PCR rbcL

Type Sequence name Purification Sequence

DNA rbcL_F Desalted AATCTTCTACTGGTACATGGA
DNA rbcL_r Desalted GTAAACATGTTAGTAACAG

Nº
Ci Cf Vi Muestras
(1 muestra) 10
Buffer 10 X 1 X 2,5 µl 26,25 µl
MgCl2 50 mM 2,5 mM 1,25 µl 13,125 µl
dNTPs 2000 µM 200 µM 2,5 µl 26,25 µl
Cebador F 10000 nM 200 nM 0,5 µl 5,25 µl
Cebador R 10000 nM 200 nM 0,5 µl 5,25 µl
Taq pol 5 u/µl 1 u 0,2 µl 2,1µl
DNA 10 ng/µl 50 ng 5 µl µl
H2O 12,55 µl 131,775 µl

Vf 25 µl

Programa
95ºC 3:00
95ºC 0:30
50ºC 0:30 40 X
72ºC 0:30
72ºC 10:00

OJO CONCENTRACIÓN DNA:

La concentración de DNA debe ser óptima y se determinará en función de:

1. Amplificación de una sola banda nítida en el gel

2. Intensidad de la banda elevada indicando la posibilidad de una óptima digestión enzimática.

Esto debe tenerse en cuenta con AMBOS sistemas de amplificación y modificar la tabla Excel con la concentración
de DNA más adecuada.
PCR trnL

Type Sequence name Purification Sequence

DNA trnL_F Desalted CGAAATCGGTAGACGCTACG
DNA trnL_R Desalted GGGGATAGAGGGACTTGAAC

Ci Cf Rxn Rxn
1 10
Buffer 10 x 1 x 2,5 µl 25 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 2,5 µl 25 µl
dNTPs 10 mM 0,2 mM 0,5 µl 5 µl
Taq 5 U/µL 1,5 U 0,3 µl 3 µl
30
0,75 µl 7,5 µl
trnl F 10000 nM 0 nM
30
0,75 µl 7,5 µl
trnl R 10000 nM 0 nM
DNA 10 µl
H2O 7,7 µl 77,0 µl

Vol final 25 µL
Volumen final 25 µl cuando se hacen comprobaciones de amplificación

Programa
95ºC 3:00
95ºC 0:30
50ºC 0:30
72ºC 2:00 40x
72ºC 10:00

SELECCIÓN DE LAS MUESTRAS A VOLVER A AMPLIFICAR PARA SU DIGESTIÓN

Ci Cf Rxn Rxn
1 10
Buffer 10 x 1 x 5 µl 50 µl
MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl
dNTPs 10 mM 0,2 mM 1 µl 10 µl
Taq 5 U/µL 1,5 U 0,3 µl 3 µl
30
µl µl
trnl F 10000 nM 0 nM 1,5 15
30
µl µl
trnl R 10000 nM 0 nM 1,5 15
DNA 10 µl
H2O 27,5 µl 275 µl

Vol final 50 µL

Volumen final 25 µl como paso previo a la DIGESTIÓN