DIVISIÓN DE CIENCIAS NATURALES Y

EXACTAS

Farmacología
Fa20202

Práctica No. 5
“Determinación de LD50 Método Arriba y Abajo
(Up and Down)”

03 de Diciembre del 2013

Objetivo
Después de realizar esta práctica el estudiante desarrollará las habilidades básicas para determinar
las características de toxicidad general de un compuesto en animales de laboratorio, comprenderá el
concepto de dosis letal media así como los cuidados y comportamientos necesarios para
determinarla.

Fundamento
Los aspectos cuantitativos de la acción de fármacos constituyen uno de los principales campos de
estudio de la Farmacología. Proporcionan una base para investigaciones analíticas de los
mecanismos mediante los cuales los fármacos producen sus efectos, así como una base racional
para la aplicación de los efectos de fármacos a la terapéutica.

Unos de los principios fundamentales de la Farmacología establece que la magnitud del efecto de un
fármaco es la función de la dosis administrada. Hay dos tipos básicos de relaciones dosis-efecto:
1. Las de tipo graduado o cuantitativo, que relaciona la dosis de un fármaco con la magnitud de
respuesta en una sola entidad biológica, y
2. Las de tipo cuántico de todo o nada, en la que la relación está entre las dosis de fármaco y la
proporción de objetos biológicos que exhiben un efecto farmacológico determinado. El material
biológico puede ser un organismo intacto, un tejido aislado o hasta una célula.

La curva cuántica todo o nada, nos dice la frecuencia con la cual una dosis de fármaco provoca una
respuesta farmacológica establecida, fijada. Por tanto, es esencialmente una curva que describe la
distribución de las dosis mínimas que producen un efecto dado en una población de objetos
biológicos. Las dosis mínimas (o umbral) que producen un efecto pueden ser obtenidas “titulando”
directamente un sujeto con el fármaco hasta que se produce el efecto deseado o, alternativamente,
dando una serie de dosis a diferentes grupos de sujetos y anotando la proporción de ellos que
responden a cada dosis. En cada caso, la frecuencia con que aparecen las dosis umbrales puede
hacerse en gráficas en diferentes sistemas de coordenadas contra la dosis utilizada.

En su forma más básica, la curva dosis-respuesta es la mediana de la dosis más pequeña que es
eficaz en el 50% de los individuos. Por tanto, bisecta a una población de dosis en números iguales y
cuando es derivada de una curva simétrica normal, es igual a la media y al modo. La dosis mediana,
simbólicamente expresada como DE 50 para “Dosis eficaz 50%”, es de uso común en Farmacología a
causa de varias propiedades: 1) No se necesita conocer la población total de dosis para estimar la
DE50; 2) No es afectada por valores extremos y de aquí que sea estable en una distribución
distorsionada; 3) La DE50 se presta fácilmente para la expresión de los fenómenos de sinergismo y
antagonismo cuando se estudia la interacción entre dos fármacos.

El error asociado con su estimación es más pequeño que el error de cualquier otra dosis estimada
sobre una curva dosis-respuesta cuántica.

Cada parámetro estadístico derivado de los datos experimentales en únicamente una estimación del
valor “verdadero” de la estadística en una población de tamaño finito. Otra forma de indicar con más
sentido la precisión de una estadística es mediante el uso de límites de confianza. Estas son
fronteras que contendrán el valor “verdadero” de una estadística a un nivel de probabilidad
previamente seleccionado.
En esta práctica se estudiará la toxicidad aguda, que es la determinación de los efectos producidos
por el compuesto cuando se administra en una dosis única a cada animal probando un amplio grado
de dosis. La toxicidad aguda de cualquier compuesto deberá compararse con la de otros
compuestos en términos de la LD50. Este valor es una estimación de la dosis que puede esperarse
que mate a la mitad de una población de número ilimitado de la misma especie y cepa, en la
siguientes 24 h de su administración. A menudo la vía de administración tiene un efecto profundo en
la LD50. En general, la ruta menos tóxica es la vía tópica. Aumentando su toxicidad en el siguiente
orden: oral, subcutánea, intraperitoneal, e intravenosa. A causa de la variación entre especies, se
emplean varias especies animales de animales para determinar la LD 50. La selección de las especies
animales es una consideración importante en la prueba de toxicidad aguda. En las primeras fases de
desarrollo de fármacos los estudios de toxicidad aguda se llevan a cabo en al menos cuatro
especies, una no roedor. Comúnmente el fármaco es probado en ratón, rata, conejo y perro, las
dosis se elevan al doble hasta que aparecen los signos de toxicidad. Durante la administración en
perros se vigila la hematología y química clínica del animal. Rutinariamente los ratones son los
animales de lección para los estudios de toxicidad aguda porque son pequeños y baratos, y por lo
tanto se puede usar un gran número. El tamaño del animal es especialmente importante cuando las
cantidades del fármaco son limitadas.

Numerosos factores podrían influir en la LD 50 aún en la misma especie. Por ejemplo, el estado
metabólico del animal puede tener un efecto profundo. Los animales a los que se les ha privado de
alimentación son comúnmente más sensibles a los fármacos que los bien alimentados; este efecto
es debido parcialmente a la absorción incrementada del tracto gastrointestinal después de la
administración oral. Niveles elevados de las enzimas metabólicas de fármacos en el hígado también
podrían incrementar el valor de la LD50.

La edad de los animales también podría influir en la toxicidad del compuesto; por ejemplo, la
clorfeniramina, difenilhidantoína y el meprobamato se vuelven menos tóxica al madurar los animales.

El sexo de los animales también podría influir en la toxicidad aguda; por ejemplo, la procaína es
considerablemente más tóxica en ratas hembra que en ratas macho.

Aún el número de animales por jaula tiene un efecto importante en la toxicidad de ciertos
compuestos, como ocurre con la anfetamina. Los animales agrupados tienen mayor mortalidad que
los no agrupados en la misma jaula.

Debido a la posible influencia de estos factores en la toxicidad aguda, las pruebas de rutina se
estandarizan lo más posible. LA raza, sexo, edad, no. de ratones enjaulados, alimento consumido,
temperatura ambiente, son factores que deben ser cuidadosamente estandarizados y controlados.

Aunque hay varios métodos para calcular la LD 50, en esta práctica se usará el método de Litchfield y
Wilcoxon, con el fin de que los resultados sean comparables.

Para el procedimiento se seguirá el método Up and Down, que tiene la característica de clasificar
adecuadamente la naturaleza de toxicidad de los compuestos, permite evaluar la LD 50 como un
índice de toxicidad aguda así como sus límites de confianza y observar los signos de toxicidad. Muy
importante también es el hecho de minimizar el número de animales de experimentación para
realizar las pruebas de laboratorio.
De acuerdo con Dixon, la función de probabilidad se escribe de la siguiente forma:
L=L1 L2 … Ln, donde:
L es la probabilidad de resultado experimental, dada µ y σ, y siendo n el número total de animales
utilizados en la prueba.

Li=1−F ( Z i ) si ith iésimo animal sobrevivió, o bien

Li=F ( Z i ) si ith iésimo animal murió, donde:

F= distribución normal est´andar acumulativa,

Zi =
[ log ( d i )−μ ]
σ
di= dosis suministrada al ith iésimo animal
σ= desviación estándar en unidades log de la dosis (la cual no es el log de la desviación estándar).

Se obtiene un estimado de la LD50 mediante el valor de µ que maximiza la probabilidad L.

Se utiliza un estimado de σ de o,5 a menos que se tenga disponible un mejor valor genérico o
específico para la prueba.

Cuando se carece de información para realizar un estimado preliminar de la LD 50 y la pendiente de la

curva dosis-respuesta se sugiere iniciar con una dosis cercana a 175 mg/Kg y usar ½log entre dosis,
corresponden a un factor de progresión de dosis de 3,2. Esto produce mejores resultados. Además,
debido a que el método tiene una desviación hacia la dosis inicial, es esencial que ésta ocurra por
debajo de la LD50. El método es más fácil de aplicar para materiales que producen la muerte en uno
o dos días. No es práctico cuando se esperan muertes retardadas, 5 o más días.

Material biológico y reactivos

*Ratones, 25 g de peso, de preferencia hembras.
*Agua destilada, solución isotónica y agente de prueba (Nitrato de Litio).
*Material desechable: agujas y jeringas de insulina

Procedimiento
El método consiste en la administración progresiva de dosis únicas individuales, con un intervalo
mínimo de 49 h. El primer animal recibe una dosis de Nitrato de Litio abajo del nivel de mejor
estimado de la LD50 55 mg/Kg. Si el animal sobrevive, la dosis para el siguiente animal es
aumentada por un factor de 3,2 veces el original. Cada animal deberá ser observado
cuidadosamente durante 48 h antes de tomar una decisión acerca de qué dosis administrar al
siguiente sujeto de prueba. La decisión se toma de acuerdo al patrón de supervivencia de todos los
animales hasta ese momento. Se usa un criterio para detener la prueba y mantener el número de
animales bajo mientras se ajusta el patrón de dosificación para reducir el efecto de un valor inicial
bajo o pendiente baja.
Se detiene la prueba cuando ocurre alguno de los siguientes casos:
1) Sobreviven 3 animales consecutivos en el límite superior.
2) Ocurren 5 reversiones en cualquiera de los 6 animales consecutivos evaluados.
3) Al menos 4 animales siguieron la primera reversión y la relación de los valores de probabilidad
excedieron el valor crítico.
 La progresión de dosis recomendada es 1.75, 5.5, 15.5, 55, 175, 550, 2000 mg/Kg. Para obtener
información del software acerca del momento en el cual detener la experimentación complete en
el cuadro la identificación e inicialmente el resultado a corto plazo, después de completado el
criterio adicione la información del resultado a largo plazo.

Cálculos
Día 04 de Septiembre del 2013
Ratón 1→ m1= 35.1 g Dosis: 3 mg/Kg
Ratón 2→ m2= 35.3 g Dosis: 10 mg/Kg
Solución 1 de Nitrato de Litio C=0.5 mg/mL
Solución 2 de Nitrato de Litio C=1.0 mg/mL

( 1000
V 1=( 35.1 g ratón )
3 mg
g
LiNO )(
1 mL
3
1 mg
LiNO )=0.105 mL
3

V =( 35.3 g ratón ) ( LiNO )( LiNO )=0.353 mL

10 mg 1mL
2 3 3
1000 g 1 mg

Día 11 de Septiembre del 2013

Ratón 3→ m3= 24 g Dosis: 30 mg/Kg
Solución de Nitrato de Litio C= 5 mg/mL

V 3= (24 g ratón ) ( 1000

30 mg
g
LiNO )(
3
1 mL
5 mg
LiNO )=0.144 mL
3

Día 18 de Septiembre del 2013

Ratón 4→ m4= 25.1 g Dosis: 100 mg/Kg
Solución 1 de Nitrato de Litio C=15 mg/mL

V 4 =( 25.1 g ratón ) ( 100 mg

1000 g
LiNO )(
3
1 mL
15 mg
LiNO )=0.167 mL
3

Día 25 de Septiembre del 2013

Ratón 5→ m5= 22 g Dosis: 300 mg/Kg
Solución 1 de Nitrato de Litio C=40 mg/mL

V 4 =( 22 g ratón ) ( 300 mg
1000 g
LiNO )(
3
1 mL
40 mg
LiNO )=0.165mL
3

Día 02 de Octubre del 2013

Ratón 6→ m6= 37.1 g Dosis: 500 mg/Kg
Solución 1 de Nitrato de Litio C=75 mg/mL

V 4 =( 37.1 g ratón ) ( 500 mg

1000 g
LiNO )(
3
1 mL
75 mg
LiNO )=0.247 mL
3
 RESULTADOS Y OBSERVACIONES
No. ID Dosis O X Observaciones
secuencia (mg/Kg) 24 h 24h
l
1 l 3 8 0 Durante esta administración no hubo ninguna
acción relevante que indicara la aplicación de
LiNO3.
2 ll 10 8 0 Durante esta administración no hubo ninguna
acción relevante que indicara la aplicación de
LiNO3.
3 lll 30 8 0 Inmediatamente tras la administración
ocurrieron convulsiones violentas, seguidas de
un estado de hipnosis. Luego se detiene,
realiza movimientos ocasionales y se queda
quieto (ciclo repetitivo). Reflejos lentos.
4 llll 100 8 0 No hubo reacción alguna. Tuvo una actitud
menos agitada aproximadamente 10 minutos,
y luego regresó a su actividad normal.
5 lllll 300 8 0 No hubo reacción observable.
6 llllll 500 4 4 No hubo reacción observable. Sin embargo, a
las 24 horas que se verifica su estado, se nos
notifica que es uno de los 4 ratones que
murieron.
X= muerto O=sobrevivió

Conclusiones
Nuestro ratón de la dosis de 500 mg/Kg fue uno de los 4 que murieron a las 24 horas, en un total de
8 ratones considerados en el grupo. Con esto se determina que la LD 50 tiene un valor de dicha dosis
sin necesidad de realizar ajustes mediante cálculos. Se logra de esta manera el objetivo de la
práctica tanto en el aspecto del manejo individual para la administración de fármacos vía i.p. en
ratones como en la determinación del valor de dosis letal 50 en ratones hembra. Sería interesante
que se determinara en machos y se hiciera una comparación de las dosis, identificando así de
manera experimental si el sexo es un factor importante en la exposición al LiNO 3.

Cuestionario
1. Identifique y explique las diferentes variables que influyen para el manejo apropiado de los datos
de la DL50.
*Marcar a los ratones para su correcta identificación, esto nos ayudara a que sepamos en todo
momento cual ratón fue al que se le administro la dosis.
 *Llevar un registro del día y la dosis inyectada, esto nos servirá para saber qué día se aplicara la
siguiente dosis y en qué cantidad en todo caso de que hayan sobrevivido todos los ratones.

2. Identifique los principales factores que influyen para la manipulación e inmovilización exitosa de
los ratones.
Estrés del animal, excitación del ratón, habilidad del operador.

3. De los factores seleccionados en las dos preguntas anteriores elabore un cuadro en el que señale
¿Cuáles son posibles de controlar y cuáles no?
Controlables No controlables
Marcar a los ratones Estrés del animal
Registro de días y dosis Excitación del animal
Habilidad del operador

4. Esquema sencillo de los pasos esenciales para la administración i.p. en ratón en la DL50.

Colocarlo en una posicion en la cual Proceder a la administracion via

Sujetar el raton de la cabeza y la cola
quede descubierto el abdomen del raton intraperitoneal
5. Elabore un esquema mediante el cual explique el método de evaluación de la DL50 por el método
de probit.

Transformar la dosis a Log y el % de mortalidad a valores probit según las

tablas de transformación.

Hacer una regresión lineal (y=a+bx) entre el logaritmo de la dosis (x) y los
valores probit (y).

Se estima con el modelo calculado el valor par aun 50% de mortalidad. En

unidades probit 50%=S.

Se resta la unidad sumada.

6. Elabore un
Se aplica antilogaritmo, y se da la LD50 en (g/L).
cuadro donde
identifique las principales fuentes de error y recomiende acciones orientadas para reducirlas o
eliminarlas.

Fuente de Error Acción para reducirla /eliminarla

El estado metabólico de los ratones Darles la misma alimentación a los ratones
La edad de los ratones Seleccionar ratones de una misma cepa
El sexo de los ratones Elegir ratones del mismo sexo
El ambiente en la jaula Controlar la temperatura , humedad y espacio
donde se encuentran los ratones
Dosis Verificar que la dosis administrada sea la
misma para cada ratón
La administración Lo más recomendable seria que un mismo
operador realizara las administraciones para
evitar variaciones entre la técnica o habilidad
de los operadores.