Microbiología Pesquera

Guía de Practica

PRACTICA N° 6:
COLIMETRIA

Logro del aprendizaje:

Usar el método de colimetría para evaluar la presencia del grupo de

coliformes y coliformes fecales, por su importancia como indicadores de
contaminación fecal del agua y los productos pesqueros.

Fundamento:
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa
incubadas a 37 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de
ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.

El procedimiento comprende las pruebas: presuntiva y confirmativa, tanto

para coliformes y coliformes fecales

Método del Número mas Probable (NMP)

El NMP proporciona una estimación de los organismos viables existentes en

un sustrato. Es un concepto estadístico derivado de la teoría de
probabilidades aplicables a la enumeración de microorganismos bajo ciertas
condiciones:
a) Los microorganismos se distribuyen de un modo homogéneo y al azar
en el medio que los contiene
b) Fracciones iguales que puedan separarse del modo original
contendrán igual número de células.
c) Las células se consideran como unidades independientes. El método
perderá exactitud si se presentan agrupaciones celulares
d) En el caso de que se encuentre una sola célula, el medio de cultivo
empleado permitirá detectarlo en función de su crecimiento

Ing. Nancy Martinez Ordinola -1-

Microbiología Pesquera
Guía de Practica

Consiste en sembrar las diluciones de la muestra por triplicado o

quintuplicado (3, 5, 10 tubos etc). en un caldo de cultivo, que permita la
observación de reacción positiva por presencia de determinados
microorganismos.
El número de m.o. de la muestra original, se conoce por una tabla
estadística diseñada para obtener el número más probable de
microorganismos.
Este método es muy utilizado para la Numeración de coliformes totales,
fecales y estreptococos, y algunas veces se ha utilizado para la numeración
de Salmonella, Vibrio y Staphylococcus
PROCEDIMIENTO:

Materiales

 Tubos de ensayo
 Tubos Durham de 10 x 75 mm.
 Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml. (flujo total)
 Incubadoras de 37±1ºC
 Baño de agua 44,5±0.5ºC

Medios de cultivos y reactivos:

 Caldo lactosa verde brillante bilis

 Caldo lauril sulfato triptosa
 Caldo Escherichia coli
 Solución buffer fosfato

1. Pruebas a realizarse:

1.1. Numeración de coliformes por el método del NMP.

1.2. Numeración de coliformes fecales por el método del NMP.

Ing. Nancy Martinez Ordinola -2-

Microbiología Pesquera
Guía de Practica

Esquemas del Procedimiento:

NMP de Coliformes y Coliformes fecales. Prueba presuntiva

1. Preparación del material del análisis (Limpieza, encender el

mechero y rotulado)

2. Preparar las diluciones decimales de la muestra, que debe estar

bien homogenizada. Sacar 10 ml del agua y colocarlo en 90 ml de
bufffer fosfato)

3. Colocar 1 ml de tres diluciones consecutivas por quintuplicado

en el medio caldo lauril sulfato triptosa

4. Incubar los tubos a 37ºC x 24 a 48 h

Prueba confirmativa

5. Para la confirmación de coliformes, de los tubos positivos en CLST

(gas en la campana) , sacar una asada

6. Colocar una asada en caldo lactosa verde brillante bilis

7. Para la confirmación de coliformes fecales, sacar nuevamente una

asada del tubo con caldo lauril triptosa positivo

8. colocar la asada en caldo Escherichia coli

9. Incubar el medio para coliformes a 37ºC x 24 a 48h

10. Incubar el medio para coliformes fecales a 44.5ºC+_ 0,5 x 24 a 48 h.

Ing. Nancy Martinez Ordinola -3-

Microbiología Pesquera
Guía de Practica

Resultado.-
Para el cálculo del NMP/ml o NMP/g:
 Para serie de cinco o tres tubos:

NMPtabla X f
NMP/ml o g=
100

Donde:
 Siendo f, el factor de la dilución media
 NMP tabla: Es el número encontrado en la tabla de NMP luego de
contar los tubos con reacción positiva, según las diluciones realizadas

Para muestras de agua dar en resultado el NMP en 100 ml.

Ing. Nancy Martinez Ordinola -4-

Microbiología Pesquera
Guía de Practica

Ejercicios de NMP (Considerar en Resultados)

De los resultados del cuadro de las diferentes muestras de agua, hallar

el NMP correspondiente (NMP/100ml)

Nº muestra Tubos positivos Tubos positivos Tubos positivos

con CLST con CLVBB en CE.C.
10 -3
10 -4
10-5
4 2 1 3 2 0 3 1 0
1
10-4 10-5 10-6
2 5 5 4 5 3 0 5 2 0

10-5 10-6 10-7

3 3 2 0 2 1 1 2 0 0

10-2 10-3 104

4 4 3 1 3 1 1 3 1 1

10-3 104 10-5

5 5 3 0 4 2 0 3 1 0

Ing. Nancy Martinez Ordinola -5-