Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia

Análisis Instrumental 2

DOCENTE Dra. TATIANA ZAMORA ZAMORA

PRACTICA # Cromatografía de líquidos: Partes, funcionamiento-Manejo del Cromatógrafo de

9-10 líquidos, preparación de fase móvil y gradientes

NOMBRE

SEMESTRE VI CURSO: G3 SUBGRUPO A CICLO II FECHA 14/01/2023

OBJETIVOS:

INSTRUCCIONES O CONSIDERACIONES PREVIAS:

LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Las razones
de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero, sobre todo,
su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para
la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas. Con el objetivo de alcanzar flujos razonables con
rellenos de tamaño de partícula de entre 3 y 10 μm, que por otra parte son comunes en la cromatografía de
líquidos moderna, se requieren presiones de bombeo de varios cientos de atmosferas. Debido a estas
presiones elevadas, el equipo necesario para la cromatografía de líquidos de alta resolución tiende a ser más
complejo y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. (Skoog, D. A, 2008)
Como su nombre indica, en la cromatografía
líquida la fase móvil es un líquido, El gran poder
de la cromatografía líquida reside en la
combinación de un amplio intervalo de posibles
propiedades para la fase móvil, junto con la
elección de numerosos tipos de fases
estacionarias, significativamente diferentes, así como una amplia variedad de detectores.

Cromatografía de fase normal: fase estacionaria polar, cuanto más polar es el

disolvente, más fuerza eluyente tiene
Cromatografía de fase inversa: fase estacionaria no polar, cuanto menos polar es el
disolvente, más fuerza eluyente tiene.

APLICACIONES

Esta técnica está indicada para la separación de compuestos orgánicos semivolátiles.

Hidrocarburos Poliaromáticos (PAHs), Aminoácidos: OTA, Ácido Fólico, Herbicidas, Vitaminas,
Acido tenuazónico, Formaldehído…etc.

 Rango de trabajo para muestras líquidas: µg L-1 - mg L-1

 Rango de trabajo para muestras sólidas: µg Kg-1 - µg g-1

INSTRUMENTOS USADOS EN CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA

RESOLUCIÓN

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre
3 y 10 µm, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de líquidos, se requieren
presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas
elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que
se utiliza en otros tipos de cromatografía.

Sistemas de bombeo.
 Se denomina bomba cromatográfica al dispositivo capaz de proporcionar a la fase móvil la
presión necesaria para atravesar, al flujo seleccionado,
la columna y el resto del sistema. Son en su mayoría de
flujo constante, y operan a la presión que sistema
cromatográfico y columna determinan. En particular, se
suelen utilizar generalmente bombas de pistón y solo en
algunos casos bombas de jeringa. (Moscoso Gama, J.
M. 2020)

Sistemas de inyección de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la

reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el
ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes
que se emplean han de ser muy pequeños, de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500 µL.
Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. En cromatografía de
líquidos el método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles de
muestra, como el que se muestra en la Figura 4.4. Estos dispositivos están normalmente integrados
en el equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de
muestra desde 5 a 500 µL. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de
hasta 500 kg/cm2 con una precisión relativa de unas décimas por ciento. También existen válvulas
de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 µL.

Columnas analíticas

La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm.
Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más
columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las
partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm.

Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de

diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 µm. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000
platos/metro. También, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las
cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener
diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 µm. A menudo
su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la
ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente. La última propiedad es de considerable
importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos
son muy caros.

Precolumnas.

Por lo regular, paraaumentar la vida de la columna analítica, se coloca una precolumna que
elimina no solo la materia en suspensión y los contaminantes de los solventes, sino también los
componentes de la muestraque se unen de manera irreversible a la fase estacionaria.La composición
del relleno de la precolumna debería ser semejante al de la columna analítica, pero el tamaño de
partícula es mayor para minimizar la caída de presión. Cuandola precolumna ya se contamino, se
vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por una nueva del mismo tipo. Por tanto,se le sacrifica
para proteger a la columna analítica que es más cara. (Skoog, D. A. West, D. M. y F. James, H.
1997)

Tipos de bombas

Bombas reciprocantes

Por lo regular, este tipo debombas consiste en una pequeña cámara en la que el solvente es
impulsado por elmovimiento de vaiven de un pistón accionado mediante un motor.
Bombas de desplazamiento
Por lo general, las bombas de desplazamiento consisten en unas grandes cámaras similares a las
de una jeringa, equipadas con un embolo que se activa por medio de un mecanismo de tornillo
accionado mediante un motor de etapas. . (Skoog, D. A, 2008)
Tipos de detectores

En cromatografía de líquidos de alta resolución no existe un sistema detector universal de alta

sensibilidad, como los que se utilizan en cromatografía de gases. Así pues, el sistema de detección
usado depende de la naturaleza de la muestra. Los detectores más generalizados en cromatografía de
líquidos están basados en la absorción de la radiación ultravioleta/visible. Se encuentran en el
comercio tanto fotómetros como espectrofotómetros diseñados específicamente para adaptarlos a
columnas cromatográficas. Los primeros utilizan con frecuencia las rayas 254 y 280 nm de una
fuente de mercurio, porque muchos grupos funcionales orgánicos absorben en esta región (apartado
22.1.1). Una lámpara de deuterio o de filamento de wolframio con filtros de interferencia también
suministra un medio sencillo para detectar especies absorbentes. Algunos instrumentos modernos
están equipados con discos de filtros. Girando el disco se consigue insertar el filtro adecuado en el
camino óptico de una forma cómoda. Los detectores espectrofotométricos son mucho más versátiles
que los fotómetros, y también son muy usados en instrumentos de alta resolución. Otro detector que
ha encontrado una gran aplicación se basa en la medida del cambio de índice de refracción del
disolvente que determina la presencia de moléculas de analito. A diferencia de la mayoría de los
detectores, el detector de índice de refracción es más bien general que selectivo, y responde a todos
los solutos. La desventaja de este detector es que tiene una sensibilidad algo limitada. (Skoog, D. A.
West, D. M. y F. James, H. 1997)

Reactivos

 Metanol (grado HPLC)

 KH2PO4 (calidad reactivo)
 Acetonitrilo (grado HPLC)
 Ácido Trifluoroacético
Materiales

 Columna C18 (150 x 4.6 mm x 5 um)

Equipos
 Cromatógrafo de líquidos
 Detector UV Detector
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

RESULTADOS OBTENIDOS
1. INDICAR LOS VALORES DE PKA Y PKB DE LOS ANALITOS INDICADOS EN
EL MANUAL DE PRÁCTICA CON RELACIÓN AL ARTÍCULO DE REFERENCIA.

p Ka p Kb
COMPUESTO
URACIL 9,45 4,55
ÁCIDO BENZOICO 4,2 9,8
ÁCIDO SÓRBICO 4,76 9,24
TOLMETIN 3,5 10,5
NAPROXIN 4,15 9,85
FENOPROFEN 4,5 9,5
 DIFLUNISAL 3 11
INDOMETACIN 4,42 9,58
IBUPROFEN 4,45 9,55
2. INDICAR LOS MODIFICADORES DE PH DESTACADOS EN EL ARTÍCULO DE
REFERENCIA.

Ácidos trifluoroacético (TFA

Ácido acético (HAC)

3. GRAFICAR LAS CONDICIONES DE FASE MÓVIL CON GRADIENTE DE

ELUCIÓN CORRESPONDIENTE A LA FIGURA 3 DEL ARTÍCULO DE
REFERENCIA

T %A %B

0 65 35

8 65 35

12 35 65

15 35 65

17 65 35

19 65 35

GRADIENTE CROMATOGRAFICO
65 65 65 65 65 65
% Eluyente

60

35 35 35 35 35 35
40

20

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (min)

%A %B

Indicar la influencia que tiene el porcentaje de modificador ácido en el ajuste de pH

y la separación cromatográfica:
El pH también juega una parte sustancial en la separación, puesto que, en diversos casos,
este parámetro es el que controlará el grado de ionización del soluto, modificando su
 equilibrio de hidrólisis en el eluyente.
pH = pK + log (forma ionizada/forma no ionizada)

En estos casos, como norma general, el pH del tampón de elución debe ser de una a dos
unidades inferior al pKb de las bases y una o dos unidades superior al pKa de los ácidos.

4. Explicar el efecto del modificador ácido con respecto al ajuste de pH y a la separación

cromatográfica, destacado en el artículo de referencia.
El efecto de los modificadores ácidos en el ajuste de pH y la separación cromatográfica depende
de la concentración del modificador y su pKa por lo que, el empleo de dichos modificadores de pH
en la fase móvil al momento de realizar análisis de péptidos y proteínas por HPLC, funcionan de
cierto modo como agentes de emparejamiento iónico aumentando la hidrofobicidad de los péptidos
mediante la formación de pares iónicos con sus grupos cargados por lo que es posible una
interacción de la muestra con la fase estacionaria hidrófoba, ayudando a mejorar la separación
mediante un aumento de la retención.

CONCLUSIONES

Efectuamos las lecturas de conductividad de las diluciones de KCl y de las muestras de agua con
diferentes orígenes.

RECOMENDACIONES

Contar con el equipamiento adecuado para la elaboración de la practica

Comprobar que la muestra sea completamente soluble en ambos: en el disolvente de la muestra
utilizada y en la fase móvil en las condiciones iniciales
Seleccionar la fase móvil adecuada para la técnica

BIBLIOGRAFÍA

Harris, D. (2001), Análisis Químico Cuantitativo, Editorial Reverté S.A., Barcelona-España.

Moscoso Gama, J. M. (2020). Cromatografía líquida de alta resolución. El Cid Editor. Recuperado de
https://elibro.net/es/ereader/uguayaquil/130610?page=11.
Skoog, D. A. West, D. M. y F. James, H. (1997). Fundamentos de Química Analítica (4a. ed.). Barcelona,
Editorial Reverté. Recuperado de https://elibro.net/es/ereader/uguayaquil/171236?page=338.
Skoog, D. A. (2008). Principios del Análisis Instrumental.México: Cengage Learning Editores.