CROMATOGRAFÍA

DOCENTE: MG. QF. VICTOR MIRANDA GARCIA

TEMAS

 - conceptos de cromatografía
 - tipos de cromatografía
 - aplicaciones
CONCEPTOS
 CROMATOGRAFÍA: La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia
que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en
mezclas complejas.
 El término cromatografía fue introducido en 1906 por el botánico ruso Mikhalil Tswett, para
hacer referencia a la separación de los pigmentos contenidos en extractos vegetales, conforme
éstos se filtraban a través de una columna rellena con un sólido poroso.
 Por tanto, la cromatografía comprende procesos en los que los componentes de una mezcla,
disueltos en una fase móvil, se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase
estacionaria
 En cuanto a la naturaleza del proceso cromatográfico, los componentes
disueltos de una mezcla se mueven continuamente entre las dos fases, se
asocian momentáneamente con la fase estacionaria, no migran, mientras
todos los componentes momentáneamente presentes en la fase móvil migran
a la misma velocidad que ésta. Entonces, la separación no ocurre en ninguna
de las dos fases, sino que es el resultado de continuos movimientos de las
moléculas entre ellas. Los componentes se separan cuando uno de ellos pasa
a una velocidad diferente en la fase estacionaria respecto del resto. El
tiempo empleado por cualquiera de los componentes en la fase estacionaria
depende de su afinidad por ésta en las condiciones ensayadas
TIPOS

 El estado físico de la fase móvil determina la primera gran división de los

métodos cromatográficos
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en Capa Delgada
Cromatografía en papel

 Fase estacionaria: La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y

espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso el
solvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de
capilaridad, o descendente en cuyo caso el flujo del solvente se produce por
acción de la fuerza de gravedad. La orientación de las fibras del papel con
respecto al flujo del disolvente se debe mantener constante en una serie de
cromatogramas
 https://www.youtube.com/watch?v=sndgYGGlJMs
Procedimiento para Cromatografía
Descendente en Papel
 (1) Suspender la hoja cromatográfica sembrada en el aparato, usando la varilla
antisifón para sostener el tramo superior de la hoja en la cubeta de solvente
 (2) La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el
vapor del solvente. Liberar cualquier exceso de presión, si fuera necesario.
 (3) Después de equilibrar la cámara, la fase móvil previamente preparada se
introduce en la cubeta a través de la entrada.
 (4) Cerrar la entrada y dejar que la fase móvil se desplace hacia abajo hasta la
distancia deseada sobre el papel.
 (5) Retirar la hoja de la cámara, marcar rápidamente la ubicación del frente de la
fase móvil y secar la hoja.
 (6) Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado
apropiado la localización de las manchas.
Cromatografía en Capa Delgada

 Cromatografía en capa delgada,CCD, (habitualmente denominada TLC por su

sigla en ingles) es comúnmente empleada para la separación e identificación
de sustancias .
 El mecanismo de separación predominante es la adsorción pero dependiendo
del adsorbente empleado pueden observarse también fenómenos de
partición. Esta técnica presenta varias ventajas sobre la cromatografía en
papel, se pueden emplear mayores cantidades de muestra; el tiempo
requerido es menor por lo tanto los riesgos de alteración de la muestra por
oxidación o por acción de los solventes disminuyen y permiten el uso de
adsorbentes minerales que hacen posible el empleo de reveladores agresivos,
como por ej., ácido sulfúrico.
 Fase Estacionaria: La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y
uniforme de material seco y reducido a polvo fino que se aplica sobre una
lámina o placa de vidrio, plástico o metal
 La fase estacionaria para CCD tiene un tamaño de partícula promedio de 10—
15 um, y la de CCDde alta resolución (HP) tiene un tamaño de partícula
promedio de 5 um
 https://www.youtube.com/watch?v=gVwlw-Xx1gU
 https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
Tipos de fases estacionarias

 Silica gel: La silica es preparada por polimerización espontánea y

deshidratación del ácido silícico. Las sílicas comerciales poseen tamaño de
poro variable entre 40 y 150 A. Los tamaños de partículas varian entre 5 y 40
micrometros dependiendo del fabricante. Es comunmente utilizada para la
separación de compuestos lipofílicos como aldehídos, cetonas, fenoles, ácidos
grasos, aminoácidos, alcaloides, terpenos y esteroides. Alúmina El tamaño de
partícula y diámetro medio de poro son similares a los de la sílica
 Se dispone comercialmente de alúmina ácida (pH 4,0 – 4,5), neutra (pH 7,0 – 8,0) y básica ( pH
9,0 – 10,0). Es comunmente utilizada para la separación de vitaminas liposolubles, alcaloides,
ciertos antibióticos e hidrocarburos policíclicos.
 Kieselguhr Es una tierra de diatomea térmicamente tratada, su principal constituyente es SiO2.
El tamaño de partícula puede variar entre 5 a 40 micrometros. Es comúnmente utilizada para la
separación de azúcares, aminoácidos y otras sustancias polares similares.
 Celulosa Es un polisacárido altamente polimerizado por monómeros de celobiosa. Es
comúnmente utilizada para la separación de sustancias hidrofílicas, tales como carbohidratos y
aminoácidos. Poliamida Es una resina sintética. Se utilizan dos tipos de poliamidas.
 Es comúnmente utilizada para la separación de compuestos polares, tales como aminoácidos y
derivados, benzodiazepínicos, ácidos carboxílicos, ciclodextrinas, ácidos grasos, flavonoides,
conservantes y plaguicidas.
 Silicato de magnesio Es comúnmente utilizada para la separación de azúcares,
antraquinonas, flavonas, glicósidos, esteroides lípidos, residuos de
plaguicidas, vitaminas, carbazoles y acetato de hidrocortisona.
 Detección/Visualización: A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV)
adecuada para observaciones bajo la luz UV de longitud de onda corta (254
nm) y larga (365 nm) así como una variedad de soluciones reveladoras para
visualizar las manchas.
Procedimiento

(1) Colocar la placa en la cámara, asegurando que la siembra esté por encima
del nivel de la fase móvil.
(2) Cerrar la cámaray dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que haya
recorrido tres cuartos de la longitud de la placa o la distancia indicada en la
monografía.
(3) Retirar la placa, marcar rápidamente el frente de la fase móvil y dejar secar
la placa.
(4) Visualizar los cromatogramas según se indica en la monografía individual .
(5) Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (Rf) para las
manchas indicadas en la monografía.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

 Se utilizan los mismos fundamentos de la cromatografía, pero en este caso la

fase estacionaria es más robusta, y generalmente se aplican con fines
preparativos.
 https://www.youtube.com/watch?v=xOxCh_3kfJo

 https://www.youtube.com/watch?v=IZrxhM92dUE
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (PRESIÓN)HPLC Y GC
 HPLC:
 Conceptos:
 https://www.youtube.com/watch?v=woJp1-jdL5M

 Aparato:
 https://www.youtube.com/watch?v=ZN7euA1fS4Y
 https://www.youtube.com/watch?v=eCj0cRtJvJg
Real:
 https://www.youtube.com/watch?v=QzySXjxkNlY
Cromatografía de gases

 Fundamentos:
 https://www.youtube.com/watch?v=H_99ORfJ818

 https://www.youtube.com/watch?v=atTT5Rztnog

 GC acoplado a masas:
 https://www.youtube.com/watch?v=V1ymtuPZfOk
 Cromatograma: Un cromatograma es una representación gráfica o de otro tipo de la
respuesta del detector, de la concentración del o los analitos en el efluente
 Pico: El pico es la porción del cromatograma que registra la respuesta del
detector cuando un componente individual eluye de la columna. El pico
puede ser definido por su área, altura y ancho a la mitad de la altura, o
altura y ancho en la línea de base. Si la separación es incompleta, se puede
registrar la elución de dos o más componentes como un pico no resuelto.
 Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elución
de un componente no retenido
 Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase móvil
requerido para eluir un componente no retenido. Se puede calcular a partir
del tiempo muerto y la velocidad de flujo F
 Tiempo de Retención (tR): En cromatografía líquida y cromatografía de gases,
el tiempo de retención, tR, se define como el tiempo transcurrido entre la
inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar
tR como un parámetro para identificación. Los tiempos de retención
cromatográficos son característicos de los compuestos que representan, pero
no son únicos. La coincidencia de los tiempos de retención de una muestra y
de una sustancia de referencia puede usarse como un criterio parcial en la
construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por sí misma para
establecer la identidad. Los tiempos de retención absolutos de un compuesto
dado varían de un cromatograma al siguiente.
 Número de Platos Teóricos (N): es una medida de la eficiencia de la columna. Para los picos
gaussianos

 En donde tR es el tiempo de retención de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que

se obtiene extrapolando los lados relativamente rectos del pico hasta la línea de base. El valor
de N depende de la sustancia cromatografiada así como de las condiciones operativas, tales
como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase móvil o gas transportador, la calidad del
relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor
de la película de fase estacionaria, el diámetro interno y la longitud de la columna
 Retención relativa (r): Es el cociente entre el tiempo de retención ajustado
de un componente y el de otro usado como referencia obtenido en
condiciones idénticas: r = (tR2 - tM)/(tR1 - tM)
 Resolución (RS): La resolución es la separación de dos componentes en una
mezcla, calculada por: Rs = 2(tR2 – tR1)/(W1 + W2) Donde tR2 y tR1 son los
tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W1 son los anchos
correspondientes en las bases de los picos obtenidos extrapolando los lados
relativamente rectos de los picos hasta la línea de base.
 Factor de Simetría (T): El factor de simetría
 T= W0,05/2f donde W0,05 es el ancho del pico al 5% de la altura y f es la distancia del máximo
del pico hasta el borde inicial del pico, midiendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la
altura desde de la línea base.
APTITUD DEL SISTEMA

 La verificación de la aptitud del sistema es una parte integral de los métodos

de cromatografía de líquidos y de gases. Estas pruebas tienen por objeto
verificar que el sistema cromatográfico resulta adecuado para el análisis que
se pretende efectuar.
 Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen
lo siguiente:
 Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil.
 Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y
presión.
 Las características de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte
cromatográfico (basado en partículas o monolítico), tamaño de partícula,
tamaño de poro y área específica.
 En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases
estacionarias, el grado de modificación química
 La resolución R, es una función de la eficiencia de la columna N, y se
especifica para asegurar que las sustancias que eluyan muy cercanas se
resuelvan entre sí y para asegurar que los estándares internos se resuelvan de
las sustancias a ensayar.
 La eficiencia de la columna puede especificarse también como un requisito de
aptitud del sistema, especialmente si hay un solo pico de interés en el
cromatograma, sin embargo, el valor aislado de eficiencia no puede asegurar
la resolución para el sistema en estudio
 Las inyecciones repetidas de una preparación estándar u otras soluciones
estándar se comparan entre sí para determinar si se cumplen los requisitos de
precisión. A menos que se especifique de otro modo en la monografía
correspondiente, para calcular la desviación estándar relativa, SR, se
emplean los datos de cinco inyecciones repetidas del estándar si el requisito
es 2,0 % o menor, y seis inyecciones repetidas si el requisito de la desviación
estándar relativa es mayor de 2,0 %.
 La desviación estándar relativa SR , se calcula según la fórmula siguiente:
MÉTODOS ADICIONALES DE PREPARACIÓN
DE MUESTRAS:
 EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA: Utiliza los mismos fundamentos que la
cromatografía en columna, pero menos escala

 https://www.youtube.com/watch?v=XkUsztsVaNY

 https://www.youtube.com/watch?v=6TGHcfwZS18

 Microextracción en fase sólida

 https://www.youtube.com/watch?v=w1_i7dg503A
QUECHERS

 QUICK
 EASY
 CHEAPER
 EFFECTIVE
 RUBBER
 SAFE
 https://www.youtube.com/watch?v=2lJxT-tAgpk
 https://www.youtube.com/watch?v=uU6G6oYrWqk
APLICACIONES

 Las distintas técnicas cromatográficas tienen aplicación en muestras que

contengan compuestos orgánicos, algunos ejemplos de aplicación son:
• Determinación del porcentaje de formación de una molécula de síntesis, en
una planta de síntesis orgánica.
• Determinación de porcentaje de solvente en un producto agroquímico
terminado.
 Determinación de concentración de producto activo en un producto agroquímico terminado.
 • Control de calidad de pureza de solventes, como alcohol etílico anhidro, tolueno, xileno,
benceno, que entran como materias primas a una planta.
• Determinación del contenido de principio activo de un medicamento.
• Control de calidad de la pureza de materias primas entrantes a bodega de una fábrica de
productos medicinales, tales como: alcohol etilico al 95%, propilenglicol, glicerina, alcohol
isopropilico, o-toluidina, paracetamol, butanol, octanol, benzaldehído, acetato de etilo, éter di
etílico, alcanfor, y muchos otros.
•
 • En fábricas de alimentos, para control de calidad de producto terminado y materias primas,
tales como proteínas, aromatizantes, determinación de colorantes.
 • En la industria petrolera, es un método indispensable, para analizar las composiciones de casi
todos los productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas, los compuestos
orgánicos destinados a síntesis.
 • En el control de la producción vinícola, tiene infinidad de usos, desde usarse como una “nariz
electrónica”, para caracterización de vinos, de acuerdo a parámetros previamente establecidos
por expertos, concentración de componentes, análisis de aminas, como etanolamina,
metilamina, agmatina, triptamina.
 • Su utilización es indispensable en análisis industriales, forenses bromatológicos, toxicológicos,
clínicos y de contaminación ambiental.
En fábricas de adhesivos, pegamentos, pinturas, para controlar que el producto
terminado lleve las cantidades indicadas de solventes, humectantes, colorantes,
gomas, resinas, poliuretanos, secantes, rellenantes, esponjantes, suspensores,
emulsificantes.
• En investigaciones policiales o forenses resulta una herramienta muy útil para
el análisis de muestras.
Las muestras biológicas (ej.: sangre, exudados de diferentes orígenes, muestras
de suelo, etc.) deben recibir un tratamiento adecuado previo a su análisis, y
luego son perfectamente abordables por algunas o varias de las técnicas
cromatográficas disponibles.
GRACIAS