INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

EXAMEN N°01

ASIGNATURA BIOTECNOLOGÍA MOLÉCULAR Y CELULAR

PRESENTA
MAILYN STEPHANY PORRAS GARCIA

PRESENTADO A: Dr. BENJAMIN AYIL

CD. REYNOSA, TAMAULIPAS, MÉXICO OCTUBRE 2022.

 1. ¿Cómo se une el isótopo fósforo-32 en un bacteriófago?

En 1952 los investigadores Hershey y Chase, estos realizan la preparación de un fago

radiactivo se hizo incorporando P32 ya que el fosforo es uno de los componentes de los
ácidos nucleicos (grupo fosfato) este se fue incorporando al medio glicerol lactato en la cual
la bacteria creció durante 4 horas para luego incluir el fago, se evidenció que las DNAasas
poseían una alta sensibilidad y era constante además de que no fue expulsado de la célula; El
P32 es incorporado al ADN por fosforilación la cual se añade un grupo fosfato a aminoácidos
que tengan grupos hidroxilo. El marcaje controlado de segmentos de ADN se por la acción
de la enzima fosfatasa que corta el grupo fosfato del extremo 5´ dejando un grupo hidroxilo
disponible para marcarse.

2. Explicar la teoría endosimbiótica

Desde que en la Tierra aparecieron los primeros organismos unicelulares hasta los complejos
organismos multicelulares que vemos hoy día han pasado millones de años de evolución.
Uno de los pasos más importantes en este gran camino es la aparición de las células eucariotas
a partir de células procariotas, un proceso que ha sido explicado por la llamada teoría
endosimbiótica. Esta teoría describe el paso de las células procariotas a células eucarióticas
mediante incorporaciones simbiogenéticas de bacterias. Para formularla, Margulis se basó en
los trabajos olvidados de científicos (Schimper, Merezhkovsky y Portier) de finales del siglo
XIX y principios del XX, que relacionaban la capacidad fotosintética de los vegetales con las
cianobacterias y que proponían el origen simbiótico de los cloroplastos y de los eucariontes.

La teoría endosimbiótica propone que mitocondria y cloroplasto fueron una vez células
procariotas, que vivieron dentro de células huésped más grandes. Los procariotas podrían
haber sido inicialmente parásitos o incluso comida que escapó de algún modo de la digestión.

Independientemente de la causa por la que estas células procariota acabaron dentro de un

huésped el resultado es que entre ambos se produjo una relación endosimbiótica. Los
procariotas prisioneros podrían haber proporcionado nutrientes cruciales (en el caso del
cloroplasto primitivo) o haber ayudado a explotar oxígeno para extraer energía (en el caso de
la mitocondria primitiva). Los procariotas, a su vez, habrían recibido protección y un
ambiente estable para vivir.
Debido a que prácticamente todos los eucariotas tienen algún tipo de mitocondria, mientras
que solo los eucariotas fotosintéticos tienen cloroplastos, se ha propuesto que la
endosimbiosis ocurrió dos veces, en serie. En primer lugar, una célula huésped más grande
absorbió un procariota heterótrofo aerobio (que usa oxígeno). Con el tiempo, el procariota
evolucionó conjuntamente con el huésped, llegando a ser algo así como una mitocondria.

Margulis defiende que algunos orgánulos de las células eucarióticas proceden de células
procariotas primitivas que habrían estado en endosimbiosis con las primeras. Llegó a esta
conclusión comparando las bacterias, mitocondrias y cloroplastos y observando las
siguientes semejanzas:
• El tamaño similar de las mitocondrias y de algunas bacterias.
• Las mitocondrias presentan crestas comparables a los mesosomas.
• El parecido entre los ADN.
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• La existencia de una membrana plasmática que permite la fagocitosis.
• La síntesis proteica que realizan es autónoma.
• Los ribosomas de las mitocondrias y cloroplastos, al igual que los de las
bacterias, son 70s.
• En las mitocondrias y cloroplastos los centros de obtención de energía se
sitúan en las membranas, al igual que ocurre en las bacterias.
• Presentan similitudes en los procesos metabólicos.
• Las mitocondrias y los cloroplastos tienen autonomía en la célula pudiendo dividirse y
formar orgánulos hijos.

Lynn Margulis describe las sucesivas simbiosis hasta la aparición de células eucarióticas
como las conocemos actualmente:
La primera simbiosis se produjo al fusionarse una bacteria nadadora (del tipo de una
espiroqueta) con otra que utilizaba el azufre y el calor como fuente de energía; así se
originaría un organismo con las características de ambas que sería el primer eucarionte, con
membrana nuclear, y que se convertiría en el ancestro de todos los organismos pluricelulares.
La segunda simbiosis se realizó entre este eucarionte anaerobio y una bacteria aerobia, capaz
de realizar la respiración celular, mucho más eficiente que la fermentación; de esta forma, la
célula eucariota adquiriría la capacidad de obtener más energía a partir de la materia orgánica.
Así surgieron las células eucariotas con mitocondrias que posteriormente darían lugar a los
hongos y los animales.
La tercera simbiosis se realizó entre estos organismos aerobios y las cianobacterias, que
aportaron a la célula eucariota la capacidad de obtener energía a partir de materia inorgánica
mediante el proceso de fotosíntesis. Así surgieron las células eucariotas con cloroplastos y
mitocondrias, que darán lugar a los vegetales.

3. ¿Cuántos tipos de polimerasas existen?

Existen tres tipos de ARN polimerasa I, II y III, las ADN polimerasas se clasifican en
familias según la homología de su estructura y la secuencia de aminoácidos:

A: Incluye las ADN polimerasas eucariotas γ, θ, ν, la procariota I y la viral T7.

B: Incluye las ADN polimerasas eucariotas ζ, α, δ, ε y la procariota II. También se ha
propuesto la inclusión de algunas ADN polimerasas virales
D: Incluye la ADN polimerasa procariota D y también se ha propuesto la inclusión de
algunas ADN polimerasas virales.
X: Incluye las ADN polimerasas eucariotas β, σ, λ, μ, TDT y la procariota III.
Y: Incluye las ADN polimerasas eucariotas ι, κ, η y las procariotas IV y V.
RT: Incluye la telomerasa exclusiva de los eucariotas y las transcriptasas inversas virales,
eucariotas y procariotas.

4. Diferencias en el proceso de traducción entre procariotas y eucariotas:

En las procariotas el proceso es más simple, se traduce directamente a aminoácidos. En las

eucariotas, el proceso es más lento y por tanto más complejo; donde primero se transcribe un
ARN mensajero y se produce un proceso de maduración por el cual se obtiene el ARN
mensajero para pasar a los aminoácidos. En los procariotas no precisa maduración
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postranscripcional. En eucariotas En el locus de los genes se presentan en intrones y exones;
el proceso de transcripción se lleva a cabo en el núcleo y se da por la ARN polimerasa II; la
iniciación ocurre en la región promotora en el sentido 3´5´; la transcripción termina en una
región reguladora; la molécula de ARNm requiere de un proceso de maduración: adquiere
una cabeza 7-Metil Guanosina en el extremo 5´ y una cola Poli-A en el extremo 3´ y las
secuencias de intrones son eliminadas; el ARNm maduro sale por el poro nuclear; ARNt y el
ribosoma reconocen el ARNm por la cabeza metilada y da inicio la traducción de proteínas
por la adición de aminoácidos por los ARNt en sentido 5´3´; la traducción termina al
reconocerse la cola Poli-A. en el caso de los procariotas el ARNm se va traduciendo
conforme se va transcribiendo.

El ARNm en eucariotas debe ser transportado al citoplasma para ser traducido. En procariotas
tanto transcripción como traducción se hace en el citosol, a diferencia de las eucariotas, que
la transcripción se realiza en el núcleo y la traducción en el citosol.

En procariotas, hay un solo tipo de polimerasa. En cambio, en el ARN de las eucariotas, hay
tres polimerasas (ARNr, ARNm, ARNt). En procariotas, cada gen puede hacer varias cadenas
de aminoácidos (policistrónicos). En cambio, en las eucariotas, pasa lo contrario, un gen, una
cadena de aminoácidos (monocistrónicos).

5. Proporción 2:00 o 1:8 específicamente para ADN y ARN (Nanodrop)

Según la guía de uso de Nanodrop One de Thermo Fisher, el índice de pureza A260/A280 o
índice de absorbancia corregida a 260 nm con relación a la absorbancia corregida a 280 nm
indica: 1,8 es generalmente aceptado como “puro” en cuanto a ADN y 2,0 para ARN.

6. Interpretar gráfica de rtPCR para cuantificar ADN

Grafica 1. Cinética de amplificación de la PCR.

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En esta figura muestra la cinética de amplificación de la PCR. Durante los ciclos iniciales
de la PCR no hay cambios significativos en la intensidad de la fluorescencia emitida, por
lo que es indistinguible el ADN amplificado y el ruido basal, pero permiten fijar la línea
base. En la siguiente etapa, aumenta la cantidad del ADN amplificado y la señal fluorescente.
El punto donde se observa un sensible incremento en la fluorescencia se conoce como fase
inicial, la cual es el origen de la fase logarítmica o geométrica. Posteriormente, inicia la fase
lineal en la cual la eficiencia de amplificación no es constante. Finalmente, se llega a la
fase estacionaria donde el producto obtenido permanecerá constante, aunque se aumente el
número de ciclos

Durante la amplificación por la PCR-TR, la sonda adicionada genera una señal de

fluorescencia que refleja la cantidad de producto amplificado. La cinética de amplificación
por la PCR se puede dividir en cuatro fases: 1) inicial o basal, 2) geométrica (conocida como
logarítmica o exponencial), 3) lineal y 4) plateau o estacionaria (Figura 4, ver también
capítulo de PCR).Durante la fase inicial, entre los primeros 10-15 ciclos, la fluorescencia
es insuficiente para lograr discriminar el ruido basal. Sin embargo, como se muestra en la
Figura 4, esta fase sirve para delimitar la línea base (ver más adelante). En la fase geométrica,
los reactivos de la reacción se encuentran de forma abundante por lo que la amplificación
por la PCR tiene una eficiencia cercana al 100%. En esta fase de la cinética de amplificación,
el comportamiento del ADN es 2n, es decir, a partir de cada molécula del ADN se generan
dos, por lo que el producto de la PCR se duplica después de cada uno de los ciclos. La fase
lineal comprende el momento en que los reactivos empiezan a ser limitantes en la reacción y
se presenta un decaimiento de la actividad enzimática. La eficiencia de la amplificación es
inconstante durante esta fase. Por último, la fase estacionaria muestra una señal saturada. La
amplificación se detiene debido a que los componentes de la reacción se agotaron. En ésta,
la cantidad de producto obtenida es constante, aunque se incremente el número de ciclos,
también se muestran dos componentes importantes de la cinética de amplificación: la línea
base, la cual sirve para corregir las curvas que se obtienen de un experimento, restándose a
las curvas de amplificación, y el Ct.

Grafica 2. Curva de
amplificación. En el eje Y
se muestra la cantidad de
fluorescencia y en el eje X
los ciclos de la reacción.
La amplificación se
detecta en cada ciclo de la
reacción midiendo el
incremento de la
fluorescencia que es
proporcional al aumento
de ADN.

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 Gráfica 3.Se puede observar un único pico de amplificación que corresponde a la
curva de disociación o curva melting la especificidad de la reacción, es decir que
los amplicones que se formaron son del tamaño esperado. La línea de abajo
corresponde al control negativo, el cual no amplificó.

El Ct, del inglés cycle threshold, equivale al número de ciclos necesarios para que cada
curva alcance un umbral en la señal de fluorescencia. La comparación de los Ct entre las
muestras permite calcular la diferencia en la cantidad inicial de las moléculas del ADN o
ADNc específico que se desea evaluar, ya que mientras mayor cantidad del ADN blanco haya
en una muestra, menor el número de ciclos (Ct) que se requiere para alcanzar este umbral.
Entonces, el Ct es un valor directamente proporcional a la cantidad inicial del ADN blanco
y a partir de este valor se puede calcular la cantidad del ARNm o del ADN. El valor de Ct
puede ser asignado de manera automática por el Software del equipo median-te diferentes
algoritmos o bien se puede asignar de forma manual. Como todo valor de fluorescencia, el
Ct es un valor que puede ser afectado por características propias del equipo detector, como
los filtros utilizados, la ganancia, el tiempo de vida de la lámpara, etc., por lo que no es
posible comparar valores de Ct entre diferentes experimentos y/o equipos.
Para evaluar la cantidad del ADN de interés en cada una de las muestras, se toma en cuenta
la eficiencia de la amplificación En el caso más sencillo, la eficiencia de la amplificación es
100%, es decir, el Ct se asigna sólo durante la fase geométrica de la amplificación donde ésta
es 100% eficiente.

Grafica 4. Ct (ciclo
umbral).

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Factores que pueden influir en Ct: Ct (ciclo umbral) es la intersección entre una curva de
amplificación y una línea umbral. Es una medida relativa de la concentración de diana en la
reacción de PCR. Muchos factores afectan el valor absoluto de Ct además de la concentración
del objetivo. Los parámetros que afectan la eficiencia de PCR son: especificidad de primers
sondas, concentraciones altas de dNTPs, agentes inhibidores como hemoglobina, heparina,
IgG, altas concentraciones de proteína.

7. Cuantificación de los ácidos nucleicos

Existen 3 métodos para cuantificar:

Absorbancia UV con espectrofotómetro: la absorbancia puede ser medida a 260 nm,

pero, aunque resulte conveniente, no es una técnica muy sensible, una solución de 50 ug/ml
de dsDNA tendrá una absorbancia de 1, pero la presencia de proteínas o fenoles afectaran
el estimado y por lo tanto este método no permite revisar la integridad del ADN. Se basa
en la ley de Beer-Lambert que se trata de una relación logarítmica dependiente.

Espectrofluorometría: es otro tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la luz

emitida por moléculas fluorogénicas llamadas fluoróforos. Los fluoróforos responden
claramente a la luz en comparación con otras moléculas. Cuando un fotón de luz de
excitación es absorbido por un electrón de un fluoróforo, el nivel de energía del electrón
aumenta a un estado excitado. Durante el breve período de excitación, parte de la energía
se disipa y la energía restante se emite como un fotón para relajar el electrón de regreso al
estado fundamental. Debido a que el fotón emitido generalmente lleva menos energía y,
por lo tanto, tiene una longitud de onda más larga que el fotón de excitación, la
fluorescencia emitida se puede distinguir de la luz de excitación con un fluorómetro.

qPCR: La PCR en tiempo real (también conocida como qPCR) es una técnica que se basa
en ciclos térmicos que consisten en ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para
la fusión del ADN y la replicación enzimática de los amplicones seleccionados por la ADN
polimerasa. Después de n rondas de ciclos térmicos, se forman un total de 2n productos de
PCR. Los instrumentos de detección miden la acumulación de producto de ADN después
de cada ronda de amplificación por PCR utilizando indicadores fluorescentes. Los
indicadores pueden ser tintes como SYBR® green o sondas como TaqMan®. El ARN se
puede medir con el mismo proceso después de un paso preliminar de transcripción inversa
(RT) que lo convierte en ADNc. Los datos principales de un experimento de PCR en
tiempo real son una curva de amplificación, que muestra la señal fluorescente en unidades
fluorescentes relativas (RFU) frente al número de ciclo y representa gráficamente la
acumulación de producto amplificado. La línea base se mide temprano en el proceso de
amplificación antes de que el instrumento pueda detectar la formación del producto. A
medida que el producto se acumula, alcanza un punto en el que el instrumento puede
detectar el cambio en la señal por encima del nivel de fondo; esta es la parte exponencial
de la curva.

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 8. Esquema del ADN

Imagen 1. Esquema del ADN.

9. Empaquetamiento del ADN

El ADN consigue una elevada condensación debido a los diferentes niveles estructurales que
presenta, esto es gracias a su unión con las histonas, en esta asociación podemos distinguir
distintos niveles de empaquetamiento:

En el Primer nivel de empaquetamiento o fibra de cromatina de 100 Å. Es conocido como

"collar de perlas". Está constituida por la fibra de ADN de 20 Å (doble hélice) asociada a
histonas, las cuales son proteínas básicas de baja masa molecular. Este collar de perlas se
encuentra en el núcleo durante la interfase del ciclo celular de todas las células eucariotas.
Estructuralmente esta fibra de cromatina está constituida por una sucesión de nucleosomas.
Cada uno de estos está formado por un octámero de histonas y por una fibra de ADN de 200
pares de bases de longitud. El ADN que hay entre un octámero y el siguiente se denomina
ADN espaciador.
En el Segundo nivel de empaquetamiento o fibra de cromatina de 300 Å. Se le conoce como
"solenoide". Se forma por el enrollamiento sobre sí misma de la fibra de cromatina de 100 Å
condensada. En cada vuelta hay seis nucleosomas y seis histonas que se agrupan entre sí y

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constituyen el eje central de la fibra de 300 Å. Durante la interfase, en el núcleo se encuentra
la mayor parte de la cromatina, la eucromatina, en forma de fibras de 100 Å. En cambio, en
los cromosomas, el nivel más bajo de empaquetamiento es de la fibra de 300 Å.
Y en el tercer nivel de empaquetamiento. La fibra de 300 Å forma una serie de bucles,
denominados dominios estructurales en forma de bucle, de entre 20000 y 70000 pares de
bases. Estos bucles quedan estabilizados por un andamio proteico o armazón nuclear. Muchas
veces se encuentran enrollados sobre sí mismos formando prominencias de unos 600 Å de
grosor.

En los Niveles superiores de empaquetamiento. La fibra de 300 Å tan solo consigue reducir
la longitud de la fibra de ADN de 20 Å entre unas 35 o 40 veces. En cambio, el grado de
empaquetamiento en la fase de división es de entre 100 y 1000 veces, y en los cromosomas
es de casi 10000.

10. Cómo actúa el mecanismo de inflorescencia para la medición de ácidos nucleicos

con SYBR-green y sondas taqman.

El monitoreo de los productos amplificados conforme transcurre la reacción es un paso

importante en la PCR en tiempo real, para ello la estrategia tecnológica que ha dado buenos
resultados es los sistema basados en reporteros fluorescentes. En general, estos sistemas
pueden ser clasificados en dos métodos diferentes: específicos y no específicos.

Los métodos no específicos se basan en el uso de moléculas intercalantes que tienen afinidad
por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal fluorescente. La
fluorescencia emitida es capturada en la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional
al número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El reportero
más usado para estos fines se llama SYBR Green la cual es una molécula cargada
positivamente que, mientras esté en solución sin unirse al ADN de doble cadena,
prácticamente no emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une al surco menor del ADN
incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia. Aunque el SBYR Green es uno de los
reporteros fluorescentes más utilizados por los investigadores debido a su bajo costo, la
principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble cadena,
incluyendo dímeros de primers. Muchos laboratorios, para evitar esta situación, optimizan
sus reacciones realizando una «curva melting» o «curva de disociación» al final de la
reacción, cuya función es la de evaluar si se formó un producto único o si hay presencia de
dímeros de primers. Hoy en día la mayoría de los software de los termocicladores ofrecen
esta función que es fácil de aplicar y analizar.

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 Grafica 5. Método no
específico. Cuando el
SYBR Green está unido
al ADN de doble cadena,
es excitado a una
longitud de onda de 480
nm, mientras que la
longitud de onda de
emisión corresponde a
520 nm.

Los métodos específicos parten de principios distintos a diferencia de los no específicos y

tienen en común la señal de fluorescencia emitida para detectar los productos amplificados.
Estos métodos siguen el principio conocido como «transferencia de energía de resonancia
fluorescente» (FRET, por sus siglas en inglés) para generar la señal; este método consiste en
transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o «quencher». Para
ello, existen dos métodos específicos, éstos son: pruebas basadas en hidrólisis y por
hibridación. Los primeros se basan en sondas fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados
con un reportero fluorescente y un «quencher», ambos se encuentran en estrecha unión
mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando hibrida, ocurren cambios
conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite que la actividad exonucleasa
5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión, logrando que la fluorescencia emitida por el
reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos métodos son muy seguros, ya que
mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no habrá amplificación y tampoco señal de
fluorescencia; es por eso por lo que la especificidad es muy alta. Un ejemplo de estos sistemas
son las sondas comerciales conocidas como TaqMan, aunque existen otras en el mercado.

Grafica 6. Método
específico mediante la
utilización de las sondas
Taqman.

Cualquiera de los métodos que se utilicen para detectar los productos amplificados en cada
ciclo de la reacción necesita de la tecnología incluida en los termocicladores de PCR en
tiempo real para: a) excitar al reportero, b) capturar la señal de emisión del mismo y c) realizar
el análisis cuantitativo. En el mercado existen diferentes tipos de termocicladores para esta

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finalidad, cuyas diferencias principales son la fuente de energía que utilizan para la excitación.
En general son tres las fuentes: las lámparas de luz, diodos de emisión de luz (LED, por sus
siglas en inglés) y láseres. Cualquiera que sea la fuente, primero el reportero es excitado y su
señal de emisión colectada a través de un filtro que permite el paso de la longitud de onda
correspondiente que llega hasta un fotodetector que captura la información proveniente de la
muestra para su análisis en el software del equipo. Otros rasgos característicos son las
velocidades para incrementar o disminuir las temperaturas en cada etapa de la reacción, el
número de muestras que puede soportar, los consumibles para la reacción y los kits que se
utilizan para la amplificación; en algunos casos sólo se usan reactivos del proveedor del
termociclador, es decir, son sistemas cerrados y en otros casos, se pueden utilizar reactivos
de diferentes proveedores, es decir, son sistemas abiertos.

11. Métodos de cuantificación

Los métodos comunes utilizados para la cuantificación del ARN y el ADN incluyen la
absorbancia, la fluorescencia y la qPCR. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas, y
la elección del método depende de la necesidad experimental y del ensayo:

La absorbancia: es rápido, sencillo, no requiere ningún reactivo, pero posee una

sensibilidad de gama baja limitada, imprecisiones introducidas por contaminantes y no
puede distinguir entre especies de ácido nucleico.

Fluorescencia: también es rápido, sencillo, altamente sensible para muestras de bajo nivel,
los contaminantes tienen un efecto mínimo en los resultados, detección preferencial de
especies de ácidos nucleicos, pero requiere calibración con estándar no es específico de
secuencia, no mide la amplificabilidad.

PCR en tiempo real: posee sensibilidad en el rango de picogramos, capacidad para diseñar
en especificidad de secuencia, mide la amplificabilidad sin embargo requiere calibración
con estándares, requiere reactivos costosos e instrumentación avanzada, configuración de
ensayos que requiere mucho tiempo y que puede necesitar trabajo de optimización.

12. Técnicas de hibridación

Técnicas de hibridación
Entre las técnicas de hibridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot,
Slot/ Dot blot e hibridación in situ.

Southern blot: La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin Southern y es una
estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción. Esta
técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos
en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos.
Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de
las cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas
complementarias. Este fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.

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En este procedimiento, primero se aísla el ADN de cualquier célula del organismo excepto
de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un paciente, el
ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la extracción puede hacerse también de
otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades coriónicas o
cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción
y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su
carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que
se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se
mencionó, las muestras se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN
tienen carga negativa (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia
el electrodo positivo, y los fragmentos más pequeños migran más rápidamente.

Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de
etidio. En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el fragmento de
interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción.
Posteriormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso
químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se
transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Existen
diferentes métodos para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la
electrotransferencia. Es importante señalar que la finalidad de la transferencia es crear una
réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una
membrana. Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones de fragmentos,
se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo,
“radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa
y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará,
proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará
mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda
corresponderá únicamente al fragmento de interés.

Grafica 7. Esquema del método de hibridación Southern blot.

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Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con 32P) o enzimáticamente
(biotina, digoxigenina, etc.). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez
marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es
más corto (para 32P, de 15 días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las radiactivas detectan
hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse
en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede utilizarse la
enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5’
de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos marcados en
el extremo 3’ de la sonda).

Northen blot: Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza ARN en
lugar de ADN. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de
restricción, ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren
su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, como son
la electroforesis, la desnaturalización (aunque el ARN es de cadena sencilla, puede formar
estructuras secundarias), la transferencia y la hibridación con una sonda.
Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica
(ARNm) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la
abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar
condiciones clínicas normales o patológicas.

Dot/slot blot: Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican
directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular; es decir, no se realiza
electroforesis. La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede
tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot). Es posible realizar detecciones no sólo
cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón
diluciones seriadas de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando.
Esquema de la visualización del dot blot y slot blot. El tipo de soporte que se utiliza durante
el proceso de fijación de los ácidos nucleicos en una membrana o filtro es lo que determina
la forma en que se visualiza esta técnica molecular. A) Soporte que se utiliza para realizar un
dot blot, donde los orificios están en forma de puntos. B) Soporte que se utiliza para realizar
un slot blot, donde los orificios se encuentran en forma de líneas.

Grafica 7.
Esquema del
método de
hibridación
Dot/slot blot.

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Hibridación in situ: Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la
misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Los
principios de ambos métodos son semejantes y el resultado final es el mismo: la
identificación de componentes tisulares que pueden observarse al microscopio. La
especificidad de la inmunohistoquímica se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras
que la especificidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una
secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot
y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino
que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; de ahí el
nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ
pueden ser radiactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes son las marcadas
con fluorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de
fluorocromos o con biotina, ya que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que
ocurre con las modalidades radiactivas.

La aplicaciones de la hibridación in situ tiene un alto grado de resolución, que permite la

localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar
translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes
(ARNm) a nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones son la identificación de
infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico.

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