UNIVERSIDAD D E L VALLE

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
BACTERIOLÓGICO

INFORME N°11
MICROBIOLOGÍA

ALUMNOS:

 LOAYZA CALLISAYA DENILSON DAVID

 LÓPEZ ACHOCANA VIOLETA JAZMÍN
 MAMANI CRUZ LUZ NEIDA
 MATTAZ HUAMPU WIÑAY BERENICE
 PAREDES VELASCO LIZETH NAYELI

DOCENTE: DRA. MONZÓN HUANCA NOEMÍ

GRUPO: B1

SUBGRUPO: 4

La Paz – Bolivia
Gestión I – 2023
 1. OBJETIVOS
Objetivo General
Conocer los distintos métodos empleados en los laboratorios de microbiología, para
reconocer a los diferentes microorganismos según sus características, para ello se
empleó distintas técnicas para su estudio desde conocer su morfología hasta sus
características más específicas.
Objetivos Específicos
 Aplicar las técnicas aprendidas para realizar una buena siembra en cultivos
 Conocer los métodos empleados para identificar a las bacterias
 Identificar las características de los microorganismos vistos
 Aprender a interpretar los resultados obtenidos para identificar la bacteria vista

2. MARCO TEORICO
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas es un trabajo en equipo entre el médico
que establece su diagnóstico presuntivo sobre la base del cuadro clínico y el
especialista en microbiología, que, dependiendo del diagnóstico presuntivo, debe
indicar como tomar y transportar la muestra clínica, así como también, orientar la
metodología específica en el diagnóstico a seguir.
Puede definirse como el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias
empleadas para establecer la etiología del agente responsable de una enfermedad
infecciosa. Los métodos de diagnóstico pueden ser directos o indirectos. El diagnóstico
microbiológico directo implica la demostración del agente infeccioso, sus metabolitos o
componentes antigénicos en los fluidos orgánicos. Incluye la elección de la muestra, su
transporte, conservación y procesamiento que permita la identificación del patógeno.
El diagnóstico bacteriológico incluye el estudio del patrón de sensibilidad antibiótica. El
diagnóstico indirecto implica la demostración de la huella que el agente infeccioso ha
dejado por su contacto con el sistema inmune. La muestra más frecuente en este caso
es la muestra de sangre para evaluar la presencia de anticuerpos específicos, por lo
que frecuentemente se lo denomina diagnóstico serológico. Las muestras para
diagnóstico directo pueden ser estériles o no. Las obtenidas mediante hisopado (ej.:
respiratorias, genitales, etc.) o por emisión espontánea (orina, materia fecal, esputo)
contienen microorganismos del microbiota normal. Por el contrario, las muestras
tomadas por punción (sangre, LCR) son estériles. Esta característica de las muestras
condiciona, su transporte, conservación y procesamiento, como también la
interpretación de los resultados.
Por ejemplo, para las “no estériles” se conservarán de forma que minimice el desarrollo
del microbiota acompañante y/o se utilizarán procedimientos que disminuyan la carga
del microbiota acompañante a fin de facilitar el aislamiento del patógeno. En líneas
generales, el procesamiento de las muestras para el diagnóstico bacteriológico directo
incluye: el examen microscópico, cultivos para el aislamiento del patógeno, detección
de antígenos específicos que permitan la identificación del mismo y antibiograma que
muestre el patrón de sensibilidad a los antimicrobianos. El análisis microscópico de la
muestra sin teñir (en fresco) permite, por ejemplo, evidenciar una respuesta inflamatoria
al patógeno (p.\PR ej.; presencia de leucocitos en orina). Mientras que las diferentes
técnicas de tinción (de Gram, de Ziehl Neelsen, etc) contribuyen a la identificación del
patógeno.
La microscopía de inmunofluorescencia, al utilizar anticuerpos específicos permite el
diagnóstico de certeza. El cultivo de la muestra en el medio sólido adecuado permitirá el
aislamiento del patógeno y es a partir de las colonias aisladas que se realizan las
pruebas bioquímicas para la identificación de la bacteria y posteriormente el
antibiograma. Por otro lado, los métodos de identificación de antígenos que utilizan
anticuerpos específicos y las técnicas de biología molecular que detectan secuencias
de ADN no exigen el aislamiento de la bacteria, sino que pueden llevarse a cabo sobre
la muestra.
Medios para realizar un diagnóstico bacteriológico
Siembra
Agar Sangre
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de numerosos microorganismos. Al ser
suplementado con sangre ovina, permite el crecimiento de microorganismos
nutricionalmente exigentes y la clara visualización de reacciones de hemólisis.
FUNDAMENTO: La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un
alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de
microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. El agregado de 5-10
% sangre ovina desfibrinada estéril (Britasheep) promueve el desarrollo de bacterias
exigentes en sus requerimientos nutricionales y la adecuada observación de las
reacciones de hemólisis.
Preparación
Suspender 40 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Dejar reposar 5 minutos y
mezclar perfectamente hasta obtener una suspensión homogénea. Calentar con
agitación frecuente y hervir 1 minuto para disolución total. Esterilizar a 121 ºC durante
20 minutos. Preparación de Agar Sangre: Agregar 5-10 % de sangre ovina
desfibrinada estéril (Britasheep) al medio esterilizado, fundido y enfriado a 45-50 ºC.
Homogeneizar y distribuir en placas de Petri estériles
El agar sangre es un medio enriquecido, diferencial y no selectivo.
Enriquecido porque tiene entre 5 -10 % de sangre sobre una
base de agar y esto permite el crecimiento la mayoría de
las bacterias cultivables.
Ese crecimiento ocurre sin restricción; por este motivo es no
selectivo. Sin embargo, si a este medio se le adicionan
compuestos que impidan el crecimiento de algunos microorganismos y favorezca el de
otros, se vuelve selectivo. Es el caso si se adicionan ciertos tipos de antibióticos o
antifúngicos.
Diferencial porque permite distinguir la capacidad hemolítica de los microorganismos.
La hemólisis es la lisis de los glóbulos rojos de la sangre por la acción de enzimas
extracelulares producidas por ciertas especies bacterianas. Las enzimas extracelulares
producidas por estas bacterias se denominan hemolisinas y se difunden radialmente
hacia el exterior de las colonias, provocando la lisis total o parcial de los glóbulos
rojos.
En el agar sangre pueden observarse cuatro tipos diferentes de hemólisis:
1. La hemólisis alfa…definida como una decoloración gris
verdosa o pardusca alrededor de la colonia y es el
resultado de la lisis parcial de los glóbulos rojos.
Durante la α-hemólisis, el H2O2 producido por la bacteria
hace que la hemoglobina presente en los glóbulos rojos del
medio se convierta en metahemoglobina.
Algunas de las especies α-hemolíticas son parte de la
microbiota humana normal, pero algunas especies
como Streptococcus pneumoniae causan neumonía y otras
infecciones graves.
Los estreptococos del grupo viridans son α-hemolíticos.

2. La beta-hemólisis es la lisis completa de los glóbulos rojos, lo que da como

resultado una zona incolora alrededor y debajo de la
colonia. Streptococcus pyogenes y Streptococcus
agalactiae son beta-hemolíticos.
La máxima actividad de hemolisinas (las hemolisinas
sensibles al oxígeno (SLO) y las estables al oxígeno (SLS)) de
los estreptococos del grupo A (S. pyogenes,) se
observa solo en condiciones anaeróbicas, por lo que las
colonias beta-hemolíticas se observan mejor cuando las
placas se incuban con una mayor concentración de CO 2.
Otros ejemplos de microrganismos beta-hemolíticos incluyen
a Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Bacillus
cereus.
3. La hemólisis gamma también se denomina no hemólisis, ya que no se produce
lisis de los glóbulos rojos.
Como resultado, no se observa cambio de coloración ni zona de hemólisis debajo o
alrededor de las colonias.
Especies como Neisseria meningiditis son no hemolíticas o gamma-hemolíticas.
Ejemplo de bacterias γ-hemolíticos: algunas cepas de Streptococcus del grupo D
(Streptococcus bovis y Enterococcus faecalis).
4. La hemólisis Alfa prima (a’): se caracteriza por una pequeña zona de eritrocitos
intactos adyacente a la colonia bacteriana, con una zona de lisis completa de glóbulos
rojos que rodea la zona de eritrocitos intactos. Este tipo de hemólisis podría confundirse
con la β-hemólisis debido a que se observa  una zona clara alrededor de las colonias.

La doble zona de hemólisis se observa también en bacterias como Clostridium

perfringens y Aeromonas hydrophilia .
Tipos de hemólisis
 Alfa (α): hemólisis parcial, que deja algunos glóbulos intactos cerca de la colonia y
un halo verdoso alrededor de la colonia.
 Alfa prima (α’): hemólisis parcial, que deja algunos glóbulos intactos cerca de la
colonia, pero no deja glóbulos en una zona un poco más alejada. A ojo desnudo
parece una hemólisis total pues un halo verdoso mu pegado a la colonia, suele
confundirse con parte de la misma.
 Beta (β): hemólisis total, que no deja glóbulos alrededor de la colonia, quedando
el medio total ente transparente.
 Gamma (γ): ausencia de hemólisis.

Agar Chocolate
Consiste en un medio enriquecido con
complemento VX de tal forma que favorece el
crecimiento de diversos patógenos fastidiosos como Haemophilus spp. y Neisseria spp.
aislados de materiales clínicos nobles (LCR, aspirados invasivos) o no (sangre,
secreciones) entre otros. La adición de bacitracina al medio facilita el desarrollo de
especies como Haemophilus spp., promoviendo ligera inhibición sobre algunos
microorganismos de la microbiota. Indicado para la investigación clínica de
microorganismos fastidiosos en muestras de origen noble y en muestras de
secreciones. Carpenter y Morton describieron un medio mejorado para el aislamiento
del gonococo en 24 horas. La eficacia de este medio, Agar GC complementado con
hemoglobina y concentrado de levadura, se demostró en un estudio de doce medios
utilizados en la altura para el aislamiento de este microorganismo. La BBL® mejoró el
medio sustituyendo el concentrado de levadura por el complemento de enriquecimiento
IsoVitaleX Enrichment, un complemento definido químicamente, desarrollado
especialmente para auxiliar en el crecimiento de gonococos, aunque se aplique
ampliamente a otros microorganismos como, por ejemplo, el Haemophilus spp. y
Streptococcus pneumoniae.
Instrucciones
Suspender 44 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Calentar con agitación
frecuente y hervir durante un minuto para disolución total.
Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
Preparación de Agar Chocolate: agregar 5-10 % de sangre ovina desfibrinada
estéril (Britasheep) al medio esterilizado, fundido y enfriado a 45-50 ºC. Calentar a
80 ºC durante 10 minutos mezclando frecuentemente. Dejar enfriar a 45-50 ºC y
distribuir en placas de Petri estériles.

Tinción
Tinción Gram
El procedimiento de tinción más ampliamente usado en bacteriología nos permite dividir
a las bacterias en dos grandes grupos taxonómicos: Gram positivas y Gram negativas,
según sea su comportamiento frente a la tinción.
Se cree que la diferencia en la coloración que adquieren los dos grupos de bacterias se
debe a la distinta composición química de la pared celular. Las bacterias Gram positivas
tienen una gruesa capa de mureina o peptidoglicano (de 20 a 80 nm de espesor) en su
pared, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano (2
nm) más fina y una capa más externa de lipopolisacáridos, lipoproteínas y lípidos.
La tinción requiere cuatro soluciones un colorante o tinte básico, un mordiente
(sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el tinte), un decolorante (elimina
el tinte de una célula teñida) y un segundo tinte o colorante de contraste (tinte de color
diferente a la inicial). Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa
una decoloración con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas,
mientras que en las Gram positivas el colorante queda retenido y las células
permanecerán azules. Las células Gram negativas se teñirán después con el colorante
de contraste (safranina) para que puedan observarse.
Procedimiento
1. Con un asa de siembra tome una colonia y extiéndala en un porta con el fin de
preparar un frotis bacteriano y fije la preparación (Ver práctica Preparación de un
frotis bacteriano para el procedimiento).
2. Tiña con cristal violeta durante 30 segundos.
3. Tirar el exceso de colorante.
4. Añadir lugol, esperar un minuto
5. Decolorar con etanol al 95%, 20 segundos.
6. Lavar con agua.
7. Añadir el colrante de contraste, safranina, esperar 1 minuto.
8. Lavar con agua.
9. Observar al microscopio (x40, x100). Leer el apartado de prácticas Uso del
microscopio.
Pruebas para el diagnóstico bacteriológico
Prueba Catalasa
Prueba de la Catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La prueba se utiliza para comprobar la
presencia de la enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contienen el citocromo oxidasa. La principal
excepción son los estreptococos (Streptococcus).
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (catalasa -) de Micrococcus (catalasa +) y/o Staphylococcus (catalasa +).
Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con
las excepciones de las especies C. pyogenes y C. haemolyticum, ambas -) de
Erysipelothrix (-)

Material
Agua oxigenada al 30%, cultivo bacteriano y portaobjetos o tubo de ensayo.
Procedimiento
Normalmente hay dos tipos de pruebas:
Método del portaobjetos:
Es una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente.
Procedimiento
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada al 30% y se
pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos a estudiar. La
muestra se recoge con el asa de siembra y se toma preferentemente el centro de
una colonia pura de 18-24 horas.
Revelado
Observar la formación inmediata de una efervescencia rápida con desprendimiento
de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con
desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se
debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que
los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado
positivo Método del tubo de ensayo Agregar 1 ml de H2O2 al 3% directamente a un
cultivo de agar densamente inoculado. Observar la formación inmediata de burbujas
(resultado positivo).
Prueba coagulasa
Permite diferenciar Staphylococcus aureus
(coagulasa positiva) del resto de especies de
Staphylococcus (coagulasas negativos). La técnica
en tubo detecta coagulasa libre y ligada.
Mecanismo de acción de la coagulasa libre:
procoagulasa (enzima extracelular bacteriana)
reacciona con un factor activador presente en el
plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando
lugar a un complejo análogo a la trombina
(coagulasa propiamente dicha) que reacciona con
fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en
ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de
agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere
la presencia de activadores plasmáticos.
Materiales
 Plasma.
 Pipeta Pasteur.
 Tubos dehemólisis.
 Muestras en tubo.
 Baño maría.
 Gradilla.
 Mechero Bunsen.
 Mechero.
Procedimiento
 Se echa un poco de plasma, con la Pipeta Pasteur, en un tubo de hemólisis.
 Se toma un inóculo de cada una de las muestras.
 Se mete el asa de siembra en el tubo con el plasma y se remueve levemente.
 Se llevan los tubos al baño maría y se incuban a 37º durante unos 30 minutos.
 En caso de que se forme un coágulo, será coagulasa positiva.
 En coagula positivo son Staphylococcus aureus y si sale negativo es
Staphylococcus coagulasa negativo.

Prueba manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando
productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará
a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-
Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la
prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus
epidermidis (-).

3. MATERIALES

Nº Materiales de Vidrio Insumo y equipos Reactivos

Tubos de Peroxido de
1. Gradillas
ensayo Hidrogeno

2. Pipetas Propipeta Azul de metileno

Vaso de Safranina
3. Tubo EDTA
Precipitado

Matraz Asa
4. Alcohol etilico
Erlenmeyer Bacteriológica

Vidrio de
5. Mechero Bunsen lugol
Reloj

6.  Caja Petri Piseta

Probeta de Pipeteador
7.
10 mL Manual
 Porta
8. Balanza Analítica
Objetos

9. Estufa de Cultivo

10. Auto Clave

11. Agar chocolate

12. Agar manitol

4. PROCEDIMIENTO

5. RESULTADOS

6. CONCLUSION

7. BIBLIOGRAFIA
1. Britanialab.com. [citado el 14 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6070906bed89d.pdf
   
2. Bacteriológico D. Uba.ar. [citado el 14 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://www.fmed.uba.ar/sites/default/files/2018-02/tex2.pdf
   
3. Britanialab.com. [citado el 14 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6054ea2307fd9.pdf
   
4. Ulpgc.es. [citado el 14 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35696/tincion_de_gram.pdf
   
5. PRÁCTICA 20 – Prueba coagulasa [Internet]. Prácticas de Microbiología. 2017
[citado el 14 de mayo de 2023]. Disponible en:
https://fiestadelosmicroorganismos.wordpress.com/2017/03/01/practica-20-
prueba-coagulasa/
   

8. CUESTIONARIO