Clase 6 THC Consideraciones:

DESCALCIFICACION: -Si el hueso presenta una enfermedad metabólica, en

ese caso tal vez no será necesario descalcificar. Cuando
“Remover los iones de calcio de una muestra sin dañar uno quiere estudiar alguna alteración metabólica,
otros componentes, y facilitando así el corte” relacionada a algún hueso, lo más común es que no se
haga descalcificación. El proceso que se hace en ese
-Prestar atención cuando se está cortando la muestra, y caso (el cual no lo hacen los tecnólogos) es “raspar” el
ver si en algún sector se encuentra calcificado. hueso y obtener “filetitos” de huesos los cuales se
infiltran en plásticos o resinas hipoxias, que son propias
Arteriosclerosis de del procesamiento de microscopia electrónica. Este tipo
Mönckeberg en rama de estudio no es morfológico, acá se detecta si la
de arteria uterina con cantidad de sales es propia del metabolismo del tejido o
extenso depósito de es anómala.
material cálcico en la
- Cuando se tratan de muestras duras que no se van a
túnica media
decalcificar, en esos casos el medio de inclusión ya no
es la parafina van hacer los plásticos ya que tienen un
Calcinosis pulmonar. punto de fusión distinto y van hacer más duros, tienen
Depósitos de sales de consistencia mayor.
calcio de color negro * Cuando uno fija en formalina aumenta su
en los tabiques consistencia, y debemos buscar un medio de inclusión
alveolares. Von Kossa, que sea equiparable a eso, de manera que cuando
500x cortemos sea casi homogéneo el corte, esto no se da
idealmente *
Meningioma
psamomatoso. Los Secciones descalcificadas para el uso de estudio de
grupos de células medula ósea para el diagnóstico de tumores,
tumorales presentan infecciones o cualquier otro propósito, el espécimen
en el centro algunos primero debe:
depósitos de sales de -Piezas de huesos removidas en operación (cabeza de
calcio fémur) o especímenes resultantes de una amputación
deben ser primeros diseccionados.
Al elegir una técnica y un método de procesamiento, se
debe tener en cuenta el tipo de investigación que se - Otros tejidos con decalcificación asociada (calcificación
está llevando a cabo. distrófica) que se pueden dar en pulmón, pared de
vasos sanguíneos o en el riñón, u otro lugar
Por ejemplo, si se está investigando una enfermedad (calcificación metastásica), son otras fuentes de
ósea metabólica y es necesario diferenciar el hueso calcificaciones que debemos saber tratar.
mineralizado del osteoide, o si se requieren mediciones
morfométricas, puede ser necesario retener y -Si las áreas calcificadas en las muestras de tejido son
demostrar el contenido mineral produciendo secciones sustanciales, puede ser imposible obtener secciones
de hueso "no descalcificado". decentes sin descalcificar primero la muestra.Aplique
“descalcificación de la superficie” a un bloque de
También es posible preparar muestras de hueso parafina para permitir que se obtengan secciones donde
infiltrándolas con resinas acrílicas o epoxi que, cuando no se anticipó la presencia de calcio.
se polimerizan, tienen una dureza equivalente a la del
hueso mineralizado. - Si el área calcificada de la muestra es imposible
obtener una muestra decente, ese espécimen no se va
poder estudiar. Se sugiere en ese caso una última
opción una descalcificación en superficie, es decir, no la
descalcificamos y la metemos en el procesador y en el
fijador, cuando llegue a incluirse antes de cortar la
vamos a descalcificar en bloques. (última solución
descubierta). Se dieron cuenta que cuando el calcio
entra en contacto con el ácido se ablanda la muestra, es
decir, se desgasta un poco el bloque hasta que se vea el
tejido, luego lo ponemos boca abajo sobre una placa
que contenga acido en concentración adecuada (14%).
Estructura del hueso
Cuando se tiñe el hueso, debe dar un color rosado, el
cual es gracias a la eosina, este color es un indicador
adecuado para saber si el hueso fue descalcificado.
Cuando los tejidos no han sido descalcificados son de
color basófilo, violeta, se tiñe con la hematoxilina.
Descalcificación optima:
Es saber cómo escoger un método que permita
conservar las células a estudiar.
Debo escoger un descalificador adecuado, para eliminar
las sales de calcio que están depositadas para poder
ablandar el hueso sin dañar a las células.
Cuando uno ocupa ácidos el principal defecto es su
acción sobre los ácidos nucleicos, se produce hidrolisis
de los ácidos nucleicos (se despolimerizan, se separa la
base nitrogenada de la pentosa), si yo quiero teñir luego
con H&E los núcleos casi no se verían.
Fijación del hueso
Para poder fijar hay que tener 100% descalcificado el
tejido. Obligación para poder procesar el tejido.
Los tejidos que no han alcanzado el óptimo de fijación
(están escasamente fijados), el tejido se va amanaserar,
el tejido se va re ablandado demasiado y va perder la
capacidad tintorial en el núcleo además se va a perder
parte del tejido conectivo.
En la práctica común de laboratorio, la práctica
extendida para la fijación de los huesos es lo
recomendado. Se puede fijar más de 24 horas o que
esté garantizado que ese tejido estabilizo todas sus
proteínas y tiene todo bien conservado, paso al paso de
descalcificación para que no sufra ningún daño.
La formalina tamponada es la fijación adecuada, pero si
llegara a la medula ósea sola (punciones de medula) en
ese caso se recomendaría utilizar los fijadores: Bouin,
B5, formalina zinc.
Debemos asegurarnos que el tejido este fijado
completamente, para que así el ácido solo actué sobre
las sales de calcio y no dañe nada más. Si se encuentra
bien fijado las proteínas se encontrarán estabilizadas
(puentes de metileno) por ende el ácido no podrá
actuar sobre ellas. Si se encuentra bien fijado, el ácido
solo actuara solubilizando las sales de calcio.
El exceso de descalcifican produce daño en las
muestras, especialmente en los ácidos nucleicos.
Agentes descalificadores:
Son de 3 tipos:
 Ácidos Fuertes:
Los más comunes que se utilizan son el HCL o HNO3 en
concentraciones del 10% hasta el 14%. Son de rápido
acción. El tiempo excesivo causa la perdida de tinción
nuclear y macerar el tejido (sobre todo en las partes
blandas)
La Figura 7 muestra las consecuencias de un
tratamiento prolongado con un descalcificador de ácido
mineral más allá del punto final apropiado.
  Ácidos Débiles:
Uno de ellos el ácido fórmico, se produce a partir de la
formalina cuando se oxida, es más débil y más lento que
el anterior, pero más suave en su accionar sobre los
tejidos, entonces su tinción nuclear es un poco mejor
preservada.
-El Surgipath es un descalificador comercial, usa
formalina y lo mezclan con un descalficador. Fija y
descalcifica a la vez y es más suave en su acción.
Hay algunos descalificadores que se venden con
fijadores, como mezcla.
-El ácido pícrico, único acido que actúa como sal en los
fundamentos de acción de los fijadores. Tiene entre sus
funciones ser un fijador, un descalcificador débil y
también es un colorante. Como descalcificador es
recomendable en las medulas óseas, que son pequeñas
y de cuidado. Es recomendable fijarlas en Bouin, que es
la mezcla fijadora que contiene el ácido pícrico, aunque
las torna amarrillas, pero conserva muy bien las
estructuras celulares y va estar descalcificando a la vez.
Pero existe otro, pero esta es una mezcla Método Ana
Morse, este se usa mucho en los laboratorios, porque es
mezcla de dos soluciones. Una solución que incluye
citrato de sodio en agua y otra solución que incluye
ácido fórmico en agua, al momento usar se toma una
proporción 1:1, 50 ml de uno con 50ml del otro para
formar los 100ml y con eso alcanza para descalcificar
cualquier tejido que lo requiera, lo hace de manera muy
suave y una de las ventajas que tiene es que el citrato
de sodio preserva mejor las sustancias blandas. El
citrato de sodio actúa como un neutralizador de la
acción de la acido fórmico, por ende, el ácido fórmico
actúa sobre los depósitos de calcio y el citrato de sodio
actúa como tamponando y protegiendo a las partes
blandas. Esta mezcla es la adecuada si no se encuentra
EDTA.
**¿Qué hacen los ácidos en el tejido? **
El calcio que nosotros buscamos para eliminar esta
convertido en sal, como fosfato de calcio o carbonato
de calcio, entonces esos son solubilizados por el ácido,
el ácido actúa sobre el calcio y lo va solubilizando. No
hay reacción química con el ácido y calcio, solo
solubilizacion.
 Agentes quelantes:
EDTA, captura los iones de calcio desde la superficie de
los cristales la aptita, y lentamente reduce el tamaño. Lo
hace lentamente por que el EDTA es muy selectivo con
los cationes, entonces el calcio (catión) lo va ir tomando
selectivamente, va ir sacando en uno en uno. Los va
capturando por un proceso químico que se llama
quelacion. El EDTA no participa y no ablando los tejidos
blandos, simplemente actúa sobre los iones de calcio.
Desventaja: es muy lento, ya que la quelacion puede
tomar mucho tiempo para descalcificar, por lo tanto, no
está recomendado para un tejido muy grande, un tejido
muy duro o muestras urgentes.
Está recomendada para pequeñas muestras como las
mamas, tiroides y medula ósea sobre todo cuando se va
a realizar inmunohistoquima, FISH o PCR.
Se usa en soluciones neutralizadas, generalmente a pH
7.
A pH 10 podría trabajar más rápido el EDTA, pero el
problema es que el efecto alcalino va producir más
daños a los tejidos. (daños tisulares)
Factores que influyen en la proporción de
descalcificación (en la acción de descalcificar)
- Concentración:
La concentración de agente activo afectará la velocidad
a la que se elimina el calcio.
El agente descalcificador tiene concentraciones por
protocolo. En general, no son concentraciones muy
altas y que permite ir solubilizando los ácidos. Las
concentraciones están calculadas esperando no hacer
daño en las partes blandas aun cuando el ácido es
fuerte. Apunta a disolver el calcio.
- Temperatura:
El aumento de temperatura acelerará la tasa de
descalcificación, pero también aumentará la tasa de
daño tisular, por lo que debe emplearse con mucho
cuidado. La temperatura puede acelerar las reacciones
químicas.
- Agitación:
La agitación suave puede aumentar ligeramente la
velocidad. Un factor relevante para el proceso, porque
cuando más agite la muestra o la ponga sobre un
agitador funciona más rápido o permite que los fluidos
acedan más rápido.
- Acceso del fluido:
Al igual que con la fijación, el descalcificador fresco
debería mejorar la difusión y penetración en la muestra
y facilitar la solución, ionización del calcio y remoción.
Otras técnicas para aumentar la eficiencia de la
descalcificación:
- La sonicación utilizada con EDTA se ha utilizado con
éxito (durante el proceso, la temperatura debe
controlarse cuidadosamente)
- El tratamiento con microondas se ha utilizado con
descalcificantes de ácido clorhídrico, pero la
temperatura elevada puede dañar la morfología y
provocar manchas.
El uso de microondas, aumenta la temperatura.
- Se han incorporado resinas de intercambio iónico en
algunos protocolos de descalcificación.
Las resinas de intercambio iónico son polímeros que se
utilizan en un baño de ácido que va captando.
- Descalcificación electrolítica en la que el hueso se
coloca en un descalcificador ácido y se fija a un
electrodo (el potencial de causar daño por calor a la
muestra). Es un equipo que tiene un ánodo y cátodo,
que se pone una solución de ácido se coloca el tejido
dentro y lo que va estar haciendo es extraer
selectivamente los iones de calcio hacia el ánodo, para
que después lo vaya solubilizando
Cometarios sobre tinción
La reacción de PAS, reacción química muy común, que
permite identificar todos los hidratos de carbono, los
que están presentes en las membranas basales, pared
de los hongos, en la mucosa o sustancias neutras de los
intestinos o estómago, presente en el glicógeno.
El principal método de Histoquímica que no se podría
aplicar es la identificación de calcio.
Determinación del punto final de la descalcificación:
Si se quieren obtener resultados de alta calidad, es
importante determinar el punto en el que se ha
eliminado todo el calcio, ya que, a partir de este
momento, el daño tisular parece ocurrir a un ritmo
creciente.
Dos tipos para chekear la descalcificaion:
Prueba química, que utiliza oxalato de amonio en
baño. Si la solución aun está sacando calcio va cambiar
de color azul, porque se va producir una reacción
química y se va formar oxalato de calcio. Esto determina
que aún hay calcio por ende se debe seguir
descalcificando. Este proceso es muy engorroso.
Proceso manual: consiste utilizar el tacto, tomar le
tejido en las manos y flectar el hueso o tejido, si tiene
algunos nódulos con la uña ver si se ha ablandado, uno
toma la decisión de acabar con la descalcificacion y
seguir con los demás procesos o dejarlo un tiempo más
en solución.
- Sobre descalcificación, especialmente con los
descalcificantes ácidos fuertes (formación de basófilos y
puede provocar la maceración de los elementos
tisulares más blandos).
-Por otro lado, las muestras que no estén
completamente descalcificadas pueden ser difíciles o
imposibles de seccionar.
Sustancia de prueba: (test chemical)
Se agrega solución de oxalato de amonio a una muestra
del cambio final de descalcificado que ha sido
neutralizado con hidróxido de amonio.
Si hay calcio presente, se formará un precipitado de
oxalato de calcio, lo que indica que la descalcificación
probablemente sea incompleta y que se requiera un
tiempo más prolongado de descalcificación.
- Por supuesto, esta prueba se realiza mejor con un
cambio relativamente reciente de descalcificador
(expuesto al tejido durante, digamos, solo una hora)
- Las pruebas físicas requieren manipulación. Pueden
ocurrir daños mecánicos durante la flexión.
-Durante un fin de semana, la muestra se puede quitar Equipo tipo microondas, trabaja con calor.
del descalcificador, enjuagar y volver a colocar en
formalina. Recuperación de antígenos: eliminar los puentes de
metileno para estudios inmunohistoquimicos.
Descalcificación superficial:
Este es un método para tratar pequeños depósitos de
calcio no detectados que pueden encontrarse en el
bloque de parafina.
- El bloque se puede quitar del micrótomo y colocar
boca abajo en un descalcificador ácido durante 15-60
minutos.
- El tratamiento de la superficie permitirá que el
descalcificador penetre una pequeña distancia en el
bloque y disuelva el calcio.
- A continuación, el bloque se puede enjuagar a fondo
con agua para eliminar el ácido residual, enfriar y
seccionar.
La descalcificación es un proceso sencillo, pero para
tener éxito requiere:
- Una cuidadosa evaluación preliminar de la fijación
minuciosa del espécimen. Asegurar que la fijación este
bien lograda.
- Preparación de lonchas de espesor razonable para
fijación y procesado. (laminas delgadas)
- La elección de un descalcificador adecuado con el
volumen adecuado, cambiado periódicamente. (cambio
permanente de las soluciones, porque estas se van
saturando con el calcio)
-Una cuidadosa determinación del punto final.