Laboratorio de Química Orgánica I

Práctica 10 (Parte B)
Métodos físicos que utilizan la naturaleza polar del adsorbente y
del eluente para separar compuestos cromatografía en columna y
capa fina
Anette Bazán Villanueva 177856
Cinthya Nohemí Rodríguez Hernández 177287
Luis Enrique Infante Castañeda 176823
Valeria Nava Sanchez 176838

Primavera 2023

24 de abril de 2023
Introducción
La polaridad se refiere a la distribución desigual de los electrones en una
molécula, lo que resulta en la formación de polos eléctricamente cargados en la
misma. Este fenómeno está determinado por la electronegatividad de los átomos
que componen el compuesto y su geometría molecular. En el campo de la química
orgánica, esta propiedad es de gran importancia, ya que afecta a muchas
propiedades físicas y químicas de las sustancias, como su solubilidad en agua,
capacidad para formar enlaces de hidrógeno, acidez o basicidad, y reactividad
química. (Brown et al., 2017).
Existen varios métodos basados en el uso de los métodos descritos
anteriormente para separar compuestos orgánicos, uno de los cuales es la
cromatografía, técnica utilizada para separar y purificar componentes en mezclas.
Se utiliza para separar componentes en función de las diferencias en las
propiedades moleculares, no solo de polaridad, sino también de solubilidad y
afinidad (Sharma, 2011).
En esta técnica, la fase móvil es un solvente que fluye a través de la fase
estacionaria, que es la sustancia inmovilizada que aparece en la columna e
interactúa con los componentes de la muestra a separar. Según el tipo de
cromatografía, las fases móvil y estacionaria son diferentes; por ejemplo, en
cromatografía líquida la fase móvil es un líquido y la fase estacionaria puede ser un
gel o una resina, mientras que en la cromatografía de gases la fase móvil es un gas
y la fase estacionaria es una banda adsorbente con materiales de capa fina. (Harris,
2010).
Existen algunas variantes de esta práctica. En este reporte, se abordarán
dos: cromatografía en columna y en capa fina. La primera es una técnica de
separación en la que una muestra se separa mediante la interacción con una fase
estacionaria dentro de una columna cromatográfica; la columna es un tubo cilíndrico
que contiene una fase estacionaria, que puede ser un material adsorbente, un gel
de filtración o una fase líquida inmovilizada, dependiendo del tipo de cromatografía
en columna que se esté realizando (Gomis, 2008). En la segunda, por otro lado, lo
que se va a analizar es separado en una capa delgada de material adsorbente, que
está adherida a una superficie plana, como una placa de vidrio, plástico o aluminio.
El líquido se aplica en forma de una pequeña mancha o banda en la parte inferior de
la placa, colocándose en una cámara cerrada junto con un disolvente que asciende
por la capa adsorbente por acción capilar. A medida que el disolvente se mueve a
través de la capa fina, se produce la separación de los componentes de la muestra
en función de sus diferencias en afinidad con el adsorbente y el disolvente (Snyder
et al. 2010).
Objetivos

➔ Comprender los efectos de la polaridad y apolaridad en la separación de

compuestos mediante la cromatografía en papel.

Cuestionario Prelaboratorio

1. Describa los procedimientos húmedo y seco para el relleno de una columna

cromatográfica.

En el procedimiento húmedo la fase estacionaria se deposita, formando una

capa delgada, sobre un material de soporte tal como placas de vidrio o
aluminio. La fase móvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad, produciéndo la separación de los componentes de la muestra en
base a su diferente distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria, de
forma análoga (Universidad Pablo de Olavide, 2020)

En el procedimiento seco, se llena una columna de vidrio con una fase

estacionaria (generalmente gel de sílice), y se coloca la mezcla de
compuestos en la parte superior. Luego, la fase móvil (solvente) pasa por la
columna de arriba hacia abajo. Y la velocidad en la que cada compuesto baja
por la columna depende de su atracción relativa por las fases estacionaria y
móvil (Khan Academy Español, 2020)

2. Defina estos términos en cromatografía:

- Elución: proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria. (Araceli et
al., 2010)
- Filtración: técnica que permite separar moléculas en función de su
tamaño molecular. (Luis et al., n.d.)
- Adsorción: es la retención de una especie química por parte de una
masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a
reaccionar químicamente con la misma. (Araceli et al., 2010)
- Adsorbente: fase estacionaria en la cromatografía de adsorción y de
reparto. (Araceli et al., 2010)
 - Coadyuvante de filtración: son sólidos que se introducen al filtro junto al
fluido a filtrar. Ayudan a mantener la permeabilidad del lecho de
filtración al mismo tiempo que retienen los sólidos en suspensión del
fluido que se filtra. (Fantacchiotti, T., n.d.)
- Fluorescencia: es la propiedad de algunos átomos y moléculas de
absorber luz a una longitud de onda determinada, seguido por la
emisión de luz de corta duración a una longitud de onda más larga.
(Molecular Devices, 2019)
- Resina: material sólido o líquido, que se utiliza en la cromatografía para
separar los componentes de una mezcla. (Araceli et al., 2010)

3. ¿Cuáles serán los resultados de los siguientes errores al realizar una

cromatografía en papel o en capa fina?:
- Aplicación de una muestra muy grande: Podría expresarse como un
resultado muy parecido entre sustancias, donde la separación no será
eficiente.
- Disolvente de gran polaridad: La sustancia se desplazaría demasiado
del origen por lo que el resultado se vería afectado en el cálculo.
- Colocar demasiado disolvente en la cámara de cromatografía: La
sustancia podría disolverse en el mismo eluyente impidiendo que se
lleve a cabo una cromatografía correcta.
- Que el disolvente sobrepase el límite: Puede ocurrir una difusión lateral,
lo que da lugar a separaciones incompletas de componentes.

Desarrollo

a. Procedimiento
b. Observaciones

Se inició la práctica realizando la cromatografía en

columna. Para esto, primero se tapó la pipeta
pasteur con un poco de algodón, luego se añadió
sílica gel hasta cubrir aproximadamente 6cm de la
Figura 1.
pipeta y se humedeció agregando etanol; Muestra
posteriormente, se utilizada en
cromatografía
preparó una muestra
en columna
con fluoresceína y azul
de metileno en cantidades muy pequeñas en 1
ml de etanol (fig. 1). La muestra fue luego
colocada en la pipeta buscando que solo
abarcara una altura de 5 mm sobre la sílica (fig.
2). Durante este procedimiento se mantuvo la
sílica siempre humedecida con etanol para evitar
el agrietamiento
(aunque el etanol
Figura 2. utilizado fue
Sistema de
cromatografía en contaminado en el
columna laboratorio con azul
de metileno no
parece haber tenido repercusiones graves en los
resultados observados).
 Procedimiento y
productos de la
cromatografía en
columna

Al tener la muestra lista en la pipeta, se agregó etanol hasta observar que la

fase color amarilla de la muestra había salido por recolectada por completo
en un vaso de precipitado de 20 ml. En ese momento se cambió de etanol a
agua y con ella se realizó la salida de la fase azul, la cual fue recolectada en
otro vaso de precipitado (fig. 3). Al colocar los disolventes se utilizó la tetina
para pipeta pasteur como ayuda para lograr bajar las fases y sus disolventes.

Después se realizaron los procedimientos para la cromatografía en capa fina.

Para esto se cortaron placas de 2x6 cm y se
prepararon las siguientes tres muestras: la
primera con azul de metileno y naranja de metilo
en 2.5 ml de etanol, la segunda con naranja de
metilo en 1 ml de etanol, y la última con azul de
metileno en 1 ml de etanol.

Figura 4. Placas En cada placa se trazó una línea con lápiz a un

de cromatografía
centímetro del borde inferior, sobre ella se
en capa fina en
cámara de colocaron las muestras, una para cada placa, y
cromatografía
luego éstas fueron colocadas en la cámara de
cromatografía (fig. 4). Antes de que el disolvente
llegara al borde superior, las placas fueron retiradas de la cámara y en ellas
se midieron las distancias recorridas por las muestras y por los disolventes
(fig. 5).

Figura 5. Resultados de
cromatografía en capa fina.

c. Resultados
 ➔ Describa los resultados obtenidos.

Para cromatografía en columna se separaron dos colores de la muestra:

amarillo y azul, el amarillo bajó con etanol mientras que el azul con agua
destilada.

Para cromatografía en capa fina se obtuvieron los siguientes resultados:

1. Muestra de azul de metileno y naranja de metilo: El disolvente y el

color amarillo recorrieron 3 cm mientras que el color azul solo 1 cm.
Entre estos colores se presentó también una mancha color verde al
centímetro 1.5.
2. Muestra de naranja de metilo: Tanto el disolvente como el pigmento
amarillo recorrieron 3 cm.
3. Muestra de azul de metileno: El disolvente recorrió 3 cm y el pigmento
azul 1.7.

d. Informe de trabajo

➔ Los resultados de la cromatografía en columna pueden expresarse a

forma de tabla de la siguiente manera:

Muestra (Mezcla de) Eluente Orden de Color

separación observado

Fluoresceína Etanol 1 Amarillo

Azul de metileno Agua destilada 2 Azul

➔ Cálculos del Rf de cada marcador (Cromatografía en capa fina).

Para obtener el Rf de cada pigmento es necesario seguir la fórmula, esta

requiere de la división de la distancia recorrida por la muestra entre la
distancia recorrida por el disolvente.

Para muestra 1 : 3 cm 1 cm
Amarillo: =1 Azul: =0.33
3 cm 3 cm
 1.7 cm
Azul: =0.56
3 cm
Para muestra 2:

3 cm Para muestra 3:
Amarillo: =1
3 cm

Así, los resultados son visibles en la siguiente tabla:

Color de Componente
Componentes Referencia
# las Imagen afín al eluente
separados frontal (Rf)
manchas (etanol)

Naranja de metilo Amarillo 1

Naranja de
1
metilo
Azul de metileno Azul 0.33

Naranja de
2 Naranja de metilo Amarillo 1
metilo

3 Azul de metileno Azul 0.56 N/A

e. Discusión de resultados

Para la cromatografía en columna fue posible comparar las polaridades de

acuerdo al orden en el que se extrajeron los productos, pues debido a que en
este tipo de cromatografía los absorbentes retienen a los productos más
polares debido a sus centros polares activos, es certero afirmar que el azul
de metileno es un compuesto más polar que la fluoresceína, pues esta última
fue visible en su coloración amarilla como la primera fase en bajar por la
pipeta pasteur.

Por otro lado, en las cromatografías en capa fina fue posible comparar la
polaridad entre el azul de metileno y el naranja de metilo, así fue posible
 encontrar que el producto de mayor polaridad es el naranja de metilo; esto de
acuerdo a su referencial frontal (más alto que el obtenido por el azul de
metileno) y visible en la afinidad de este compuesto hacia el eluyente polar
utilizado: etanol.

Asimismo, fue posible comprobar el estado de pureza de dos muestras. En

esta parte, es posible observar en las cromatografías manchas azules
aleatoriamente repartidas a través de la placa, esto más que a la
contaminación de la muestra se adjudica a la contaminación previa del etanol
con azul de metileno, y ya que es posible explicar estas anomalías, se
considera exitoso confirmar a través de la cromatografía en capa fina que las
muestras 2 y 3 efectivamente corresponden a muestras puras.

Cuestionario Post laboratorio

1. Dé ejemplos de aplicaciones de este tipo de cromatografía en columna y en

placa.

Capa fina: Industria farmacéutica (Separación y cuantificación de

ingredientes), industria de alimentos (cuantificación de colorantes,
conservadores y vitaminas), cuantificación de pureza en materias primas.

Columna: Limpieza de sustancias, niveles de pureza, separación física de

componentes para estudios de calidad.

(Egon Stahl, Klaus Maier, Dieter Hadorn. Chromatography. 5ta ed. Springer-
Verlag Berlin Heidelberg; 2014)

2. ¿Por qué no se puede medir el Rf en los compuestos separados en la

columna?

En la cromatografía en columna, el tiempo de retención (tr) es el parámetro

más utilizado para cuantificar la separación de los compuestos. El tiempo de
retención se refiere al tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna,
y se puede medir experimentalmente. Además, otros parámetros como la
resolución, el número de platos teóricos y el ancho del pico también se
utilizan para evaluar la eficacia de la separación cromatográfica.(Skoog, D.
A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. 2017)
 Por lo tanto, al no tener un trozo de papel en donde se pueda ver el
movimiento de las muestras, es imposible obtener los datos necesarios para
la medición del Rf, que necesita justamente la distancia en centímetros de la
distancia recorrida de la muestra y el disolvente Skoog, ( D. A., Holler, F. J., &
Crouch, S. R. 2017)

3. Proporcione la estructura y características de los compuestos utilizados en

ambas técnicas.

Naranja de metilo:C14H14N3O3SNa

El naranja de metilo es soluble en agua y se utiliza comúnmente como

indicador ácido-base debido a que cambia de color según el pH del medio.
En soluciones ácidas, es de color rojo-anaranjado, mientras que en
soluciones básicas, es amarillo brillante.Brock, T. D. (1985).

Fluoresceína: C20H12O5

La fluoresceína es un colorante orgánico fluorescente que es muy útil en la

detección de metales alcalinos y alcalinotérreos. Es insoluble en agua, pero
se puede disolver en solventes orgánicos como el alcohol y el éter. En
solución acuosa, la floresceína es de color verde amarillento brillante.Chang,
R. (2010)
 Azul de metileno:C16H18ClN3S.

El azul de metileno es un colorante orgánico de tipo tiazida, es decir, contiene

un anillo tiazina en su estructura química. Es soluble en agua y se utiliza
comúnmente como indicador de pH y como colorante en la tinción de
muestras biológicas. En soluciones ácidas, es de color rojo-violeta, mientras
que en soluciones básicas, es de color azul oscuro. (Murray, R. K., Bender,
D. A., Botham, K. M., Kennelly, P. J., Rodwell, V. W., & Weil, P. A.2019)

4. Suponga que en un ensayo de cromatografía en columna utilizó carbonato de

calcio como Fase estacionaria y cloroformo como disolvente, pero no se
obtuvieron los resultados deseados ¿Qué se podría hacer para conseguir
mejores resultados en los ensayos siguientes?, es decir ¿Qué cambios
podrían resultar satisfactorios en el disolvente y/o adsorbente?

Las polaridades, por ejemplo. Deben buscarse disolventes que coincidan con
la polaridad del adsorbente, para que funcione correctamente la
cromatografía. Además, debe revisarse que no exceda de espacio los
componentes dentro de la columna, que no se seque, que se administre
correctamente el disolvente, y no hacerlo muy rápido.(Harris, 2007).

Conclusiones

En conclusión, se puede afirmar que la práctica pudo realizarse sin

contratiempos ni alteraciones mayores, existiendo coherencia entre lo reportado
aquí con lo mostrado en la literatura química. Se pudo corroborar la alta polaridad
que posee el naranja de metilo al ser más polar que el azul de metileno y, por ende,
que la fluoresceína. No está por más recalcar que la pureza de lo analizado no fue
total; se debe recordar que el alcohol etílico fue expuesto a, posiblemente, azul de
metileno. Incluso con ello, para los propósitos de esta prueba no hubo ninguna
alteración importante. Para finalizar, se puede mencionar que el equipo realizó un
trabajo preciso al seguir plenamente lo mencionado por el manual; es seguro que no
se tendrán inconvenientes para futuros laboratorios y proyectos de investigación.

Bibliografía

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Nava, S. (2023). Figura 1.Muestra utilizada en cromatografía en columna.

Autoría propia [Fotografía]. Tomada dentro de las instalaciones del
laboratorio de química orgánica.

Nava, S. (2023). Figura 2. Sistema de cromatografía en columna. Autoría propia

[Fotografía]. Tomada dentro de las instalaciones del laboratorio de química
orgánica

Nava, S. (2023). Figura 3. Procedimiento y productos de la cromatografía en

columna. Autoría propia [Fotografía]. Tomada dentro de las instalaciones del
laboratorio de química orgánica.

Nava, S. (2023). Figura 4. Placas de cromatografía en capa fina en cámara de

cromatografía. Autoría propia [Fotografía]. Tomada dentro de las
instalaciones del laboratorio de química orgánica.

Nava, S. (2023). Figura 5. Resultados de cromatografía en capa fina. Autoría propia

[Fotografía]. Tomada dentro de las instalaciones del laboratorio de química
orgánica.

Pavia, et al. (2021). Introducción a la espectroscopia. (5ta ed.). Cengage Learning.

Sharma, R. K. (2011). Chromatography: Basics, Types and Applications. John Wiley

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Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principios de análisis

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Skoog, et al. (2017). Fundamentals of analytical chemistry. Cengage Learning.

Snyder, et al. (2010). Introduction to Modern Liquid Chromatography. John Wiley &
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Universidad Pablo de Olavide (2020). PRÁCTICA 10: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

DE ADSORCIÓN EN COLUMNA (CC) Y CAPA FINA (TLC) 1.
INTRODUCCIÓN
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/curso0405/
practica10.pdf