UT13. Técnicas IHQ - Controles. Marcadores Tumorales

Técnicas IHQ.Controles.
Marcadores tumorales
U.T. 13: TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS. CONTROLES.

MARCADORES TUMORALES
1. INTRODUCCIÓN.
2. FUNDAMENTOS DE LAS TÉCNICAS EN INMUNOHISTOQUÍMICA.
3. TRAZADORES ENZIMÁTICOS EN IHQ: TÉCNICAS CON AC

MARCADOS Y TÉCNICAS CON AC NO MARCADOS.
4. MÉTODOS DE AVIDINA-BIOTINA.
5. TÉCNICAS DE HAPTENO-ANTIHAPTENO.
6. DOBLES TINCIONES.
7. TÉCNICAS DE ORO COLOIDAL.
8. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO CON LAS MUESTRAS PARA

ESTUDIO DE IHQ.
9. RECUPERACIÓN DEL AG.
10. MARCADORES TUMORALES.
Procesamiento Citológico y Tisular

CFGS Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
CIFP Los Gladiolos
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Técnicas IHQ.Controles. Marcadores tumorales
1. INTRODUCCIÓN
Los métodos inmunohistoquímicos sirven para detectar Ag celulares o tisulares mediante la

unión Ag-Ac. Debemos utilizar algún otro elemento que permita visualizar y localizar esta
reacción. Por este motivo se emplean marcadores o trazadores, es decir, sustancias como
enzimas, fluorocromos, o metales pesados que unidos a los Ac permitirán la inmunolocalización.
El tipo de Ig que generalmente se utiliza en este tipo de técnicas es la IgG.
2. FUNDAMENTOS DE LAS TÉCNICAS EN INMUNOHISTOQUÍMICA.
En función del marcador utilizado las técnicas IHQ podemos clasificarlas en:
● Técnicas de inmunofluorescencia: Utilizan fluorocromos, siendo necesario para su

observación un microscopio de fluorescencia.
● Técnicas inmunoenzimáticas: Utilizan enzimas, que posteriormente habrá que revelar.
● Metales: Oro coloidal.
Independientemente del marcador utilizado, las técnicas IHQ se pueden dividir en dos grandes
grupos: El antígeno puede detectarse tanto por marcaje directo del anticuerpo (técnicas directas)
como por alguno de los muchos métodos de marcaje secundario (técnicas indirectas);
Métodos directos:
● Es un método sencillo, ya que se realiza de forma directa la unión (por enlace covalente)
entre el Ac marcado y el Ag.
● Presenta diversas desventajas, siendo necesario el marcaje de todos los Ac primarios y el
propio marcaje del Ac puede alterar su reactividad.
Método indirecto:
● En este caso, se aprovecha el hecho de que las Ig pueden comportarse como Ag, de
modo que se pueden obtener anti-Ig específicos para una especie determinada. Tras
producirse la unión Ag-Ac (en este caso no marcado) se incorporaría el anti-Ig marcado,
produciéndose la unión con el primer Ac utilizado.
● Estos métodos presentan una serie de ventajas respecto al anterior porque no se altera la
especificidad del Ac, se puede realizar una ampliación de la señal (resultados más
visibles por el uso de varios Ac secundarios) y además estos anti-Ig marcados al ser
específicos de la especie, podrán utilizarse para detectar todos los Ac primarios de esa
especie.

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3. TRAZADORES ENZIMÁTICOS EN IHQ: TÉCNICAS CON AC MARCADOS Y

TÉCNICAS CON AC NO MARCADOS.
Técnicas basadas en la inmunoperoxidasa: Anticuerpos marcados.
Al igual que los fluorocromos, las enzimas pueden ser utilizadas como moléculas marcadoras
para detectar la unión Ag-Ac. La aparición de esta técnica data de 1966, utilizando como enzima
la peroxidasa. En este caso, será preciso incluir en el protocolo de la técnica, el substrato sobre
el que la enzima actúa y un cromógeno que forme un precipitado insoluble y coloreado,
generalmente marrón-negro, azul o rojo.
De entre las enzimas utilizadas, la peroxidasa, obtenida de la raíz de la planta del rábano picante,
es la más común, pudiendo emplearse en diferentes métodos y técnicas. Esta enzima actúa sobre
el sustrato peróxido de hidrógeno, que lo descompone en agua y oxígeno. El oxígeno liberado
actúa sobre el cromógeno (DAB) obteniendo un color marrón-negro.
¿Qué técnicas pueden realizarse?
● Se pueden marcar los Ac primarios con la enzima y realizar el método directo, que a
pesar de ser un método sencillo, no está exento de diversos problemas: Pérdida de la
actividad de la enzima o del Ac debido a la unión covalente entre ellos, difícil
purificación de los Ac, etc.
● Marcar los Ac secundarios, es decir, realizar el método indirecto.
Estas técnicas presentan ventajas respecto a la inmunofluorescencia como:
● Presentar mayor sensibilidad debido a la capacidad de la peroxidasa de desdoblar

múltiples moléculas de sustrato.
● Poderse realizar en tejido fijado con formol y parafinado.
● Permanencia de las preparaciones.
● Observación con microscopio de luz ordinaria.
A pesar de ello, estas técnicas no resultaron del todo satisfactorias, ya que presentaban también
ciertos inconvenientes.
Por ejemplo, la enzima peroxidasa está presente en tejidos, pudiendo por ello, dar lugar a falsos
positivos. Además, la elevada toxicidad del agente cromógeno utilizado, hace que deban
extremarse las medidas de seguridad en su manipulación.
Por ello, en 1970, Sternberger y cols. modificaron la técnica introduciendo la utilización de

complejos peroxidasa-antiperoxidasa, que posteriormente comentamos.
Técnicas basadas en la inmunoperoxidasa: Anticuerpos no marcados.
En esta técnica, en lugar de Ac marcados, se utilizan complejos formados por la enzima

peroxidasa y anticuerpos específicos contra ella, denominados complejos PAP.
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¿Cómo se obtienen estos complejos?
Obtenida la peroxidasa del rábano picante se purifica y se inyecta al animal (generalmente el

conejo) que producirá Ac contra la enzima. Se extrae sangre al animal y se separa el suero con
los Ac. Posteriormente, "in vitro" se ponen en contacto estos Ac con la peroxidasa,
produciéndose en complejo Ag-Ac o peroxidasa-antiperoxidasa. Estos complejos están formados
por tres moléculas de peroxidasa y 2 de antiperoxidasa.
¿Cómo se realiza la técnica?
En esta técnica se utilizan de forma sucesiva 3 reactivos inmunes:
● Un Ac primario (IgG obtenida de conejo o ratón) frente a un Ag humano.

● Un Ac puente, que unirá el Ac primario al complejo PAP, se habrá obtenido de una
especie diferente a la del Ac primario y del PAP. Por ej. si el Ac primario ha sido
obtenido de conejo, éste será de cabra o de cerdo). Este Ac puente, se debe administrar
en exceso para que uno de sus sitios Fab se una al Ac primario y el otro al complejo
PAP.
● El complejo PAP contiene la enzima trazadora de la reacción inmune. Cuando la
reacción se ha producido, sólo queda revelar y localizar esta unión, añadiendo el sustrato
(H2O2) y el cromógeno (DAB u otros utilizados en la técnica).
¿Qué ventajas presenta esta técnica respecto a las anteriores?
● Se evita la pérdida de actividad de los Ac, puesto que no están marcados.

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● Se incrementa la sensibilidad de la técnica, porque por cada Ac primario que se ha unido

al Ag, existen 3 peroxidasas, que tras el revelado, producirá mayor coloración a pesar de
estar el Ac muy diluido o existir escaso Ag.
Aunque hace unos años estas técnicas eran ampliamente utilizadas en los laboratorios por su
sensibilidad y fiabilidad, hoy en día han sido desplazadas por otras técnicas.
4. MÉTODOS DE AVIDINA-BIOTINA.
En 1981, una nueva generación de métodos inmunohistoquímicos surgió, como la técnica de

avidina-biotina, siendo en la actualidad el método más utilizado y habiéndose convertido en casi
una tinción de rutina en muchos laboratorios.
Son métodos muy sensibles que utilizan Ac marcados y se basan en la gran afinidad que tienen
entre sí las moléculas de avidina y biotina, formando un fuerte enlace entre ellas.
La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular y que está presente en la clara del huevo
y en la bacteria Streptomices avidinii, teniendo esta última algunas ventajas respecto a la
anterior, como son tener un pH neutro. Puede combinarse con gran variedad de proteínas, Ig,
enzimas, glicoproteínas, polisacáridos y oro coloidal.
Esta molécula, tiene cuatro lugares de unión para la biotina.
La biotina es una vitamina perteneciente al complejo B que se extrae de la yema del huevo,
aunque también está presente en algunos tejidos animales como hígado y riñón. Aunque la
biotina tiene un sólo sitio de unión para la avidina, tiene la peculiaridad de poder unirse de forma
covalente a múltiples moléculas como Ig y enzimas trazadoras. Generalmente es la biotina que
por su pequeño tamaño se utiliza para conjugar con los Ac, bien con el Ac primario (técnica
directa) o con el Ac secundario (técnica indirecta).
La técnica más utilizada de ABC es la indirecta en tres pasos, que como en el caso del complejo
PAP, esta técnica utiliza complejos previamente preparados de complejos avidina-biotina-
peroxidasa.

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Seguirá los siguientes pasos:
● Incorporar el Ac primario sin marcar.

● Ac secundario biotinado.
● Complejo avidina-biotina-peroxidasa, que se unirá al Ac secundario.
Tras producirse la unión deberemos revelar el lugar de unión añadiendo el sustrato y el

cromógeno.
Esta técnica presenta la ventaja de ser muy sensible y producir una gran ampliación de la señal,
debido a que a cada Ac marcado con biotina se le unen múltiples moléculas del complejo
avidina-biotina-peroxidasa.
Presenta la desventaja de que debido a que algunos tejidos pueden contener biotina, deberemos
bloquear esta biotina endógena previamente con avidina no conjugada.
Por supuesto, otras técnicas han surgido para evitar las limitaciones del método anterior. Entre
ellos tenemos:
● Métodos poliméricos que no dependen de la biotina, ya que utilizan un polímero que

llevan unidas varias moléculas de enzimas y Ac secundario. El uso de esta técnica abrió
la puerta a nuevas técnicas inmunohistoquímicas. Presenta el inconveniente de que por el
gran tamaño del polímero conjugado, está restringida la accesibilidad a ciertos epítopos.
● Amplificación de la señal con tiramida: Incorpora otro reactivo (tiramida biotinada)
para amplificar la señal después del complejo ABC. Esta tiramida biotinada forma
complejos con la peroxidasa del complejo ABC que se depositan en el lugar de la
reacción. A su vez, reaccionan con los complejos avidina-peroxidasa, dando lugar a más
depósitos de peroxidasa.

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TÉCNICAS DE HAPTENO-ANTIHAPTENO.
En este procedimiento se utilizan en un primer paso el antisuero primario conjugado con un

hapteno - uno de los más empleados es el dinitrofenol; a continuación se emplea como reactivo
inmune secundario un anticuerpo antihapteno; por último, se añade un anticuerpo enzima o
complejo PAP marcado con el hapteno. Con este método se consigue disminuir la tinción de
fondo inespecífica y se pueden emplear antisueros primario y secundario obtenidos de la misma
especie animal, ya que este último va dirigido contra el hapteno, y no contra el anticuerpo
primario.
DOBLES TINCIONES.
Si se realiza de forma secuencial cualquiera de los métodos anteriores y se emplean cromógenos

que originan una coloración distinta en cada caso, es posible determinar más de un antígeno
sobre una sola sección tisular.
Para evitar que se produzcan reacciones cruzadas deben emplearse anticuerpos obtenidos de
distinta especie animal o de subclases diferentes. Además, cuando se lleva a cabo este tipo de
técnicas deben tenerse en cuenta ciertas normas:
Se debe realizar siempre en primer lugar el procedimiento que utiliza el anticuerpo con reacción
más intensa. En este sentido, algunos antisueros originan una inmunotinción mayor que la de
otros, como ocurre con el antígeno Mielomonocítico, LeuMI (CD15) o en antígeno epitelial de
membrana (EMA).
Leu M-1 / CD15 / Antígeno mielomonocítico

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Linfoma de Hodgkin. Células de Reed-Stemberg.

Marcador epitelial y hematopoyético. Presente en el 95% de neutrófilos y eosinófilos maduros de sangre periférica y en los monocitos. En tejidos linfoides
reacciona con las células de Reed-Sternberg, con granulocitos y con algunos macrófagos. Se expresa frecuentemente en adenocarcinoma de pulmón y es negativo
en el mesotelioma por lo que suele emplearse en el panel de diagnóstico diferencial entre ambos. Immunohistochemical analysis of formalin-fixed, paraffin-
embedded human Hodgkin's lymphoma using Anti-CD15 Antibody [Leu-M1].
5. TÉCNICAS DE ORO COLOIDAL.
Aunque el primer uso del oro coloidal, todavía vigente hoy en día, fue en microscopía
electrónica (por ser denso a los electrones), puede ser también utilizado en microscopía óptica
como método citoquímico, debido al color rojo que producen.
El oro coloidal es obtenido a partir de cloruro de oro tras la acción de diversos agentes
reductores. Las partículas de oro (que pueden ser de diferentes tamaños) se unen a
inmunoglobulinas o a la proteína A, proteína presente en la bacteria Staphylococcus aureus con
la capacidad de unirse a la porción Fc de las inmunoglobulinas.
A su vez, esta proteína A puede unirse a otros marcadores, como por ejemplo el oro coloidal.
La conjugación de las proteínas al oro depende de varios fenómenos físicos:
● Atracción electrostática entre la carga negativa del oro y la positiva de la proteína.

● Adsorción de la proteína a las partículas de oro.
Esta técnica presenta algunas ventajas respecto a las técnicas inmunoenzimáticas como:
●No existe ninguna interferencia de oro endógeno.

● Se pueden visualizar al microscopio electrónico sin revelado.
● Son en cierto modo, cuantificables por observación del número de partículas.
● Por poseer partículas de diferentes tamaños, se pueden realizar varios marcajes.
● Los marcajes con enzimas o fluorocromos pueden desteñirse con el tiempo o con la
exposición a la luz, mientras que el oro proporciona un marcaje permanente.
● Es una sustancia no tóxica que puede ser almacenada a 4 ºC, teniendo por ello larga vida.
También presenta algunos inconvenientes como:
● Por el gran tamaño de las partículas en ocasiones los antisueros marcados no pueden
penetrar hasta el Ag.
● Se pueden formar agregados con las Ig.
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Se pueden realizar los mismos procedimientos técnicos que en las anteriores, es decir métodos
directos e indirectos.
6. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO CON LAS MUESTRAS PARA

ESTUDIO DE IHQ.
Para la observación de las muestras es necesario preservar al máximo todas las estructuras
biológicas, pero en el caso de las técnicas IHQ conservar la antigenicidad es primordial.
Durante el procesamiento de la muestra, se debería no sólo preservar el Ag de la degradación o

desplazamiento a otros lugares, también debe mantener su posición en la célula, bien sea nuclear,
citoplasmática o en membranas limitantes, para que los Ac pudieran detectarlos.
Pero este procesamiento implica modificaciones que pueden afectar a la inmunoreactividad, la

fijación entre ellas, es uno de los procesos más importantes que condicionarán los resultados de
la técnica IHQ.
La congelación sería el método más aconsejable para el almacenamiento de muestras y posterior

estudio, pero no siempre alcanzable como método de rutina.
Los fijadores químicos alteran las propiedades químicas de las proteínas, y con ello de los Ag,
aunque no todos se afectan por igual.
Se prefiere el uso de fijadores precipitantes a otros que como el formol producen reticularización
de proteínas, ya que debido a estos enlaces cruzados, los Ag quedan ocultos más fácilmente.
También los fijadores utilizados en microscopía electrónica como el glutaraldehído o el tetróxido

de osmio producen pérdida de la antigenicidad, motivo por el cual se prefieren combinaciones de
fijadores como la solución de Karnosvsky.
Un problema adicional cuando se utiliza formalina, es que en ocasiones resulta difícil conseguir
la fijación adecuada, dando en casos de fijación incompleta una inmunotinción desigual. Es
importante la validación de reactivos y protocolos para que los resultados sean reproducibles.
Otras secuencias del procesamiento como la elevada temperatura al que se somete el tejido
durante la inclusión en parafina pueden afectar los resultados IHQ. Por ello se recomienda el uso
de parafinas de bajo punto de fusión y realizar la infiltración en el menor tiempo posible, para
disminuir la alteración de Ag y la tinción inespecífica.
Cuando se realice la sección de los tejidos se cortará a 2-3 micras, puesto que secciones gruesas
poseen varias capas celulares, haciendo más difícil la interpretación.
Estas secciones deben ser recogidas en portaobjetos con sustancias adherentes. Están
comercializados portaobjetos con carga positiva que atrae la carga negativa de las proteínas del
tejido. También las hay con polilisina, albúmina, etc. Es importante que las secciones estén lisas
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y sin arrugas, se dejarán toda la noche en estufa a una temperatura de 56ºC. Al día siguiente se
realiza la desparafinación e hidratación para la realización de la técnica.
7. RECUPERACIÓN DEL AG.
La fijación con formol altera la estructura tridimensional de las proteínas con la modificación de
los epítopes y/o de su carga electrostática.
No obstante, pueden ser recuperados mediante las técnicas de recuperación antigénica que
permiten romper los enlaces cruzados, restaurar la estructura del Ag y evitar que se formen de
nuevo estos enlaces, mediante el uso de citrato que elimina los iones de Ca++.
Los métodos utilizados para la recuperación antigénica pueden ser variados:
Mediante digestión enzimática: Se basa en la utilización de enzimas proteolíticas.
Siendo la primera técnica que se aplicó, con el tiempo se ha ido incrementando el número de
anticuerpos útiles para el diagnóstico patológico a partir de tejidos infiltrados en parafina.
¿Qué tipo de proteasas se pueden utilizar?
Las enzimas más utilizadas son tripsina, pronasa, pepsina y proteinasa K, aunque no existe una
enzima universal. El utilizar una u otra dependerá de varios factores como: Tipo de tejido, grosor
del corte, procedimiento de fijación utilizado, etc.
Este método, presenta algunas ventajas, como por ejemplo, permitir el uso de mayores diluciones
de Ac y reducir la tinción no específica por suprimir alguna molécula proteica.
Pero los inconvenientes las superan debido a:
● No es útil en el aumento de la reactividad de todos los Ac, como los ricos en hidratos de
carbono.
● Si es excesiva puede producir la destrucción del tejido o del Ag. En otras ocasiones al
producir la digestión del Ag, se puede desenmascarar algún fragmento de este antígeno,
que sea común a otros, con el consiguiente aumento de la tinción no específica.
Existe una gran variabilidad de protocolos, aunque durante la realización de la técnica se deberán
controlar diferentes variables que tendrán en cuenta el valor óptimo de actividad de la enzima
tanto en temperatura (para muchas 37 ºC), pH, tiempo de incubación de la enzima, concentración
más adecuada.
Mediante calor:
Calentar los cortes en una solución con un pH determinado durante un periodo variable,
pudiendo utilizar varios métodos.

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Métodos combinados:
Para el desenmascaramiento de ciertos Ag como citoqueratinas, puede ser insuficiente un método

aislado, por lo que puede ser recomendable combinar los métodos anteriores.
Existen diferentes métodos en los que se aplica calor para lograr la recuperación Ag.
Independientemente del método utilizado es de gran importancia la composición y el pH de la

solución tampón, siendo el buffer citrato 0,01 M, pH 6 el más extendido, aunque en ocasiones se
debe utilizar un pH más básico, pH 9,9 o pH 9 con solución de citrato o Tris/EDTA.
A continuación se exponen diferentes métodos:
● Baños de agua como el sistema PT o el baño María convencional (provisto de

termostato): El primero es un instrumento que simplifica el proceso. Llenado el tanque
con la solución de trabajo, se introducen las secciones de tejido desparafinadas y
rehidratadas , tras una Tª de precalentamiento de 65 ºC, mantener de 20 a 40 minutos a
97 ºC. Cuando el ciclo ha finalizado y tras el periodo de enfriamiento, sacar las
preparaciones e introducir en buffer a Tª ambiente durante 1-5 minutos. Con el baño
María se colocan las preparaciones durante 20 a 40 minutos a 95 o 99 ºC en la solución.
Tras lo cual, se debe dejar enfriar hasta Tª ambiente y se pasan a solución Buffer TB.
● Esterilizador de biberones: Se rellena con agua hasta el nivel, colocar dentro el

contenedor (por ej. Coplin) con la solución de recuperación y las preparaciones
hidratadas. Para algunos Ag puede ser suficiente cuando llegue a la Tª de ebullición,
entre 5 y 8 minutos (un ciclo), pero es aconsejable hacer 2 o 3 ciclos. Tiene el
inconveniente de ser lento y que se produce cierta evaporación. Como los anteriores, una
vez atemperados los tejidos, lavar e introducir en tampón.
● Olla a presión: Con este procedimiento se asegura una Tª uniforme de 120 ºC. Es
conveniente que sea de acero inoxidable para soportar el ataque de los tampones. Una
vez hidratados los tejidos se introducirán en la solución en el momento de ebullición,
tapar la olla y cuando alcance los 120 ºC, dejar 2 o 3 minutos. Dejar enfriar la olla y los
portas. Lavar en agua destilada y tampón (TBS o PBS).
● Autoclave: Igual procedimiento que el anterior pero en autoclave.
● Horno microondas: Se puede utilizar un microondas convencional. En este caso los

portaobjetos se introducen en Coplin con la solución desenmascaradora y tapar para
evitar evaporación. Calentar a potencia máxima, 5 minutos, 2 veces. Como los tejidos
nunca deben quedar secos, si es necesario añadir agua. Dejar unos 20 minutos las
preparaciones a Tª ambiente, lavar con agua destilada e introducir en tampón.Este
sistema presenta más desventajas que otros, como desprendimiento del tejido, problemas
de evaporación, por lo que generalmente no se utiliza demasiado.

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● Combinar desparafinación y recuperación antigénica por el método automatizado

mediante estos aparatos.
La elección de uno u otro método dependerá de cada laboratorio, considerando el que suponga
menos inconvenientes y sea más reproducible.
El tratamiento con calor, al igual que otros puede tener efectos adversos cuando es demasiado
prolongado el tiempo en el que se aplica el calor, pudiendo disminuir la antigenicidad de los
tejidos o bien dificultar la contratinción con ciertos colorantes.
Controles
En las tinciones inmunohistoquímicas, al igual que en otras tinciones histoquímicas, es necesario

demostrar que el resultado obtenido es específico ya que numerosas variables condicionan los
resultados. Para ello deberemos realizar siempre controles negativo, positivo o interno, para
verificar los resultados.
Como control positivo utilizamos una sección de tejido en donde sabemos con certeza que
contiene el Ag a determinar, por ejemplo, tejidos que poseen ese Ag a estudiar. Este control
verifica que los reactivos, tiempos de incubación, etc. se han realizado correctamente.
Aunque los tejidos control utilizados dependerán de los Ag que queramos demostrar, los más
utilizados son: Amígdala, cerebro, colón, apéndice, placenta, etc.
El control negativo puede realizarse utilizando un tejido que no contenga ese Ag o bien recurrir
al mismo tejido usado en el control positivo, pero interrumpir el fenómeno inmunológico, como
por ejemplo, omitiendo el suero primario o sustituyéndolo por un tampón.
En el caso de utilizar un método IHQ indirecto se puede omitir el Ac secundario o el complejo

(ABC...). Cualquier resultado positivo en estos casos indicaría escasa especificidad del Ac, o
tinción no específica de fondo.
Otro control se podría realizar para evaluar si el procesamiento de la muestra ha sido

satisfactorio. Por ejemplo, se ha sugerido utilizar una sustancia (vimentina) que informe sobre la
calidad de la fijación por su elevada susceptibilidad. Así una tinción uniforme de la vimentina
indicaría adecuada fijación, mientras que una tinción heterogénea sería indicativo de ser
incorrecta.
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¿A qué se deberían resultados falsos positivos o falsos negativos?
En el primer caso, las causas más habituales serían una mala inhibición de las enzimas
endógenas (peroxidasa) y reacciones cruzadas con Ag similares o con sustancias como colágena,
etc.
Los casos de falsos negativos están relacionados con alteración de los Ag por excesivo calor
durante el proceso de desenmascaramiento o a la inversa, déficit en el desenmascaramiento.
El establecimiento de adecuados controles de calidad asegura la calidad en el diagnóstico.
8. MARCADORES TUMORALES.
La identificación y conocimiento del origen de los tumores malignos no sólo depende de su

ubicación, sino también de su parecido morfológico al tejido normal.
El diagnóstico anatomopatológico debe perseguir precisar el tipo y origen histológico de las

células tumorales, así como, localizar el tumor primario de esa neoplasia.
¿Por qué es tan importante conocer la estirpe celular del tumor?
Es fundamental para determinar la terapéutica a adoptar ante esa neoplasia, puesto que según su
origen, el tratamiento a seguir puede ser diferente, siendo en unos casos aconsejables la
extirpación quirúrgica y en otros, por ejemplo, el tratamiento con radioterapia o quimioterapia.
Pero en ocasiones las células neoplásicas son tan indiferenciadas que puede resultar difícil
conseguirlo. ¿De qué dispone el patólogo?
Los marcadores tumorales son productos (proteínas, enzimas, hormonas, etc.) de neoplasias
malignas y que pueden ser detectados en células o en líquidos corporales, por lo que tienen gran
utilidad diagnóstica.
¿Qué tipos de sustancias pueden ser marcadores tumorales? En realidad pueden ser
diferentes sustancias como antígenos de superficie celular, proteínas intracitoplasmáticas,
enzimas y hormonas. Podríamos establecer tres grupos diferenciados:
● Proteínas que aparecen de forma exclusiva en el proceso tumoral. Por ejemplo el

cromosoma Filadelfia de la leucemia mieloide crónica.
● Proteínas que no son específicas para un proceso tumoral, pero están relacionadas con
procesos malignos. Por ejemplo antígenos oncofetales.
● Proteínas que están presentes en algunas células de forma habitual, pero que aumenta su
concentración en procesos tumorales. Por ejemplo el antígeno prostático específico.
¿Siempre se demuestran con tinciones inmunohistoquímicas?
En el caso que nos ocupa, estos marcadores los detectamos en células o tejidos, pero ya hemos
comentado que estas sustancias pueden aparecer en líquidos biológicos.
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Aunque los marcadores tumorales séricos no son específicos, permiten diagnosticar la recidiva
del tumor tras la cirugía, es decir reaparición de la enfermedad.
En otras ocasiones es necesario realizar otros métodos, por ejemplo, para detectar o confirmar
anomalías génicas o cromosómicas asociadas a procesos tumorales se realizarán técnicas de
citogenética molecular como la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) o técnicas de PCR.
Tipos de marcadores tumorales.
Podríamos dividirlos en los siguientes grandes grupos:
-Marcadores tumorales histoquímicos: Ya que en ciertos tumores, puede ser característico los
depósitos de sustancias o pigmentos. Entre las sustancias más características encontramos:
● Depósitos de glucógeno PAS+ y diastasa +. Por ejemplo, es típico en el sarcoma de

Ewing que existan depósitos intracelulares de glucógeno.
● Sustancias mucoides como MPS neutros, glucoproteínas y mucoproteínas. Si recuerdas
ya comentamos que tenían gran utilidad en el diagnóstico de adenocarcinomas. En otras
tumoraciones pueden aparecer como inclusiones intracitoplasmáticas o nucleares.
También pueden aparecer MPS ácidos en el estroma de algunos tumores.
● Lípidos, típicos de algunos tumores como carcinoma sebáceo o carcinoma de células

renales, entre otros.
● Pigmentos: Diferentes pigmentos como la hemosiderina, indicativo de extravasación
hemática que presentan algunos tumores o melanina como marcador de melanoma,
pueden ser muy útiles en el diagnóstico.
Marcadores inmunohistoquímicos que demostrarán los antígenos de membrana, núcleo o

citoplasma celular. Todo ello será útil para conocer la histogénesis, identificar la posible
etiología, conocer en el caso de ser funcionante los productos que segrega, realizar el diagnóstico
diferencial, etc.
Marcadores ultraestructurales: En este caso nos servimos de la microscopía electrónica para

precisar la histogénesis. Pequeños detalles celulares pueden ser característicos de ciertos
procesos que facilitarán el diagnóstico. Entre ellos tenemos:
● Modificaciones del citoesqueleto, ya que algunos filamentos intermedios pueden

organizarse en formas características.
● Especializaciones de la membrana que pueden ser indicativas de ciertos procesos como
por ejemplo microvellosidades en el adenocarcinoma, etc.
● Depósitos de sustancias como glucógeno, lípidos o estructuras más especiales como
pigmento melánico, gránulos neurosecretores, etc.
● Observación de los cambios producidos en el núcleo o en los orgánulos citoplasmáticos.

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3. TRAZADORES ENZIMÁTICOS EN IHQ: TÉCNICAS CON AC

7. TÉCNICAS DE ORO COLOIDAL.

8. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO CON LAS MUESTRAS PARA

9. RECUPERACIÓN DEL AG.

10. MARCADORES TUMORALES.

Procesamiento Citológico y Tisular

Los métodos inmunohistoquímicos sirven para detectar Ag celulares o tisulares mediante la

El tipo de Ig que generalmente se utiliza en este tipo de técnicas es la IgG.

2. FUNDAMENTOS DE LAS TÉCNICAS EN INMUNOHISTOQUÍMICA.

● Técnicas de inmunofluorescencia: Utilizan fluorocromos, siendo necesario para su

● Técnicas inmunoenzimáticas: Utilizan enzimas, que posteriormente habrá que revelar.

● Metales: Oro coloidal.

Procesamiento Citológico y Tisular

3. TRAZADORES ENZIMÁTICOS EN IHQ: TÉCNICAS CON AC MARCADOS Y

Técnicas basadas en la inmunoperoxidasa: Anticuerpos marcados.

¿Qué técnicas pueden realizarse?

Estas técnicas presentan ventajas respecto a la inmunofluorescencia como:

● Presentar mayor sensibilidad debido a la capacidad de la peroxidasa de desdoblar

Por ello, en 1970, Sternberger y cols. modificaron la técnica introduciendo la utilización de

Técnicas basadas en la inmunoperoxidasa: Anticuerpos no marcados.

En esta técnica, en lugar de Ac marcados, se utilizan complejos formados por la enzima

¿Cómo se obtienen estos complejos?

Obtenida la peroxidasa del rábano picante se purifica y se inyecta al animal (generalmente el

¿Cómo se realiza la técnica?

En esta técnica se utilizan de forma sucesiva 3 reactivos inmunes:

● Un Ac primario (IgG obtenida de conejo o ratón) frente a un Ag humano.

¿Qué ventajas presenta esta técnica respecto a las anteriores?

● Se evita la pérdida de actividad de los Ac, puesto que no están marcados.

Procesamiento Citológico y Tisular

● Se incrementa la sensibilidad de la técnica, porque por cada Ac primario que se ha unido

En 1981, una nueva generación de métodos inmunohistoquímicos surgió, como la técnica de

Esta molécula, tiene cuatro lugares de unión para la biotina.

Procesamiento Citológico y Tisular

Seguirá los siguientes pasos:

● Incorporar el Ac primario sin marcar.

Tras producirse la unión deberemos revelar el lugar de unión añadiendo el sustrato y el

● Métodos poliméricos que no dependen de la biotina, ya que utilizan un polímero que

Procesamiento Citológico y Tisular

En este procedimiento se utilizan en un primer paso el antisuero primario conjugado con un

Si se realiza de forma secuencial cualquiera de los métodos anteriores y se emplean cromógenos

Leu M-1 / CD15 / Antígeno mielomonocítico

Procesamiento Citológico y Tisular

Linfoma de Hodgkin. Células de Reed-Stemberg.

5. TÉCNICAS DE ORO COLOIDAL.

La conjugación de las proteínas al oro depende de varios fenómenos físicos:

● Atracción electrostática entre la carga negativa del oro y la positiva de la proteína.

●No existe ninguna interferencia de oro endógeno.

6. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO CON LAS MUESTRAS PARA

Durante el procesamiento de la muestra, se debería no sólo preservar el Ag de la degradación o

Pero este procesamiento implica modificaciones que pueden afectar a la inmunoreactividad, la

La congelación sería el método más aconsejable para el almacenamiento de muestras y posterior

También los fijadores utilizados en microscopía electrónica como el glutaraldehído o el tetróxido

7. RECUPERACIÓN DEL AG.

Los métodos utilizados para la recuperación antigénica pueden ser variados:

Mediante digestión enzimática: Se basa en la utilización de enzimas proteolíticas.

¿Qué tipo de proteasas se pueden utilizar?

Pero los inconvenientes las superan debido a:

Procesamiento Citológico y Tisular

Para el desenmascaramiento de ciertos Ag como citoqueratinas, puede ser insuficiente un método

Independientemente del método utilizado es de gran importancia la composición y el pH de la

A continuación se exponen diferentes métodos: