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ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

La preparación de los geles de poliacrilamida para SDS-PAGE se realiza con el


equipo Mini Protean II de Bio-Rad. Dependiendo del tamaño de las muestras que queramos
separar se utilizara un gel separador con diferente concertación de acrilamida.

Rango efectivo de separación de proteínas en geles de


poliacrilamida
Rango de tamaños % acrilamida-bisacrilamida en el
separables (kDa) gel separador
36-205 5
24-205 7.5
14-205 10
14-66* 12.5
14-45* 15
* las proteínas más grandes no se mueven significativamente en el gel

Componentes para la preparación de dos geles SDS-PAGE


Reactivo Gel concentrador Gel separador Gel separador
(5%) (ml) (10%) (ml) (12.5%) (ml)
Agua 3.4 3.9 3.126
Acrilamida:Bisacrilamida
0.83 3.3 4.17
(30:0.8 p/v)
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 -- 2.5 2.5
Tris-HCl 1.0 M pH 6.8 0.63 -- --
SDS 10% 0.05 0.1 0.1
TEMED 0.05 0.2 0.2
APS (10%) 0.005 0.006 0.006

Preparación de muestras:

Las muestras se preparan en un volumen final de 50 μl.

 20 μl de muestra.
 20 μl de tampón de carga.
 10 μl glicerol 80%.

Las muestras se hierven durante 5 min y se centrifugan 10 min a 13000 rpm. Finalmente,
las muestras se cargan en el gel, incluyendo un marcador de pesos moleculares, y se
procede a la electroforesis en tampón Tris-HCl 25 mM (pH 8.6), glicina 250 mM, SDS
10% con una fuente de corriente BioRad PowerPac 1000 a un amperaje constante de 10
mA/gel hasta que el frente penetre en el gel separador, y a partir de ahí 25 mA/gel hasta que
el frente alcance el final del gel.

Preparación del tampón de carga:

 Tris 20 mM, pH 8
 EDTA 2 mM
 SDS 5%
 β-mercaptoetanol 10%
 azul de bromofenol 0.05%,

Preparación del marcador de pesos moleculares SDS-PAGE Molecular Weight


standards, Broad Range de Bio-Rad (#161-0317).

Diluir el estándar 1:20 en tampón SDS Reducing Sample. Calentar 5 min a 95ºC. Enfriar y
cargar 7 μl.

SDS Reducing Sample (preparar inmediatamente antes de usar)

β-mercaptoetanol 25 μl
Stock Sample Buffer 475 μl

Stock Sample Buffer (conservar a temperatura ambiente)

Agua destilada 4.8 ml


Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 1.2 ml
Glicerol 1.0 ml
SDS 10% (p/v) 2.0 ml
Azul Bromofenol 0.1% (p/v) 0.5 ml

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Calle Muestra
1 Extracto crudo
2 Proteína pura
3 Proteína pura
4 Marcador Peso Molecular