Está en la página 1de 7

APLICACIÓN DE ESPECTROFOTOMETRÍA

COMO MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE


BIOMOLÉCULAS

INTEGRANTES:
 CABALLERO ACOSTA LUZ
 SOTELO LUCAS

CARRERA: LIC EN GENETICA

CATEDRA: QUIMICA BIOLOGICA

COMISIÒN: 8HS

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUIMICAS Y


NATURALES
INTRODUCCIÓN:

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas.


El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o
transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto (muestra a
analizar), y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. En otras palabras la
determinación cuantitativa de una especie, con base en observaciones que dependan de la
cantidad de radiación absorbida, dependen de la comparación entre el valor de la absorción de un
patrón de referencia y la absorción de la muestra. Los espectrofotómetros deben permitir efectuar
la comparación entre la señal obtenida por una mezcla que no contiene el analito (blanco) y otra
que si lo tiene, para obtener de esta manera solo la absorbancia del analito [Abs. patrón (Sn +
analito) – Abs. blanco (Sn)].

OBJETIVOS:

Aprender a utilizar como herramienta de determinación cuantitativa, de moléculas orgánicas, el


método espectrofotométrico. Determinar empíricamente los valores de concentración de
proteínas, glucosa y colesterol, como así también conocer los parámetros normales y anormales,
en seres humanos.

Análisis de resultados
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

La determinación de glucosa sanguínea, es el dato más importante y de más larga data para el
estudio de pacientes con alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos. La concentración
de glucosa, se mantiene constante dentro de ciertos límites. Los mecanismos de regulación de los
niveles de glucosa sanguínea se producen a expensa de un equilibrio entre la producción y el
consumo, procesos regulados por hormonas (insulina, glucagón, adrenalina, somatostatina) y
glucocorticoides intervinientes en el proceso. Las variaciones de los niveles de concentración de
glucosa fuera de los límites normales, tanto para sangre, líquido cefalorraquídeo y otros, pueden
derivarse en una gran cantidad de estados patológicos. Se produce hiperglucemia en
enfermedades como: Diabetes Mellitus, Pancreatitis crónica y aguda, insuficiencia hepática y
renal, etc. Se produce hipoglucemia en enfermedades como: Enfermedad de Adisson-mixedema,
tumores extrapancreáticos, productores de sustancia insulinoides, etc. (consultar apunte teórico
para el parcial).

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La glucosa de la muestra se determina calorimétrica mente según la siguiente ecuación:

Glucosa + Oxigeno GOD Ac. Glucónico + H2O2

2 H2O2 + Fenol + 4-AF POD Quinoneimina + 4 H2O

La Quinoneimina es cromógeno rojo con pico de absorción a 505 nm.

MARCHA PRÁCTICA
Materiales:
• Reactivo 1: 4-aminofenazona.

• Reactivo 2: Fenol.

• Reactivo 3: Enzimas GOD y POD.

• Patrón: Solución de Glucosa (1 g/l)

• Muestra: Suero o Plasma Heparinizado.

• Timer

• Espectrofotómetro o colorímetro.

• Micropipetas y pipetas

• Probeta

• Baño María a 37º

Procedimiento: Se prepararon 3 tubos de ensayo

● B: Blanco en este se coloca solo el reactivo de trabajo


● P: Patrón en la misma agregamos la solución patrón junto con el reactivo de trabajo
● M: Muestra en este agregamos el reactivo de trabajo y la muestra (Plasma sanguíneo)

Glucosa
Cálculos: ƒ = 1 / (Abs. P – abs B) = g/l; Glucosa en g/l: ƒ. Abs M

Resultados: P: 0.268, B: 0.021, M: 0.421


1
𝐹= = 4.04
0.268 − 0.021
𝐺
: 0.421 ∗ 4.04 = 1.70𝑔/𝑙
𝐷𝐿
Glucosa en sangre: 1.70g/dl

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL

El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones, tanto
en individuos sanos como en enfermo.

El colesterol sérico, es influenciado por un gran número de condiciones patológicas.

Teniendo en cuenta la notable prevalencía de problemas asteroscleróticos y enfermedades


coronarias en la población actual y la relación estadística significativa entre dicha patología y la
hipercolesterolemia, la determinación del colesterol sérico es un aporte importante en el control
de los llamados factores de riesgos, para el desarrollo de las enfermedades coronarias.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis


enzimática de los ésteres mediante una lipasa de origen fúngico. El agua oxigenada genera la
oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una
reacción catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinona con absorbancia máxima a 505
nm.

La secuencia es la siguiente:

Esteres de colesterol + Oxígeno Lipasa Colesterol + Ácidos Grasos

Colesterol + Oxígeno CHOD Colesterol-3-ona + H2O2

H2O2 + 4-AF + Fenol POD 4(P-benzoquinona monoimino) fenazona + H2O

Colesterol
Calculos ƒ = 2/ (Abs. P – abs B) = g/l ; Colesterol en g/l = ƒ . (Abs. M)

Resultados: P: 0.243 ; B: 0.044 ; M: 0.345


2
𝐹= = 10.05
0.243 − 0.044
𝐺
= 10.05 ∗ 0.345 = 3.46𝑔/𝑙
𝐷𝐿
Colesterol en sangre: 3.46𝑔/𝑑𝑙

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES Y ALBÚMINAS

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el


organismo.
Actúan como elementos estructurales y de transporte, y aparecen bajo la forma de enzimas,
hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc.
Esta multiplicidad de funciones hace que las proteínas resulten esenciales para la vida. En el
plasma las proteínas contribuyen a mantener el volumen de fluido circulante, transportan
sustancias relativamente insolubles y actúan en la inactivación de compuestos tóxicos y en la
defensa contra agentes invasores.

Normalmente las proteínas más abundante en el plasma es la albúmina, cuya función más
importante es la de permitir el transporte de ácidos grasos, hormonas esteroides, bilirrubina y
catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso.
La concentración de albúminas en el plasma influye notablemente en el mantenimiento de la
presión coloidosmótica, lo que estaría relacionado con su relativamente bajo peso molecular y
su gran carga neta.
En condiciones patológicas, como perdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas,
suele presentarse hipoproteinemia, mientras que en otras situaciones como mieloma múltiple,
endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diverso origen se presenta
hiperproteinemia.
En general, ambas situaciones se ven acompañadas también por hipoalbuminemias.
Los aumentos anormales de albúminas son ocasionales y se relacionan casi siempre con
deshidratación, que produce el consecuente aumento del contenido proteico del plasma.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino, para
dar un complejo de color violeta con máximo de absorción a 540 nm cuya intensidad es
proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.
MARCHA PRÁCTICA:
Materiales:
• Reactivo EDTA/Cu: Complejo EDTA/Cu 13mmol/lt y alquil aril polieter (AAP).
• Suero Patrón: Solución de albúminas y globulinas en estado nativo con título conocido de
proteínas y albúminas.
• Muestra: Suero libre de hemólisis.
• Espectrofotómetro o Colorímetro.
• Micropipetas y pipetas.
• Tubos de ensayo.
• Baño María a 37 º C.

Proteínas totales
Cálculos: f = (Proteínas Totales g/dl) / (Abs. P – abs B) ; Proteínas Totales en g/dl = Abs. M . f

Resultados: P: 0.438 ; B: 0.027 ; M:0.632

Concentración de patrón 2.8 G/l


2.8
𝐹= = 6.81
0.438 − 0.027
𝑃𝑇 = 6.81 ∗ 0.632 = 4𝑔/𝑙
Proteínas totales: 4𝑔/𝐷𝑙

DETERMINACIÓN DE ALBÚMINAS

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

La albúmina reacciona específicamente con la forma aniónica de la Bromocresolsulfonftaleína

(BCF) en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de

absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo es proporcional a la concentración de

albúmina.

MARCHA PRÁCTICA:

Materiales:
• Reactivo (BCF): Solución de Bromocresolsulfonftaleína.

• Suero Patrón.

• Muestra: Suero libre de hemólisis

Albuminas
f = factor = (Albúminas g/dl) / (Abs. P – abs B) ; Alb. en g/dl = (Abs. M) . f

Resultados: P: 0.438; B:0.027; M:0.421

Concentración de patrón: 4.4 g/l


4.4
𝐹= = 20
0.247 − 0.030
𝐺
= 20 ∗ 0.421 = 8.53𝑔/𝑙
𝐷𝑙
Albuminas totales: 8.53𝑔/𝑑𝑙

Valores de referencia:
● Glucosa

Valores de Referencia de Glucosa, entre: 0 .70 – 1.10 g/l

● Colesterol

Valores de referencia (pacientes mayores de 20 años)

Valor deseable: hasta 2 g/l Valor

Límite: hasta 2.4 g/l

Valor elevado: mayor a 2.4 g/l

● Proteínas Totales

Valor de Referencia: Proteínas Totales = 6,1 a 7,9 g/l

● Albuminas

Valor de Referencia: Albúmina = 3,5 a 4,8 g/l

Posible diagnostico

1 Glucosa: 1.70g/l = Valor elevado

2 Colesterol: 3.46𝑔/𝑙 = Valor elevado

3 Proteínas Totales: : 4𝑔/𝑙 = Valor muy bajo

4 Albuminas: 8.53𝑔/𝑙= Valor muy elevad


Posibles Diagnósticos
Los niveles altos de colesterol pueden ser señales de Diabetes y la elevada presencia de este
puede causar ateroesclerosis por su depósito en las arterias también pueden ser señal de
síndrome de ovario poliquístico si el paciente fuera femenino , mientras que los niveles elevados
de Glucosa son señales de problemas en el páncreas y también es señal de Diabetes, los niveles de
proteínas bajos muestra posibles problemas de absorción del intestino o problemas en los riñones
lo que coincide con las albuminas altas que también son una señal de problemas en los riñones o
el hígado

Cuestionario
¿Por qué se debe incubar a 37 ºC y no a 25 ºC que es la temperatura estándar de laboratorio?
Para aumentar la eficiencia de la enzima que es responsable de que ocurran las reacciones
necesarias para la detección cuantitativa de las sustancias de interés.

¿Por qué la concentración del patrón de glucosa es 1 g/l?


Por qué la concentración de la glucosa en la sangre de un persona normal es de 1g/L, es decir es
nuestro control.
¿Por qué se debe restar el blanco?
Al utilizarse un espectrofotómetro de doble haz de luz, se debe omitir la absorción del blanco para
el cálculo del factor.

¿Qué cuidados debe tener al manejar muestras biológicas?


Se debe tener especial cuidado en el manejo de estos reactivos durante su uso en el laboratorio
para no cometer errores que puedan poner en peligro la integridad del equipo de laboratorio. Se
los deben rotular de tal forma que se especifique todas las características que prescribe dicho
reactivo (Propiedades, Peligros, etc.)
¿Qué cuidados debe tener con el almacenamiento de los reactivos, en especial los que
presentan actividad biológica?
Los reactivos de carácter biológico deben preservarse en recipientes cerrados debidamente e
inactivarse en condiciones de bajas temperaturas para su almacenamiento. También Se debe
respetar el tiempo de caducidad para su utilidad en ciertas reacciones.