UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

BIOQUÍMICA
PRACTICA: N°7
TITULO: “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE
PROTEÍNAS POR MÉTODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO”

Grupo de practica: Viernes 11:00-1:00pm

Estudiante: Parihuana Pérez, Angie
Código: 2018-110049
Docente: Blga. Mblga. Teresa Lanchipa Ale

Tacna – Perú

2021
 PRÁCTICA Nº 07
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR MÉTODO
ESPECTROFOTOMÉTRICO
I. INTRODUCCIÓN
El análisis de los perfiles metabólicos es un instrumento clínico que permite estudiar
trastornos de tipo metabólico y obtener un acercamiento a la evaluación del balance
nutricional del organismo. Para el estudio del estado metabólico se emplean constantes
bioquímicas sanguíneas proteínas, globulinas, albúminas. Las constantes bioquímicas
representan las principales vías metabólicas del organismo, de las cuales las proteínas
totales son los representantes más importantes de las vías metabólicas en la producción,
mientras la albúmina representa el metabolismo proteico.
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en
el organismo, esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de
transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de
coagulación, etc. En el plasma, las proteínas contribuyen a mantener el volumen del fluido
circulante, transportan sustancias relativamente insolubles y actúan en la inactivación de
compuestos tóxicos y en la defensa contra agentes invasores. La determinación de
proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados
de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición,
infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras
como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentración de diversos
orígenes, (ej.: deshidratación) se observan hiperproteinemias. En general, ambas
situaciones se ven acompañadas también por hipoalbumineas. Los aumentos anormales
de albumina son ocasionales y se relacionan casi siempre con deshidratación que produce
el consecuente aumento en el contenido proteico del plasma.

II. OBJETIVO
Determinar mediante método colorimétrico los niveles séricos sanguíneos de proteína
total, albúmina y globulina.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
De obtención de muestras: Torundas de algodón, alcohol yodado, tubos Vacutainer de
10 mL, gradillas (con y sin anticoagulante)
Obtención de suero o plamas: Centrífuga, viales de plástico de 5 mL, pipetas Pasteur,
cronómetro
Análisis de laboratorio: Espectrofotómetro, Tubos de prueba de 10 mL, Pipetas
graduadas, Micropipetas automáticas, Baño María, Gradillas.
Reactivos: Para la determinación cuantitativa de proteína total y fraccionada.
Reactivo A: EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/L en NaOH 875 mmol/L y alquil
aril polieter (AAP).
 Reactivo BCF: solución de 3,3’, 5,5’-tetrabromo cresolsulfonftaleina (en polioxietilen
lauril éter).
Suero patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido de
proteínas (Biuret o Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).
IV. PROCEDIMIENTO
Obtención y conservación de muestras
Las muestras de sangre se obtienen en ayuno, la sangre se colectará en tubos de ensayo
sin anticoagulante para inmediatamente ser centrifugados a 3500 rpm durante 15 minutos,
luego se obtendrá el suero sanguíneo, los que se conservaron en viales de plástico
esterilizados de 5 mL los cuales serán rotulados y conservados en congelación a -20°C
hasta su análisis en el laboratorio.
Para el caso de plasma, se obtendrá la sangre en tubos con anticoagulante para de ahí ser
centrifugados para obtenerse el plasma y traspasar el mismo a viales los cuales serán
rotulados y conservados.
Método de análisis bioquímico
1. Determinación de proteínas totales
La determinación se basó en la aplicación del reactivo Biuret, que permite que los
enlaces peptídicos de las proteínas reaccionen en el medio alcalino con el ion
cúprico del reactivo de Biuret dando un complejo de color violeta, cuya intensidad
es proporcional a la concentración de las proteínas totales en la muestra, las cuales
se determinaron espectrofotométricamente a 540 nm de longitud de onda

Medio alcalino

Proteina +Cu++ Complejo coloreado

Procedimiento
• En tres tubos marcados: B (blanco), S (Standard) y D (Desconocido),
colocar:

Blanco Standard Desconocido

Agua destilada 50 ul
Standard - 50 uL -
Muestra - - 50 uL
Reactivo enzimático 3,5 mL 3,5 mL 3,5 mL
A

• Mezclar
• Incubar 15 minutos a 37 ºC
• Leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando a cero con el blanco de reactivo.
• Se Llevó al espectrofotómetro para la lectura de la absorbancia del estándar
y de las muestras a una longitud de onda de luz de 540 nm, para esto se llevará
primero a cero el blanco del reactivo.
• Se realizó el cálculo con la siguiente fórmula:
 g
[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠] ( ) = 𝐴𝑏𝑠. 𝐷 𝑥 𝑓
dl

[St]
f=
Abs St
[Concentración del St] =8 g/dL
• Los resultados se expresarán en g/dL

2. Determinación de albúmina

La albúmina reacciona específicamente -sin separación previa- con la forma

aniónica de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftaleína (BCF). El aumento de
absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es proporcional a la
cantidad de albúmina presente en la muestra.
Procedimiento

• Se preparará el siguiente juego de tubos donde se colocará:

Blanco Standard Desconocido
Standard - 10 uL -
Muestra - - 10 uL
Reactivo 3,5mL 3,5 mL 3,5 mL
enzimático

• Mezclar e incubar por 10 minutos a una temperatura de entre 15 y de 28ºC.

• Llevar al espectrofotómetro para realizar la lectura de la absorbancia del
estándar y de las muestras a una longitud de onda de 625 nm.
• Realizar el cálculo con la siguiente fórmula:

g
[𝐴𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎] ( ) = 𝐴𝑏𝑠 𝐷 𝑥 𝑓
dl

[St]
f=
Abs St

[Concentración del St] =4 g/dL

• Los resultados se expresan en g/dL

3. Determinación de Globulinas
La determinación de globulinas se basó en la diferencia de las concentraciones de
albúmina de las proteínas totales como muestra la siguiente fórmula. Los
resultados fueron expresados en g/dL de suero sanguíneo.
 Globulinas (g/dL) = Proteínas totales – Albúmina

VALORES REFERENCIALES
Humanos
Proteínas totales: 6,1 a 7.9 g/dl
Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dl (HUMANO)
PERRO: 2,9-4,2 mg/dl
GATO: 2,4-3,8 mg/dl
EQUIDOS: 2,5-3,6 mg/dl
Globulinas totales
PERRO: 2,3-4,4 g/dl
GATO: 2,5-4,2 g/dl
EQUIDOS: 2,3-4,1 g/dl
Proteínas totales
PERRO: 5,4-7,5 g/dl
GATO: 5,7-8,9 g/dl
EQUIDOS: 5,2-7,9 g/dl

V. RESULTADOS

1.Determinación de proteínas totales

Se realizara:
Factor de calibración:
B S D [𝑆𝑡]
𝑓 = 𝐴𝑏𝑠 𝑆𝑡 → Concentración del St= 8g/dL
[8%]
𝑓 = 0,210 = 38,09

Concentración de albumina:
𝑔
[Proteínas totales] 𝑑𝐿 = Abs.D x f
Abs: 0 Abs: 0,210 Abs: 0,255
PT= 0,255(38,09) = 9,71 g/dL

• Se observa que la concentración de proteínas totales del desconocido es 9,71g/DL.

 2. Determinación de albumina

Mezclar e incubar por 10 minutos a una temperatura de entre 15 y de 28ºC.

Colocamos a una
B S D
temperatura ambiente de
15-28°C
Reactivo Estándar Muestra
enzimático 3,5mL desconocida
3,5mL 10uL 3,5mL
10uL

Llevar al espectrofotómetro para realizar la lectura de la absorbancia del estándar y de las

muestras a una longitud de onda de 625 nm.

Realizar el cálculo con la siguiente fórmula:

g
[𝐴𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎] ( ) = 𝐴𝑏𝑠 𝐷 𝑥 𝑓
dl
[St]
f=
Abs St
[Concentración del St] =4 g/dL
 Los resultados se expresan en g/dL

B = Abs;0 Factor de calibración:

S= Abs;0,572
D= Abs; 0,635 Concentración del St= 4g/dL
4𝑔/𝑑𝐿
𝑓= = 6,99
0,572

Concentración de albumina:

Alb= 0,635(6,99) = 4,44g/Dl

• La concentración de la albumina en el segundo fue de 4,44 g/dL

2. Determinación de globulinas

Del segundo procedimiento se tendría que:

G = 9,71-4,44
G= 5,27 g/Dl
La concentración seria 5,27 g/dL por los resultados anteriores.

VI. CONCLUSIONES

La espectofotometria nos hace ver el significado importante del efecto de absorción,lo

cual es de gran utilidad para la determinación de concentraciones en muestras que tienen
un colorido peculiar.

VII.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Borque de Larrea L, González de Buitrago JM (1998): Proteínas del plasma
sanguíneo. En González de Buitrago JM, Arilla E, Rodríguez-Segade M, Sánchez A
(eds): Bioquímica Clínica, 1ª Ed. Editorial
• Christensen SE (1995): Proteínas. En Anderson SC, Cockayne (eds): Química
Clínica, 1ª Ed. Editorial Interamericana McGraw-Hill (México D.F., México),
• D’Ocon MD, García MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de las
proteínas.