bacilo no se visualizó al microscopio. (28) Com-
combinar el portaobjetos teñido con FN con detección de ADN de bacilo
y las pruebas de resistencia a los medicamentos aumentan la eficacia
de los análisis y los hace más rentables. (27)
Evaluación de los resultados, análisis de genotipado en M. tu-
Las cepas de berculosis podrían contribuir significativamente a la enfermedad.
control, indicar posibles asociaciones epidemiológicas,
detectar información sospechosa sobre brotes y contraseñas
manipulación en laboratorios, e incluso distinguir entre
reinfecciones exógenas y endógenas reactivación durante
ing retratamiento. (29) Aunque el uso de la secuenciación es con-
consideró el estándar de oro para la detección de resistencia, reciente
Los estudios han demostrado que el uso de la genotipificación de qPCR es
ampliamente utilizado en el diagnóstico molecular, así como en la resistencia
estudios de identificación de perfiles de tancia por su especificidad,
el alto grado de automatización y buena reproducibilidad. (30)
En el presente estudio, parte de los experimentos se realizó
extraído con ADN extraído de aislamientos clínicos recopilados
lecto del sur de Brasil (paso de estandarización) y,
la otra parte, realizada con ADN extraído de ZN-
portaobjetos teñidos recolectados del sudeste de Brasil, utilizados para
la aplicación en la resistencia al diagnóstico de TB. Este es el
principal limitación de este estudio; sin embargo, nuestros hallazgos son
importante para una mejor comprensión del diagnóstico de
pacientes infectados con cepas de M. tuberculosis resistentes
a INH. Los estudios futuros pueden consolidar nuestros datos, por lo que al-
mejorando el manejo terapéutico de estos pacientes.
En conclusión , en comparación con la secuenciación, nuestro método
od mostró una sensibilidad y especificidad similares para detectar
genes que confieren sensibilidad o resistencia a M. tuberculosis
tancia a INH. Los resultados sugieren que las pruebas moleculares
se puede utilizar para la detección rápida de tuberculosis farmacorresistente,
ya que los portaobjetos teñidos con FN pueden considerarse una herramienta eficaz
para facilitar la extracción de ADN de muestras de esputo,
facilitando, pasando por alto dificultades como el almacenamiento seguro
y transporte de muestras, facilitando también el diagnóstico
de TB en áreas periféricas. Sin embargo, estudios adicionales con
todavía se necesita un mayor número de muestras para validar
la técnica e incluir en el futuro otro TaqMan ®
ensayo para la evaluación de la resistencia a RIF.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Programa de Postgrado en
Biología celular y molecular aplicada a la salud - Lutero-
una Universidad de Brasil (ULBRA), Investigación de Micobacterias
Laboratorio, Facultad de Medicina, Universidad Federal de Minas
Gerais (UFMG), Centro de Desarrollo Científico y Tecnológico
desarrollo (CDCT-RS) y personal del Laboratorio de Molecu-
lar / ULBRA, por financiamiento y soporte técnico.
CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
GLB - Autor principal, participante del experimento
fase, los resultados del análisis y la redacción científica de la manu-
texto; FCLM - contribuyó con la fase experimental del
pasos de estandarización hasta la aplicación de la técnica en
frotis de portaobjetos; MG - contribuyó a la etapa inicial de la experiencia
instantes; SPJ - participó en la etapa experimental de aplicación
ción de la técnica; JMW - análisis estadístico contribuido y
redacción científica del manuscrito; INA - contribuyó a la
análisis realizados en la Universidad Federal de Minas Gerais
(Brasil) y la redacción científica del manuscrito; LJAF -
contribuido a los análisis realizados en la Universidad Federal
de Minas Gerais (Brasil) y la redacción científica del
uscript; TSS: contribuyó a la etapa final del experimento.
análisis; ERDC: contribuyó a la redacción científica de la
manuscrito; RBB - contribuido con la fase experimental,
resultados del análisis y redacción científica del manuscrito,
así como el suministro de cepas de Mycobacterium tuberculosis
banco de muestras para la etapa de estandarización de la técnica; SSM -
co-asesor, contribuyó a los análisis realizados en la Federal
Universidad de Minas Gerais (Brasil) y la escritura científica
del manuscrito, así como el suministro de diapositivas para análisis;
MLRR - asesor del estudio, responsable de la elaboración y aprobación
aplicación del proyecto, así como la redacción científica del
manuscrito. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo
ed en ausencia de cualquier relación comercial o financiera
que podría interpretarse como un posible conflicto de intereses.
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