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CAPITULO 1.-ANTECEDENTES
En las zonas tropicales de nuestro país, los recursos agrícolas son los más
importantes en la región, donde podemos encontrar materia prima para ser
industrializadas; con las transformaciones de estos podemos resolver problemas
económicos.
La posibilidad agroindustrial en Cochabamba muestra una serie de ventajas frente a
otras actividades, debido a las características regionales, tales como:
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Estudiar los tratamientos de la materia prima, previa ala hidrolisis enzimática.
Estudiar el grado de conversión utilizando el banano con cascara y sin cascara.
Restablecer el sistema de enzimas con el rendimiento mayor en glucosa.
Determinar las condiciones de separación y purificación del jarabe.
CAPITULO 2.-MARCO TEORICO
BIOTECNOLOGIA
La Biotecnología se define como un área multidisciplinaria, que emplea la biología,
química y procesos varios, con gran uso en agricultura, farmacia, ciencia de los
alimentos, ciencias forestales y medicina. Probablemente el primero que usó este
término fue el ingeniero húngaro Karl Ereky, en 1919.
La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos
y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o
procesos para usos específicos.
La biotecnología, comprende investigación de base y aplicada que integra distintos
enfoques derivados de la tecnología y aplicación de las ciencias biológicas, tales como
biología celular, molecular, bioinformática y microbiología marina aplicada. Se incluye
la investigación y desarrollo de sustancias bioactivas y alimentos funcionales para
bienestar de organismos acuáticos, diagnóstico celular y molecular, y manejo de
enfermedades asociadas a la acuicultura, toxicología y genómica ambiental, manejo
ambiental y bioseguridad asociado al cultivo y procesamiento de organismos marinos y
dulceacuícolas, biocombustibles, y gestión y control de calidad en laboratorios.
[ CITATION Uni06 \l 16394 ]
Bioquímica de la fruta
Los cambios que ocurren en la maduración de lo racimos cortados fueron estudios con
mucho más detenimiento bajo variables. [ CITATION NWS73 \l 16394 ].
Relaciones hídricas
La proporción pulpa-cascara está relacionada con la variación de azúcar y agua en la
fruta. La proporción es aproximadamente de 1,2 a 1,6 en la fruta verde y aumenta a
2,2 a 2,4 en la madurez avanzada. [ CITATION NWS73 \l 16394 ].
Carbohidratos
Días de maduración 0 3 5 7 9 11
Glúcidos totales (%) 21.31 20.49 19.78 19.78 18.60 18.12
Almidón (%) 20.65 12.85 6.00 2.93 1.73 1.21
Azucares reduc. (%) 0.24 2.81 7.24 10.73 12.98 15.31
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Azucares no reduc.(%) 0.62 4.85 6.52 6.12 3.98 2.60
Evolución de los azucares en la maduración.
Sustancias fenólicas
El componente más abundante en el producto es el 3,4-dihidroxifeniletilamina
(DOPAmina); en la corteza de la fruta alcanza a 70 mg/100 g de cascara, pero es
relativamente es escasa en la pulpa; este es el principal sustrato de la polifenoloxidasa
en el banano, que produce el ennegrecimiento de la fruta dañada.[ CITATION NWS73 \l
16394 ].
Aspectos botánicos
Es una yerba perenne, de apariencia arbolera, gigante, de altura de 3,5 a 7,5 metros,
estructura fibrosa.
El fruto, racimo o cabeza se desarrolla dentro de los 60 a 80dias desde el momento de
la inflorescencia.
En el campo comercial el racimo estándar o bunch debe de tener 9 manos con 145
dedos, los racimos varían entre 6 manos con 77 dedos y 14 manos con 250 dedos.
[ CITATION Hor94 \l 16394 ]
LAS ENZIMAS
Por las características de especificidad y eficacia de las enzimas en enzimas
biocatalizadas, hace que este tipo de proteínas sea objetivo de estudio.
Enzimas amiloliticas
Son f así ala conjunto de enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza capaces
de degradar a los polisacáridos (almidón, glucógeno, dextrinas, etc.) por la hidrolisis de
los enlaces glucisidicos α-(1-4) y α-(1-6). [ CITATION GRe75 \l 16394 ].
Por el tipo de enlace que atacan y los productos formados, las enzimas amiloliticas se
dividen en tres grupos: las α-amilasas que rompen los enlaces en el interior del
sustrato (endoamilasas), las β-amilasas que hidrolizan a partir dela extremidad no
reductora del sustrato (exoamilasas) y las glucomilasas que rompen los enlaces desde
la parte terminal no reductora del sustrato.
Otras amilasas que hidrolizan son: la ciclohexagluconasa, la celulosa, la
poligalacturonosa, la lisozima, la α-glucosidasa, la trehalasa, la β-galactosidasa.
Alfa-amilasa
La α-amilasa se encuentran en las plantas, en los mamíferos (en los páncreas y
glándulas salivales). Esta enzima ataca los enlaces glucosidicos α-(1-4), al interior de
las cadenas de los componentes del almidón, dando dextrinas como producto de la
hidrolisis, en esta actividad enzimática interviene el ion Ca2+ como cofactor.[ CITATION
Nov81 \l 16394 ]
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Beta-amilasa
La β-amilasa (α-1,4-glucan maltohidrolasa) se encuentra en cantidad mayor en las
plantas, estás están se encuentran ausentes en los mamíferos y su existencia es
dudosa en los microorganismos.[ CITATION Oth62 \l 16394 ]
Glucoamilasa
La glucoamilasa (α-1,4-glucan glucohidrolasa), están presentes en los animales,
principalmente en el hígado y en menor cantidad en los otros órganos, es una exo-
enzima que hidroliza los enlaces glucosidicos α-1,4 liberando unidades de glucosa
como único producto desde la extremidad no reductora de los oligosacáridos y del
almidón.(Rozenfeld, 1959)
Las amiloglusidasas son inactivas cuando el sustrato el almidón crudo (almidón no
licuados), excepto la enzima proveniente de Aspergillus awamori, por la cual el Udea,
en 1957, reporto que el almidón crudo es hidrolizado con rapidez por esta enzima.
[ CITATION GRe75 \l 16394 ]
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El jarabe de glucosa a nivel industrial se obtiene por hidrolisis de los almidones y
féculas de los cereales y tubérculos mediante la acción de los ácidos.
En la actualidad se utilizan las enzimas como catalizados biológicos para la obtención
de jarabes de glucosa.[ CITATION Oth62 \l 16394 ].
Hidrolisis acida
En la operación de producción industrial del jarabe de glucosa de las féculas y de
almidones comprende:
Obtención de una lechada o papilla de la fécula y agua a 20º Be, en una cuba
provista de un agitador mecánico, donde a veces ya se añaden el ácido (lo
suficiente para dar la concentración de 0,03 a 0,04 N).
Transformación del almidón en dextrina y luego en glucosa, en autoclave
entre 145 a 160ºC y 2 atmosferas de presión.
La neutralización hasta un pH de 4-5, decantación de los sólidos que se
forman y separación mediante filtro prensa.
Concentración del jarabe hasta 26º Be.
Decoloración en un filtro con carbono activado.
Finalmente concentrar al vacío hasta 43º Be.
Hidrolisis enzimático
Los jarabes obtenidos enzimáticamente son más ricos referidos al producto, por
ejemplo: el jarabe de malta producida por hidrolisis del almidón con amilasas de malta,
es mucho más rico en maltosa que es obtenido con ácido y es característico su sabor.
Los jarabes de glucosa y fructuosa producidos enzimáticamente por consiguiente son
más ricos en el producto, siendo más fácil su purificación.
La hidrolisis enzimática del almidón requiere dos etapas están son: la licuefacción y la
sacarificación; previamente el almidón debe gelatinizarse por acción del calor.
La hidrolisis enzimática para su máximo rendimiento depende la actividad mayor de la
enzima los factores de temperatura, pH, relación enzima/sustrato y el tiempo son
óptimos.
Almidón
El almidón es un carbohidrato compuesto por dos clases de cadenas largas de
unidades de glucosas: la amilopectina, multiramificada con 40 a 70 cadenas de
aproximadamente de 25 unidades de glucosa cada una y la amilasa es soluble en
agua y constituye casi el 20% del almidón; y la amilopectina es el 80%y es insoluble
en agua.[ CITATION ETo95 \l 16394 ]
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(C6H10O5)x + m H2O ----------------------- m C6H22O6
162 unid. En peso 175 unid. En peso
De dextrinas De glucosa
Glucosa
la glucosa existe en dos formas (α-β). Este azucar cristaliza de sus soluciones
acuosas a temperaturas inferiores a los 50ºC, como el α-D-glucosa, que tienen un
punto de fusion de 80ºC, a la temperatura por encima de 50ºC y por debajo de 115ºC
la forma estable es la α-glucosa.[ CITATION Det80 \l 16394 ].
METODOS CONVENCIONALES
Almidón. - Es un parámetro de referencia para evaluar el rendimiento del
proceso de hidrólisis.
Glucosa. - La glucosa presen te en el producto de la hidrolisis enzimática a
partir del almidón es una medida del grado de conversión de la hidrolisis. En
general los azucares reductores son determinados por el método de reactivo
acido 3,5-dinitrosalisilico conocido como el método de P. Bernfelf.[ CITATION
JGu91 \l 16394 ]
Proteínas en el sustrato. - Se utiliza el tradicional método de kjeldahi. Basado
en la digestión de la materia prima orgánica con ácido sulfúrico.
Proteínas presentes en el preparado enzimático. - Se hará referencia a dos
métodos:
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a) Método de lowry y col: utiliza el reactivo de folin ciocakteau, donde el
ácido fosfomolibdico/fosfotungstenico es reducido por los residuos de
tirosima, fenilalanina y triptófano de la proteína, en medio alcalino,
formando un complejo de color azul.[ CITATION JGu91 \l 16394 ]
b) Método de Bio-Rad: se basa en el procedimiento de Mario M. Bradford
[8]. En este método de utiliza solución acida de Azul Brillante de
Coomassie G-250 que se fija a la proteína. Se utiliza este método para
cuantificar las proteínas en los preparados enzimáticos.
Métodos enzimáticos. - El método de análisis enzima tico para cuantificar la
glucosa presente en el jarabe y materia prima.
D- glucosa: es determinado específicamente por el método de la firma
Boehiringer (UV method, cat. N 139206).[ CITATION Boe99 \l 16394 ].
EXPERIENCIAS FACTORIALES
Con la finalidad de determinar los factores con mayor influencia y examinar los efectos
producidos por la variación de dos o más factores objetos de estudio en la hidrolisis
enzimática del almidón de banano verde, se han planificado las experiencias en
laboratorio de acuerdo con el análisis factorial.[ CITATION Box88 \l 16394 ]
Experiencia (E-1)
Los factores estudiados son: enzimas alfa-amilasas (licuefacción), enzimas
glucoamilasas (sacrificantes) y tipo de sustrato (pelado del banano).
El objetivo de este diseño es estudiar los efectos de los factores: pelado (P), enzima
en la sacarificación (E2), así como las interacciones de estos factores.
El proceso de licuefacción enzimática del almidón utiliza las notaciones de T y B. Para
T se utiliza la enzima TERMAMYL a pH 6.5, temperatura de 91°C, 100 minutos y 50
ppm de CaCl2 y para B la enzima BAN a pH 6.5, temperatura de 85 °C, 100 min y 120
min de CaCl2.
En la sacarificación de las dextrinas a glucosa A y D son las notaciones que
corresponden a los niveles 1 y 2. En la sacarificación a es para el sistema de enzimas
AMG + PROMOZYME que hidroliza las dextrinas a pH 4.3, temperatura de 60°C, y por
72 horas y D para el sistema enzimático de DETROZYME que sacarifica las dextrinas
a pH 4.3, temperatura de 60 °C, y por 96 horas.[ CITATION RMo94 \l 16394 ].
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Diseño factorial para la producción de jarabe de glucosa por hidrolisis
enzimática del almidón de banano verde.
Se utilizan 300 g de banano verde para los 2 niveles del factor pelado y el proceso de
la hidrolisis se realiza en un reactor de vidrio Pyrex con capacidad de 1.5 L y agitación
mecánica, utilizándose un baño de aceite termostaizado.
Experiencia (E-2)
Determinación de unidades enzimáticas de la enzima TERMAMYL 120 L
Método analítico que consiste en la hidrólisis de almidón soluble de papa (6.95g/l) en
función del tiempo, a pH 5.6, CaCl2 0.0043 M y a 37°C, obteniéndose azucares
reductores por la acción enzimática de TERMAMYL 120 L.[ CITATION Nov81 \l 16394 ].
Experiencia (E-3)
Cuantificación de unidades enzimáticas para el sistema enzimático DEXTROZYME
225/75 L
La actividad de la enzima amiloglucosidasa interfiere fuertemente en la de terminación
cuantitativa de la actividad de la enzima pululanasa, por lo que es necesaria la
inactivación de la enzima amiloglucosa.
La cuantificación de la actividad de la enzima amiloglucososidasa en DEXTROZIME
225/75 L no es interferida por la actividad de la pululanasa, debido a que esta enzima
no hidroliza los enlaces α-1,4-glucosidicos en la maltosa, por el contrario estos enlaces
son hidrolizados en el pululan por la enzima amiloglucosidasa.[ CITATION Nov80 \l 16394
].
Experiencia (E-4)
La actividad en función de la cantidad de la enzima y el tiempo
Para los ensayos de actividad se utilizan los siguientes volúmenes de la enzima nativa:
0.4, 0.5, 0.6, y 0.7 ml por kilogramo de harina de banano. Cada uno de estos
volúmenes de la enzima son diluidos hasta un volumen de 250 ml con solución buffer
de citrato a pH 6.5.
Se dispone 12 tubos de ensayo con tapón, estos contienen la mezcla que está
constituida por: 0.3 g de harina de banano disuelto en 10 ml del buffer de citrato a pH
6.5, 50 ppm de CaCl2 y 75 µL de la enzima diluida. Se incuban a 80°C y a diferentes
tiempos.
Transcurrido en tiempo de reacción a la mezcla incubada se adiciona 25 ml de agua
destilada y se filtra inmediatamente.[ CITATION JGu91 \l 16394 ]
8
Experiencia (E-5)
Influencia de la cantidad del sustrato en la actividad enzimática; relación enzima
/sustrato
Para las pruebas de actividad, en 6 tubos de ensayo están contenidas la mezcla
reactiva y constituida por: 75 µL de la enzima diluida (0.6: 250 ml) preparada con
buffer de citrato a pH 6.5, 50 ppm de CaCl2 y el sustrato (harina de banano) en las
cantidades determinadas.
Transcurridos los 20 minutos de hidrolisis se determinan azucares reductores
liberados en la hidrolisis del almidón de banano el porcentaje de la experiencia.
[ CITATION JGu91 \l 16394 ].
Experiencia (E-6)
Influencia de la temperatura
Los ensayos de actividad enzimática se programan para temperaturas de 70, 75, 80,
85 y 90 °C. De esta manera es posible determinar la temperatura de equilibrio y la
zona de mayor actividad para las enzimas TERMAMYL 120 L. La relación enzima
/sustrato para los ensayos en 0.6 ml/kg de harina de banano.[ CITATION JGu91 \l
16394 ],[ CITATION FAO69 \l 16394 ]
Experiencia (E-7)
Influencia del pH
Los estudios de actividad relativa para la enzima TERMAMYL 120L se realizan a
valores de pH de: 5.0, 5.53, 6.02, 6.49, 7.00, 7.49 y son preparados utilizando las
soluciones buffer de sorensen. Para las pruebas de actividad, en 6 tubos de ensayos
están contenidas la mezcla reactiva y constituida por: 75 µL de la enzima diluida (0.6:
250 ml), 50 ppm de CaCl2, 0.3 g de harina de banano disuelta en 10 ml de cada uno
de los buffer indicados.
Transcurrido los 20 min de hidrólisis se determinan azucares reductores liberados en
la hidrolisis del almidón de banano siguiendo el procedimiento de la experiencia 4.
[ CITATION JGu91 \l 16394 ].
Experiencia (E-8)
Influencia de la temperatura
Las pruebas de actividad en función de la temperatura son realizadas utilizando la
relación enzima sustrato de 1.2 ml/Kg de harina de banano. Los ensayos son
programados a temperatura de 45, 50, 55, 60, 65 °C; estas pruebas permiten estimar
la temperatura de equilibrio y la zona de mayor actividad del sistema de enzimas
DEXTROZYME.
La licuefacción del almidón se lo realiza en 60 minutos de hidrolisis la glucosa, con
todos los datos obtenidos se determina el porcentaje de actividad relativa.[ CITATION
JGu91 \l 16394 ].
Experiencia (E-9)
Purificación del jarabe de glucosa
Estudio de decoloración
La finalidad del estudio es obtener un jarabe de glucosa que esté libre de impurezas y
particularmente clarificado. Este proceso último se constituye importantes en la
purificación del jarabe de glucosa obtenido el almidón de banano verde con cascara.
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El jarabe está constituido por glucosa, solidos como la fibra y el almidón insoluble.
Estos residuos insolubles son separados por centrifugas a 4500rpm en 15 minutos.
Con ayuda de las ecuaciones de decoloración de H.Freundlich y L. Langmuir se
determina la cantidad de carbón activado necesaria para decoloración total o
parcialmente el jarabe de glucosa.[ CITATION Mak91 \l 16394 ]
Los ensayos fueron realizados para jarabes con alta y baja intensidad de color
(15 y 13.5% en glucosa respectivamente). Para ambos casos se han de
realizar 5 ensayos por separado variando la concentración del jarabe y
manteniendo constante la cantidad de carbón activado.
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Los factores más significativos en la licuefacción del almidón son el pelado y
las enzimas responsables de la licuefacción. No existen interacciones
significativas entre los factores.
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CAPITULO 6.- BIBLIOGRAFÍA
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