VIROLOGÍA

Gabriela Méndez
Objetivos
◦ Conocer las principales características de los virus.
◦ Origen de los virus
Introducción
◦ Gran diversidad biológica.
◦ Éxito de virus al parasitar todos
los organismos vivos conocidos
(material genético infeccioso)

En un litro de agua de mar hay

entre 109 y 1010 partículas víricas
 Características de los virus
◦ Muy pequeños (pasan a través de
filtros que retienen bacterias).
◦ 100 veces más pequeñas que las
bacterias. 30-90 nm.
◦ ABSOLUTAMENTE DEPENDIENTES DE
SU HUESPED PARA SU FUNCIÓN
(Parásitos intracelulares obligados).
Introducción
¿Seres Vivos?
• Están constituidos por mismo tipo de macromoléculas
complejas.
• Diversidad de formas– evolución.
• Mismo código genético, y transmiten a
descendencia.

Ausencia de metabolismo-energía
Son incapaces de compensar cambios en su ambiente
externo (Homeostasis).

Restricciones:

Las células huéspedes no contienen RNA dependiente de RNA

La maquinaria huésped solo traduce mRNA monocistrónico.

Los mRNA virales compiten con mRNA celulares

Propiedades de bacterias y
virus
 Teorías origen de los virus
Panspermia: espacio-contagio
masivo. Radiación cósmica-destruir
virus). Hoyle y Wickramasinghe.

Teoría 1: Regresiva
Propone que los virus son consecuencia
de la degeneración de microorganismos
(bacterias, protozoarios y hongos) que
alguna vez fueron parásitos obligatorios
de otras células, a tal grado que se
convirtieron en parásitos intracelulares y
perdieron paulatinamente todos los
componentes necesarios para
desarrollar un ciclo de vida libre
independiente de la célula hospedera.
Un importante argumento
en contra de esta teoría, es
que las cápsides virales
(componentes virales
cruciales) no son parecidas
a las membranas celulares.
 Teorías origen de los virus
Teoría 2
Los virus son el equivalente a genes vagabundos. Por ejemplo, es
probable que algunos fragmentos de ácido nucleico hayan sido
transferidos en forma fortuita a una célula perteneciente a una
especie diferente a la que pertenecen dichos fragmentos, los
cuales en lugar de haber sido degradados (como ocurre
generalmente), por causas desconocidas podrían sobrevivir y
multiplicarse en la nueva célula hospedera.

https://www.youtube.com/watch?v=W8H_eBhn6zQ
 Evolución de los virus
Los virus sufren cambios evolutivos al igual que los seres vivos. Los
genomas virales están sujetos a la mutación con la misma
frecuencia común a todos los ácidos nucleicos, y cuando las
condiciones favorecen a un mutante en particular, éste es
seleccionado, dando origen a una nueva cepa.
La evolución exitosa de cualquier parásito requiere de la
supervivencia de la especie hospedera.

Ausencia de sistemas de
Virus genera un gran número
reparaciones de errores
de variantes en cada ciclo de
de la replicasa en los
replicación.
virus de ARN
Rutas de transmisión de virus
 Reservorios de los virus

UNA POBLACIÓN EN LA Permite la amplificación Reservorios animales

CUAL UN VIRUS SE del virus que puede ser • Pájaros como reservorios.
MANTIENE SIN CAUSAR transferido a otro • Artrópodos como
UNA ENFERMEDAD SERIA huésped directamente reservorios.
AL INDIVIDUO o por medio de un • Reservorios humanos
INFECTADO. vector intermediario.

Los virus que son

transferidos de animales
a humanos son
conocidos como virus
Zoonóticos.
 Elementos subvirales
Viroides
◦ Moléculas circulares de RNA
◦ No tienen cápside ni envoltura
Virusoides
◦ satélites
◦ Dependientes presencia de virus replicación
◦ Empacan en cápside de virus como pasajeros
Priones
◦ Proteínas infecciosas
◦ No acido nucleído
Lectura complementaria
◦ ShorsTeri (2009). Virus: Estudio Molecular Con Orientacion Clinica/
Molecular Study With Clinical Orientation,. Ed. Médica
Panamericana.
https://books.google.com.ec/books?id=T7Q1CBUlq0cC&pg=PR22&
dq=virologia&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjQ0Z2htKPsAhUIwVkKHWI
mDNwQ6AEwA3oECAIQAg#v=onepage&q&f=false
◦ Capitulo 1 (1.1 a 1.2; hasta pagina 16)
Referencias
◦ Carrasco, L., Almendral del Río, J. (2006). Virus Patógenos.
Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. Editorial
Hélice. Madrid-España. Capítulo 1 y 2
◦ International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV).
Disponible en: https://talk.ictvonline.org.
◦ Microbiología de Prescott. Capitulo 16. Introducción y
características generales.
ESTRUCTURA DE
LOS VIRUS
Gabriela Méndez
 Tamaño de los virus
■ Partículas de virus o viriones (10-300 o
400 nm.)
■ Unidades de medida: nanómetros
(1nm= 10^- 9m)
■ Solo pueden ser visto con microscopio
electrónico.

■ Más pequeños: parvovirus (20nm)

■ Más grandes: mimivirus (aislado de
Ameba) (400 y 500 nm de diámetro).
Estructura de un virus
Virus simples
■ Nucleocapside
– Acido nucleico (DNA o RNA)
– Cápside de proteínas
(icosaedrico, helicoidal) 20
a 40 Kd Estabilidad
Inestabilidad
(enlaces no
 Formado por: covalentes)
subunidades
proteicas idénticas –
protómeros.

– Envoltura (fuera de la
nucleocapside).
Virus complejos
Estructuras adicionales: cabeza,
fimbrias.
 Ácidos nucleicos

Genomas pequeños: una

proteina múltiples
funciones.

Cadena positiva: Si RNA idéntico a mRNA. Ser traducido en proteínas, inmediatamente.

Cadena negativa: Si RNA complementario a mRNA. Debe sintetizar la cadena
complementaria que será el ARNm. ARN polimerasa dependiente de ARN.
Segmentado: cada segmento codificar una proteína.
 https://www.youtube.com/watch?v=CB
Mr142ynbk&t=3s

Tipos de cápside Extremo amino terminal

(hidrofílica-negativamente)
Extremo carboxi-terminal;
■ HELICOIDAL
interior cilindro-positivamente.
Forma sencilla. Autoensamblan.
< 10% virus
– Ordena proteínas alrededor de la
circunferencia de un circulo para
formar un disco-apilan´.
– Helice
– Cilindros huecos de proteina
– Material genético: espiral ubicado
hacia el interior.
– Tamaño depende de:
■ Diámetro: curvatura interacción-
subunidades.
■ Longitud: subunidades-ácido
nucleico
■ Inclinación: distancia recorrida
por cada vuelta completa de la
hélice.

■ Todas las subunidades tienen las mismas

interacciones, excepto las dos de los extremos.
 Tipos de cápsides
■ ICOSAEDRICA :
- > virus animales
- Capsómeros (conjunto protomeros) por autoensamblaje
(chaperonas-plegamiento).
– Pentámeros (vértices)-convexo.
– Hexámeros (lados o caras)-plano.
- Simetría cúbica
- (20 caras triangulares y 12 vértices). Está definido
por tener 2, 3 y 5 ejes de simetría.

Un eje de doble simetría rotacional a través del

centro de cada borde.
Un eje de triple simetría rotacional a través del centro
de cada cara.
Un eje de cinco veces la simetría rotacional a través Aristas
Caras
del centro de cada esquina (vértice) Vértices
 Envoltura
■ Origen: celular (núcleo celular huésped o membrana
citoplasmática
■ Estructura
– Lípidos y carbohidratos (constituyentes del huésped).
Glicoproteinas, glicolípidos.- Galactosa, fucosa, N acetil
glucosamina,.
– Proteínas: codificadas por genes del virus.
■ Espículas o glicoproteínas de superficie.
– Enzima neurominidasa: penetra mucosa epitelio
respiratorio.
– Proteínas hemaglutinina): une a membrana
celular glóbulos rojos - fusión membranas.
– Proteínas de matriz (M)
■ Superficie interna envoltura
■ Estabilizar

Envoltura: Herpesvirus y retrovirus, paramixovirus

 Virus complejos
– Cápside simétrica
– Colas (otras
Cualquiera de varios estructuras)
bacteriófagos que – Paredes con
pueden infectar cepas multicapas
de la bacteria alrededor acido
Escherichia coli nucleico
– Ejm: bacteriófagos
Cabezas: simetría icosaédrica.
Colas: simetría helicoidal.
Simetría compleja
■ Los miembros de las familias Poxviridae y Asfarviridae son virus grandes de ADN
bicatenario que contienen genomas de gran tamaño y que presentan arquitecturas
complicadas.

Viruela
Superficie externa presenta crestas
(rectangular)-proteínas y lípidos.
Interior se encuentra un núcleo y dos
cuerpos laterales (aristas
redondeadas).
Análisis de estructuras virales

■ Técnicas de fijación, contrastado (tinción) de

muestras.
■ Métodos de visualización directa de los virus,
preserva conformación nativa del virus -
Microscopía electrónica (clasificación por
características morfológicas), cristalografía de
rayos X, resonancia nuclear magnética.
■ Procesamiento digital de imágenes y
reconstrucción tridimensional.
Resumen
 Material complementario

■ Vargas CórdobaManuel (2002). Virología médica. Univ. Nacional de Colombia.

https://books.google.com.ec/books?id=PqmNRXxUkpUC&printsec=frontcover&dq=
virologia&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjQ0Z2htKPsAhUIwVkKHWImDNwQ6AEwAHoE
CAQQAg#v=onepage&q&f=false
■ Pagina 6-18

■ Taller
■ https://www.biointeractive.org/classroom-resources/virus-explorer
Referencia

■ Carrasco, L., Almendral del Río, J. (2006). Virus

Patógenos. Facultad de Ciencias. Universidad
Autónoma de Madrid. Editorial Hélice. Madrid-España.
Capítulo 4.
■ Microbiología de Prescott, Introducción y características
generales. Capitulo 16.
■ Microbiología de los microorganismos de Brook.
Virología básica. Capitulo 9
REPLICACIÓN
VÍRICA
Gabriela Méndez
 Tropismo
Solo infecta a un tipo o pocos tipos
Rutas de transmisión de los celulares.
Presencia del receptor celular

virus implicado (Más de un receptor).

Poliomieltitis: enterocitos (tracto
digestivo)-torrente sanguíneo-
neuronas.
Específicos (hepatitis B-hepatocito)
o no específicos.

Rango de huésped
Sólo infecta a una o varias
especies de animales-
Poliomielitis: primates y humanos.
 Fases en que existen los virus
◦ Extracelular
◦ Viriones: estructura mediante el
cual, el genoma del virus se
transporta desde la célula en que
se ha producido a otra célula
donde el ácido nucleico puede ser
introducido.
◦ No tienen enzimas
◦ No pueden reproducirse sin células
vivas
◦ Carece funciones biosinteticas y
respiratorias.
 Fases en la que existen los virus
◦ Intracelular (replicación del
virus)
◦ Virus
◦ Ácidos nucleicos están en
replicación (nuevas copias
genoma vírico).propia
polimerasa.
◦ Induce metabolismo del
huésped para sintetizar
componentes
◦ Infección: genoma vírico
se introduce y reproduce
en célula huésped.
 Ciclo replicativo
de un virus
- El virus debe inducir a la célula
hospedadora a sintetizar los
componentes necesarios para
fabricar los virus.
- Componentes-ensamblaje
viriones-liberación de la célula
hospedera-nueva infección.

1) Fijación (adsorción)
2) Penetración (inyección)
3) Síntesis ácidos nucleicos y
proteínas.
4) Ensamblaje y empaquetado.
5) Liberación (Lisis)
Eclipse: primeros minutos de la infección: ac.nucleicos
https://view.genial.ly/600c50a305323e771733b90a/h virus separa de su cubierta proteica (no entidad
orizontal-infographic-review-ciclo-de-replicacion-de- infecciosa).
los-virus
Células animales
1) Unión o fijación
Dos componentes

Partícula viral
• Con envoltura: glicoproteínas. Gp120 VIH y
hemaglutinina Gripe.
• Desnudos: zonas concretas en cápside. Parte o
porción una proteína, varias zonas de distintas
proteinas.
• Dominio carboxilo CAR (Adenovirus)

Superficie celular Célula permisible-susceptible: ausencia

• Cualquier molécula presente en la superficie. de defensa contra el virus.
• Cada virus-molécula determinada. Virus: capacidad de evadir las defensas
• Glicoproteinas, glicopeptidos, fosfolípidos. del huésped.
 Células animales Reversible
Irreversibles

1) Unión o fijación
Contacto entre receptores de superficie de célula con
sitios de unión de los virus (Afinidad).
Co-receptores: segundo tipo de molécula de la superficie
celular. Colabora receptor. Entrada eficiente.

Unión de viriones a receptores:

- Por fuerzas como enlaces de H.
- Atracción iónica.
- Fuerzas de Van de Waals.

- NO energía.

Cambios conformacionales que

afectan composición proteica-
pierden algunas proteínas de la
cápside al interactuar con su
receptor
 2)Penetración-Modos de entrada
◦ A través de membrana plasmática
◦ Entrada directa (virus desnudos)-Polio.
◦ Fusión directa (virus con envoltura)-VIH
◦ A través de endosomas
◦ Endocitosis mediada por receptor (virus con y
sin envoltura).
◦ Influenza.

Descapsidación viral
◦ TOTAL: Eliminar cápside: al penetrar en
célula y liberar genoma.
DESCAPSIDACIÓN PARCIAL: genoma-
◦ Virus con envoltura: fusión de membranas. proteínas (enzimas-retrotranscripcion)
◦ Virus desnudos: en proceso de entrada-
cierta descapsilación (pérdida de proteínas).
 Fusión directa (virus Entrada directa
con envoltura) (Virus desnudos)
◦ Fusión membrana viral y membrana plasmática. ◦ Partícula viral une receptor.
◦ Proteínas fusogénicas (glicoproteínas) en envoltura ◦ Partículas virales fijan en exterior
virus. celular.
◦ VIH ◦ Partículas en el citoplasma.
◦ Polio

Proceso:
Envoltura inmersa en membrana plasmática celular.
Nucleocápside: traspasa membrana celular y queda en
citoplasma.
 Endosomas
Endocitosis mediada por receptor
Virus fija receptor en superficie.

Invaginación (clatrina).

Endosoma (clatrina).

Membrana endosomal: enzima- protón ATPasa

vacuolar (bombea protones).

Madura endosoma al bajar pH (5)-pierde

cubierta clatrina.

Crea gradiente de pH. Clatrina es una proteína que forma el recubrimiento

de las microcavidades de membranas celulares
donde se sitúan receptores de lipoproteínas
 Endocitosis mediada por receptor
◦ Virus con envoltura
- dispara fusión glicoproteínas virus-
membrana endosomal. Libera
nucleocápside en citoplasma.
- Alfavirus, influenza
◦ Virus desnudos
◦ En endosoma acidificado.
◦ Virus lisa endosoma o genoma
pasa al citoplasma por
perturbación de la membrana
pero sin lisis (poro).
◦ Descapsilación: desensamblan
Ingresa virus:
proteínas de la cápside
• Producción de proteínas
(ac.nucleico al citoplasma) estructurales y enzimas virales.
◦ Adenovirus, poliovirus • Replicación del genoma viral
 3) Síntesis ácidos nucleicos y proteínas.
◦ Transcripción: síntesis de mRNA.
◦ Traducción: síntesis de proteínas.
◦ Genomas virales: reducido, mayoría codifica proteínas; (10-20%) es no codificante.

Fase temprana: inicio replicación genomas.

Fase tardía: hasta el final infección.

Proteínas tempranas (enzimas): sintetizan

inmediatamente después de la infección. Necesarias
para la replicación. En pequeñas cantidades.

Proteínas tardías: proteínas de la cubierta del virus.

Estructurales. En grandes cantidades.
ADN RNA polimerasa II dependiente de ADN
polimerasa
dependiente
de ADN

Papovavirus )Papilomavirus) y Herpesvirus

No célula
 4) Ensamblaje y empaquetado
ENSAMBLAJE ASISTIDO
◦ Chaperonas celulares
◦ Sistemas de transporte
◦ Maquinaria nuclear de importación
y exportación
◦ Scaffolding (andamio) proteínas:
requeridas para el ensamblaje pero
no presentan en la forma final.
AUTOENSAMBLAJE
• Interacciones electrostáticas
• RNA positivo: Cápside une a RNA por
dominios terminales ricos en amino ácidos
motivos ricos en Arginina (ARMs).
• RNA negativo: Hendidura de la cápside
cargada positivamente.

Chaperonas
Se unen a ella para
ayudar en su
plegamiento,
ensamblaje
y transporte celular a
otra parte de la célula
donde la proteína
realiza su función.
 Las estructuras básicas de la
partícula viral, van juntas a
un lugar particular en la
4) Ensamblaje y empaquetado célula.
•Virus de ADN: en el núcleo y
requiere el transporte de las
proteínas del virión al núcleo.
•Virus de ARN: tiene lugar en el
citoplasma.

Problema: genomas virales

deben ser distinguidos de las
moléculas de DNA o RNA de
la célula, donde el
Virus helicoidales: #
ensamblaje toma lugar.
unidades cápside es
arbitrario, se
acomoda al tamaño
Solución: señales de
del genoma.
empaquetamiento en el
Existen cuerpos de inclusión: genoma viral.
Virus icosaèdrico: 60 son compartimentos
unidades y sus subcelulares donde se •Señales de empaquetamiento
múltiplos forman concentran componentes cerca del origen.
poliedro regular. estructurales del virus. •Son un conjunto de secuencias
repetidas.
•Se reconocen por una proteina
viral.
 4. Liberación viral
Liberación de la célula por budding o lisis

- VIRUS CON ENVOLTURA – budding

Balsas lipídicas son microdominios de
membrana ricos en glicoesfingolipidos o
glicoproteínas, colesterol y un grupo
especifico de proteínas asociadas. Maquinaria de
remodelación de
Gemación: interacción nucleocapside +
la membrana:
bicapa celular = envoltura (fosfolípidos
fosfolipasas,
celulares y glicoproteínas virales).
desaturasas.
Proteina de unión a la cápside (CP)-virus,
lípidos membrana-celula
A veces proteína M (de la matriz): media
interacción nucleocápside con
membrana. Citoesqueleto
En los virus en el que el proceso de
liberación es el budding, el
ensamblaje, maduración y liberación
son usualmente simultáneos.
 4. Liberación viral

VIRUS SIN ENVOLTURA-lisis

• La célula infectada se rompe, abre y libera el virus.

Este proceso se da porque la replicación viral

altera o interrumpe las funciones celulares
normales, por ejemplo la expresión de genes
esenciales.

Muchos virus también codifican proteínas que

estimulan apoptosis, que resulta en liberación
de partículas virales-viroporinas.

Video:
http://highered.mheducation.com/sites/0072556781/student_view0/chapter18/animation_quiz_2.html
 Ciclos víricos bacteriófagos

Un genoma de fago inactivo que se encuentra en una Video:

célula bacteriana y en sus descendientes. http://faculty.riohondo.edu/rbethel/micro_v
iral_replication.swf
Ensamblaje bacteriófagos
 Penetración
• Plantas
- Pared celular rígida de celulosa.
- Trauma externo para dañar la
pared (acción de vectores, viento,
paso de animales).
- No receptores de la pared celular.
- Virus plantas: codifican proteínas
de movimiento-forman canales-
transmisión virus.
Material complementario para
pruebas
◦ ShorsTeri (2009). Virus: Estudio Molecular Con Orientacion Clinica/ Molecular Study With
Clinical Orientation,. Ed. Médica Panamericana.
◦ https://books.google.com.ec/books?id=T7Q1CBUlq0cC&pg=PR22&dq=virologia&hl=es
&sa=X&ved=2ahUKEwjQ0Z2htKPsAhUIwVkKHWImDNwQ6AEwA3oECAIQAg#v=onepag
e&q&f=false
◦ Capitulo 3 (pag 47-67)
Videos
◦ https://www.youtube.com/watch?v=2n4g2lrUZ9U
◦ https://www.youtube.com/results?search_query=fijacion+virus+gripe
◦ https://www.youtube.com/watch?v=2rZ305MTqaU
Referencias
◦ Carrasco, L., Almendral del Río, J. (2006). Virus Patógenos. Facultad de Ciencias.
Universidad Autónoma de Madrid. Editorial Hélice. Madrid-España. Capítulo 7.
◦ Microbiología de Brooks. Capitulo 9. Replicación vírica.
Métodos de trabajo con virus
Gabriela Méndez
INTRODUCCIÓN
 INTRODUCCIÓN
Periodo de incubación

Periodo agudo de la
enfermedad
Aislamiento de virus in vivo e in vitro
 Sistema de cultivo para virus animales
Los virus animales requieren células dentro de un animal huésped o células de cultivo de tejidos derivadas de
un animal. Las fuentes de huésped in vivo pueden ser un embrión en desarrollo en un huevo de ave
embrionada (por ejemplo, pollo, pavo) o un animal entero.

Sistema cultivo Ventajas Limitaciones

Animal Infección natural Mantención es cara
Variación entre individuos
Consideraciones éticas
Cultivo de órganos (cerebro, Infección natural No se ve la respuesta del sistema
tráquea, intestino) Pocos animales necesitados inmune
Menos variación porque órganos
obtienen de un solo animal
Células Si clonan-variación es mínima
Bueno para estudios bioquímicos-
ambiente se puede controlar
Cultivo de virus
Cultivos celulares: conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las
células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas,
bioquímicas y genéticas.

• El cultivo de virus es importante para:

• 1) identificación y diagnóstico de virus patógenos en muestras clínicas
• 2) producción de vacunas
• 3) estudios de investigación básica: aumentar cantidad para estudios de efectos
en células infectadas o en organismos infectados.
• Observar efectos citopáticos: muerte celular.
 Cultivo de bacteriófagos
• Los bacteriófagos se pueden cultivar en presencia de una capa densa de bacterias (también
llamada césped bacteriano) cultivada en un agar blando al 0.7% en una placa de Petri o en un
matraz plano.
• La concentración de agar disminuye del 1.5% que se usa generalmente en el cultivo de
bacterias. El agar suave al 0.7% permite que los bacteriófagos se difundan fácilmente a través
del medio.
• Para los bacteriófagos líticos, la lisis de los huéspedes bacterianos se puede observar fácilmente
cuando se detecta una zona clara llamada placa. A medida que el fago mata las bacterias, se
observan muchas placas entre el césped bacteriano
Efectos citopáticos NO todos los virus causan efectos
citopáticos (parvovirus y
• Cuando las células han sido infectadas con un virus.
papilomavirus).
• ¿Cómo se sabe que el virus se está replicando?
•
Pérdida de adherencia a la superficie del recipiente.
• Vacuolas en el citoplasma.
• Cuerpos de inclusión en el núcleo o citoplasma.
• Destruye las células
• Cambia la apariencia de la célula.: formación de sincitios, una célula
larga con muchos núcleos, cuando las células individuales se fusionan.

Sarampión

Viruela hinchazón
 Tipos de cultivos celulares
Cultivos primarios: derivan de un órgano o tejido. 5 a 10 divisiones. Dejan de dividir por inhibición de contacto (densidad de
saturación=# células/cm2 60.000).
Conservan características morfológicas del tejido. Fibroblastos o epitelial.
Pase antes de agotar viabilidad o agoten nutrientes. # generaciones: acumulan mutaciones, senescencia.
Condiciones similares a la del organismo: células hematopoyéticas y linfoides crecen en suspensión, derivan de tejidos
sólidos crecen adheridos a soportes.

Tejidos disociados hasta obtener suspensión de células o pequeños

grumos por troceado mecánico y tratamiento con enzimas proteolíticas
(tripsina y colagenasa).
Células se lavan, cuentan y diluyen en un medio de cultivo.

Medios de cultivo:
- Fuente de energía: glucosa
- Aminoácidos, vitaminas (tiamina, rivoflvina).
- Cofactores en trazas (inositol)
- Solución salina: equilibrio osmótico NACl, KCl.
- Tampon
- Antibióticos y antifungicos
https://www.youtube.com/watch?v=dSxH9xNmhWg
 Tipos de cultivos celulares
Cultivos primarios
Debido a los requisitos de dependencia del anclaje, los cultivos de células primarias requieren un medio de cultivo líquido
en una placa de Petri o en un matraz de cultivo de tejidos para que las células tengan una superficie sólida como vidrio o
plástico para su fijación y crecimiento.

Este tipo de
cultivo se
Cultivos en
restringe a las
suspensión: Las
Su crecimiento no células
células se
depende del hematopoyéticas,
encuentran
anclaje. células madre,
dispersas en el
líneas celulares
medio de cultivo.
transformadas y
células tumorales.
 Tipos de cultivos celulares
Cultivos en monocapa: Células adhieren al
las células crecen El anclaje al sustrato es soporte y dividen una Es el método utilizado
adheridas sobre un un prerrequisito para la vez al día, hasta cubrir para la mayoría de las
soporte sólido (plástico proliferación celular. la superficie células.
o vidrio). (monocapa).

Diversos soportes: Vidrio: boratos y

Adhesión de células a soporte, se produce por silicatos. (-)
interacciones: superficie hidrofílica,
humedecible. Plástico: poliestireno. (-)
• Cationes divalentes (Ca,Mg): puentes entre cargas
negativas de la superficie celular y soporte.
Agentes quelantes: secuestran cationes-
desprendimiento monocapas. EDTA.
• Tratamiento de células de soporte con polímeros
naturales o sintéticos de carga neta positiva
(polilisina , histonas, protamina, polihistidina).
• Factores proteicos: glicoproteínas en suero.
Fibronectina: proteína de anclaje de la matriz
extracelular.
Línea Celular: Cultivo celular que tiene alta capacidad
de multiplicarse in vitro, establecido a partir del
primer subcultivo de un cultivo primario y que tiene
Línea celular que ha demostrado posibilidades
las mismas características que el tejido de origen.
de ser subcultivada in vitro por lo menos 70
(DS: 150.000-300.0000). Pérdida de la inhibición por veces (≥70 subcultivos) indefinidamente
contacto.

Líneas celulares Línea celular continua Estas células pueden surgir de forma
espontánea o inducida y son el resultado de un
cambio genotípico denominado
transformación.

Las células transformadas se caracterizan

porque son inmortales; su crecimiento es
aberrante, son malignas, genéticamente
inestables y presentan aberraciones
cromosómicas.
 Líneas celulares mas usadas
Tejido: riñón.
Tipo morfológico: fibroblastica.

Tejido: riñón.
Tipo morfológico: epitelial.

Tejido: cérvix.
Tipo morfológico: epitelial.
Línea celular HeLa, se cultivó a partir de
células tumorales obtenidas de Henrietta
Lacks, una paciente que murió de cáncer de
cuello uterino en 1951.
Las células HeLa fueron la primera línea
celular continua de cultivo de tejidos y se
utilizaron para establecer el cultivo de tejidos
como una tecnología importante para la
investigación en biología celular, virología y
medicina.
 Valoración de las partículas virales
PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LOS VIRUS
• Métodos cuantitativos
- Unidades formadoras de placa (u.f.p): por lesiones o
placas de lisis.
Diluciones seriadas se inocula sobre monocapas
indicadoras.
Título de virus infecciosos/unidad de volumen.
Morfología y tamaño de la placa de lisis, característica de
cada sistema virus-célula.
• Requiere de pocos recursos.
• Mide directamente partículas virales infecciosas.
• Algunos virus no causan un nivel suficiente de daño.
• Morfología distinta para dar positivo.
Se incuban las placas en durante 6 días, para la posterior
tinción con naftol blue-black y ácido acético.
Desventajas del cultivo celular
• Se requiere largos periodos para obtener resultados,
aproximadamente más de cuatro semanas.
• Susceptibilidad a contaminación bacteriana.
 Cultivo de virus (embrión
de pollo)
• Huevo fértil de gallina incuba 5-12 días.
• Inocula asépticamente virus en huevo.
• Cada área actúa como un tipo de cultivo
celular diferente.
• Cierra apertura en huevo con parafina.
• Incuba huevo a 36 C por t requerido por
el virus.
Alantoidea: ectoderma, extraembrionaria.
Coroalantoidea: membrana vascular.
Aminiótico: bucal y respiratorio.-cualquier
tejido.
La infección viral puede dañar las
membranas de los tejidos, produciendo
lesiones llamadas viruela; interrumpir el
desarrollo embrionario; o causar la muerte
del embrión.
https://www.youtube.com/watch?v=VoA0vwRIRKE
 Valoración de las partículas virales
PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LOS VIRUS
• Métodos cuantitativos
- Lesiones en membranas corioalantoideas: morfología de pústulas a 37-72h.
Relación dosis – respuesta lineal entre #partículas infecciosas y lesiones
obtenidas.

Fiebre hemorrágica del Congo

 Valoración de las partículas virales
PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LOS VIRUS
• Métodos cuantitativos
- Lesiones foliares: contando lesiones
necróticas producidas en las hojas de
plantas susceptibles. Diluciones y frotan
sobre hoja-puentes protoplásticos a otras
células.

colocadas
Espolvorea
Se realiza en
das con Las hojas
un frotis invernader
carborund inoculadas
con un o hasta la
um son lavadas
hisopo de aparición
(mineral con agua
algodón de
abrasivo)
síntomas
Purificación de virus
• Purificación: suspensión de virus que está razonablemente libre de materiales contaminantes; y se requiere
para el estudio físico químico e un virus.
• Los viriones en el medio líquido pueden separarse de las células huésped mediante centrifugación o
filtración. Los filtros pueden eliminar físicamente cualquier cosa presente en la solución que sea más
grande que los viriones. Los virus se pueden recoger en el filtrado.

Virus extracelular: filtración,

centrifugación
Virus intracelular: rotura
celular (aspas giratorias,
abrasivos-polvo de vidrio, • Centrifugación
ultrasonidos, ciclos de diferencial
congelación-descongelación.. • Gradiente de
centrifugación
Centrifugación diferencial
• Centrifugación a varias velocidades
para separar partículas virales por
tamaños
1) Alta velocidad: sedimentos (virus
y partículas celulares) y
sobrenadante (descarta).
2) Resuspende pellet
3)Centrifuga lento: elimina
partículas más pesadas que virus.
Gradiente de centrifugación
Diferencia en la velocidad de sedimentación o de flotación.
Gradiente preformado: solución sucrosa coloca en un tubo de centrifugación.
• Diferente concentración en base y superficie.
• Coloca virus en superficie
• Centrifuga
• Partículas pasan hasta donde la densidad de las partículas es igual a la del virus.
 Valoración de Permite determinar la cantidad absoluta
Partículas de partículas virales
virales
Técnica
Microscopía electrónica
Se deposita en la rejilla un volumen Concentración de virus
conocido del virus purificado 109 partículas virales/mlc
Características:
Rejillas recomendadas: malla de
Extender sobre la rejilla del soporte 400 y membrana de
• Se emplea el microscopio
microscopio y observar carbono.
electrónico;
• No se puede discriminar
partículas infecciosas de otras Acido fosfotungstico (pta)
Teñir la preparación.
que no lo son; Acetato de uranilo
• Permite observar la morfología
de los viriones;
Se cuenta directamente las partículas al
• Se necesita preparaciones microscopio
purificada para evitar
confusiones entre estructuras
virales y otras partículas.
Valoración de partículas Togavirus (Encefaitis),
flavivirus
virales por sus
propiedades
fisicoquímicas
Técnica
Valoran algún componente estructural o Se realiza diluciones seriadas de
número de partículas físicas.
orden 2

Hemaglutinación Exacta y rápida

UHA/ml es el inverso de la
No muy sensible
dilución mas alta de
Características: resultado positivo dividido
por el volumen ensayado
• Es la aglutinación de eritrocitos
por proteínas virales;
• Muchos virus poseen en su
envoltura proteínas capaces de
unir eritrocitos;
• Cada partícula es multivalente y
podría adsorber a mas de un
eritrocito.
• Pero unión no significa infección.
Modificación hemaglutinación-
Ensayo de la inhibición de la
hemaglutinación.
Utiliza para determinar el título de anticuerpos virales en el suero de
un paciente.
Los anticuerpos neutralizan el virus y bloquean la acción de este de
aglutinar.
Suero del paciente es mezclado con el virus , luego se añade
glóbulos rojos.
Título del virus es la dilución más alta que bloquea la aglutinación.

https://www.youtube.com/watch?v=zYS58ppVr30
Métodos basados en la formación complejo
antígeno-anticuerpo
• Determinan cuantitativamente antígenos virales;
• En la detección de antígenos, se utiliza un anticuerpo
específico antiviral (por lo general IgG).
Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre
una fase sólida mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reacción cuyo producto
(color), puede ser medido espectrofotométricamente.
Las EIA para antígenos virales se usan a menudo
como pruebas de detección preliminares. Si los
resultados son positivos, una confirmación adicional
requerirá pruebas con una sensibilidad aún mayor,
como una transferencia Western.
Enzima: fosfatasa alcalina
Sustrato: H2O2, tetrametilbenzidina ©
 Métodos basados en la formación complejo
antígeno-anticuerpo
• Inmunofluorescencia; usa dos anticuerpos, el
anticuerpo primario se use específicamente a la
molécula objetivo, y el anticuerpo secundario, que
lleva el fluoróforo, reconoce el anticuerpo primario y
se une a este. Múltiples anticuerpos secundarios
pueden unirse a un anticuerpo primario.

Sarampión
Técnicas moleculares
Determinación de ácidos nucleicos
• Separación electroforética en un gel de agarosa o
poliacrilamida.
• PCR

• A partir del número de genomas se puede determinar la cantidad

de partículas virales;
• Se basa en técnicas de biología molecular;
• En función de la masa molecular del genoma viral y de la cantidad
de ácido nucleico valorado en los geles se puede estimar el
número de partículas virales.
 PCR en tiempo real

La retrotranscripción es una reacción para la conversión del ARN

en ADNc y en general se lleva a cabo antes de una PCR, cuando
se pretende analizar secuencias de ARN. La realización
consecutiva de una retrotranscripción y una PCR se conoce
como RT-PCR.
 PCR en tiempo real
La detección de las copias del producto de PCR se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación, mediante:
- intercalados en el producto de PCR. SyberGreen o SyberSafe
- un láser que detecta fluorocromos acoplados a los primers. Pueden ser iniciadores marcados por fluoróforos (primers
LUX —light uponextension fluorogenic—)
- una sonda que hibrida en medio de los primers, que se degrada y libera su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’
de la polimerasa. Sondas específicas marcadas con fluorócromos (sondas TaqMan)

Syber Green es un
agente Mediante la detección de la
intercalante en la
doble cadena de fluorescencia liberada durante la
ADN. reacción de amplificación puede
medirse la cantidad de ADN
Se una de manera sintetizado en cada momento, ya
inespecífica
produciendo que la emisión de fluorescencia
fluorescencia. producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de
producto de PCR formado.
Bajo costo
PCR en tiempo real- sondas TaqMan
La sonda tiene acoplada un fluorocromo
un su extremo 5`, el cual esta silenciado
por otro fluorocromo llamado extintor o
quencher en el extremo 3`.

Sonda hibrida en algún punto intermedio de

la secuencia flanqueada por los primers.

La amplificación de la cadena donde la sonda esta unida libera el flurocromo solo cuando la sonda es degradada por la
acción exonucleasa de la polimerasa. (solo detección cuando un producto de amplificación haya sido generado)
PCR en tiempo real- iniciador Lux

Primer marcado con un fluróforo.

El primer hibrida con la cadena blanco y se

realiza la polimerización, causando que el
fluoroforo se excite, incrementando la
fluorescencia.
Fluorescencia se detecta por un laser.
PCR en tiempo real

https://www.youtube.com/watch?v=hplaPz8huyA
Referencia
• Carrasco, L., Almendral del Río, J. (2006). Virus Patógenos. Facultad
de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. Editorial Hélice.
Madrid-España. Capítulo 3.
• Microbiología de Prescott, Capitulo 16.