BASES CELULARES Y MOLECULARES EN EL DESARROLLO DE LINFOCITOS B

GENERALIDADES

Anticuerpos: pertenecen a la inmunidad adquirida, producen células plasmáticas que a su

vez se originan en los linfocitos B maduros que se han originado en la médula ósea, a partir
de células madres hematopoyéticas.

Inmunoglobulinas: son glicoproteínas que se originan en los linfocitos B inmaduros.

Tienen cuatro cadenas polipeptídicas:

- Dos ligeras (L) con dominios constituidos por una variable y una constante

Dos segmentos de genes participan en la región variable de la cadena ligera formando un

único segmento codificado (exón) → VJ

1. Variable (V)
2. Unión (J)

- Dos pesadas (H), con una región variable y una región constante

Tres segmentos participan en la cadena pesada y conforman el gen de la variable → VDJ

1. Variable (V)
2. Diversidad (D)
3. Unión (J)

A las regiones se les denominan dominios y tienen aproximadamente 110 aminoácidos

Las inmunoglobulinas tienen 2 sitios donde se une al antígeno (FAB) y una región que se
denomina FC (factor cristalizable) que les da características biológicas a las
inmunoglobulinas.

El estadio de maduración del linfocito B en el que se expresan:

- Cadena pesada → el pro-B
- Cadena ligera → el pre-B

Inicialmente la inmunoglobulina que sintetiza el linfocito B, es IgM

En el ADN las cadenas de las inmunoglobulinas están codificadas:

- Cadenas Ligeras
o Kappa → cromosoma 2
o Lambda → cromosoma 22

- Cadenas Pesadas codificadas en el cromosoma 14

Los anticuerpos ya elaborados tienen algunos cambios genéticos en el Linfocito B maduro:

- Hipermutación somática
- Cambio de isotipo
CÉLULAS MADRES PLURIPOTENCIALES HEMATOPOYÉTICAS
Las células del sistema inmunitario (leucocitos y células titulares relacionadas con ellos)
tienen origen en una célula madre pluripotencial hematopoyética (CMPH), de la que
también derivan los eritrocitos y los megacaricitos (plaquetas).

Hematopoyesis → células madre hematopoyéticas (tienen capacidad de autorenovarse)

El sitio anatómico de la hematopoyesis cambia con la edad:

1. En el embrión, las células sanguíneas se producen en el saco vitelino y aparecen

en la tercera semana de vida.
2. A medida que el feto se desarrolla, algunas de estas células migran al hígado y
bazo.
3. A partir del 4° y 5° mes de vida fetal, los huesos y la médula ósea se desarrollan y
la hematopoyesis empieza a desplazarse a la médula ósea, en el nacimiento toda
la hematopoyesis tiene lugar allí.
4. En los adultos, la mayoría de las CMPH se encuentran en la médula ósea, sin
embargo, tienen pueden migrar hacia la circulación y se encuentra en bajas
cantidades de la sangre periférica.

A partir de las CMPH, se generan distintos progenitores:

a. Progenitor mieloide → célula de estirpe mieloide
b. Progenitor Linfoide común (PLC) → linfocitos B y T

La señalización a través de un receptor NOTCH 1, induce la diferenciación hacia el linaje

T, mientras que la ausencia de esta señal permite el desarrollo y diferenciación B.

Los PLC que no expresan receptores NOTCH, expresan:

- Moléculas de adhesión celular (CAM), que se unen a receptores del estroma
- Molécula VLA-4, que se une a la VCAM-1 de las células del estroma de la médula
ósea
o empieza a diferenciarse en la primera célula de linaje B (Pro-B temprana)
Característica más importante de Pro-B temprana: expresa el receptor C-
Kit que recibe la citoquina producida por las células del estroma Factor de
Célula Madre (SCF) y es el factor principal para expresar el receptor para IL-
7 que también expresan la línea de linfocitos T y células NK.

En este momento, se expresan los factores de transcripción PU-1, encargados de controlar

la diferenciación, proliferación y supervivencia del linaje de células B.

Existen otros factores de transcripción que cumplen un papel fundamental en las etapas
tempranas de la maduración linfocitaria, agrupados con el nombre de Ikaros e incluye los
factores Helios y Aiolos.

Ikaros pertenece a la familia “dedos de Zinc” siendo fundamental su coexistencia con PU-1
para generar las células Pro-B.
Otros factores involucrados en la maduración de los linfocitos B, son dos factores
pertenecientes a la familia hélice-bucle-hélice:

a. Proteína E2A
b. Proteína EBF (early B-cell factor)

Estos dos factores son imprescindibles en la síntesis de:

- Las cadenas sustitutas λ5 y V pre B
- La molécula de señalización Ig (Alfa) e Ig β (Beta)
- Los genes de recombinación Rag-1 y Rag-2

LINFOCITOS PRO-B
La recombinación V(D)J de genes de inmunoglobulina depende de la actividad de las
recombinasas Rag-1 y Rag-2, que reconocen secuencia de señales de recombinación
(SSR). Este proceso es controlado por los factores de transcripción E2A y EBF, que regulan
la expresión espacio temporal de Rag-1 y Rag-2.

La recombinación V(D)J por E2A y EBF no es suficiente por lo que es necesaria la

participación del Factor de Transcripción Pax 5 que es un regulador crítico en el desarrollo
de los Linfocitos B y actúa posterior a E2A y EBF.

Los Linfocitos Pro-B tienen 2 etapas:

1. Pro-B temprano: se establece la primera recombinación del ADN entre los genes D-
J en los dos cromosomas de la cadena pesada (H)
2. Pro-B tardío: se recombina el gen de la variable (V) con los genes D-J, en el primer
cromosoma (14), si falla, utiliza el segundo cromosoma, si hay fallo en ambos
cromosomas, el linfocito Pro-B entra en apoptosis.

La diversidad de unión es de:

- 65 segmentos de genes variables (V)
- 27 de diversidad (D)
- 6 de unión (J)
o Total de 10,530 dominios variables posibles de la cadena pesada (H)

El dominio de la cadena pesada está conformado por los genes V/D/J. El proceso de
recombinación somático se produce por corte y empalme del ARN mensajero.

La recombinación está guiada por secuencias conservadas de ADN no codificante

denominado secuencia de señales de recombinación (SSR) que se encuentran adyacentes
a los puntos donde se lleva a cabo la recombinación.

El complejo enzimático que actúa para producir la recombinación (VDJ), se conoce con el
nombre de recombinasa VDJ. Los productos de los genes RAG-1 y RAG-2, forman parte
de esa recombinasa y solo se expresan en los linfocitos B en desarrollo (Pro – y Pre-B).

Estas enzimas poseen actividad endonucleasas y son responsables del corte de la cadena
ADN. El resto de las enzimas como ligasa IV o la enzima ADN-PK, están involucradas en
la separación, modificación y plegado del ADN.
El complejo RAG- se une al espaciador de 23pb (pares de bases) y otro al espaciador de
12pb, de tal forma que una secuencia de SSR que contiene un espaciador de 12pb es
adosado a una que contiene un espaciador de 23pb. Esto se conoce como la regla 12/23 y
asegura que los segmentos génicos se unen en el orden correcto.

Dentro del ADN cromosómico, los segmentos V y DJ, se unen para formar una unión
codificante que implica la apertura de las horquillas que se formaron en el punto original de
corte en cada segmento de V y DJ y la reparación del ADN de una manera que introduce
variabilidad adicional en la secuencia de nucleótidos alrededor de la unión.

Las enzimas de separación de la cadena de ADN incrementan más la diversidad, ya que

son capaces de agregar o eliminar nucleótidos al azar en los sitios de unión de los
fragmentos génicos. Los nucleótidos adicionados, se conocen con los nombres de
nucleótidos P y N.

Los nucleótidos P, se adicionan por las enzimas responsables de la separación del ADN y
reciben este nombre, ya que generan secuencias poliandrómicas. Los nucleótidos N, son
adicionales sin templado por la enzima TdT (Deoxinucleotidil Transferasa Terminal) y se
encuentran principalmente en la unión VH- DH y DH – JH. La presencia de nucleótidos N
en la cadena L es rara, debido a que la enzima TdT, en los linfocitos B, solo se expresa
durante los rearreglos de la cadena H que es previo al de la cadena L.

Los dominios variables de las inmunoglobulinas presentan tres regiones hipervariables:

CDR1, CDR2 y CDR (región de diversidad complementaria).

- En las cadenas L y H los CDR1 y CDR2 están codificados dentro de los genes
V.
- En la cadena H el CDR3 está ubicado en la unión del segmento VH y DH – JH.

En ambas cadenas el CDR3 es la que presenta mayor variabilidad

LINFOCITOS PRE-B
Tiene 2 etapas:

1. Célula Pre-B grande: ya tiene reordenada la cadena pesada (H) que forma una
proteína llamada Mn. Las cadenas pesadas no pueden transportarse y expresarse
en la membrana celular a menos que formen un complejo con las cadenas ligeras
subrogadas. Al final de las células Pro-B, empiezan a sintetizarse dos cadenas
ligeras (proteínas) que pueden fijarse a las cadenas pesadas, tomar el lugar de las
cadenas ligeras y mostrarse en la membrana celular. Estas no son proteínas de
inmunoglobulinas verdaderas, solo se expresan durante este breve periodo y no
desempeñan ninguna función inmune.

Una vez en la membrana, ambas cadenas se asocian con el heterodímero Ig Alfa e

Ig Beta para formar el complejo Pre-BCR que identifica el siguiente estadio de
maduración y traduce señales de supervivencia.

2. Célula Pre-B pequeña: dejan de expresarse las cadenas ligeras subrogadas e

inicia una etapa de proliferación hasta que comienza el reordenamiento de los genes
que codifican la cadena L. El inductor de esta proliferación es la IL-7 producida por
 las células del estroma. Se deja de expresar la TdT y para que pueda producirse
este rearreglo vuelven a expresarse los genes RAg-1 y RAG-2.

Los rearreglos de la porción variable de la cadena ligera (L) están dirigidos por el fenómeno
de la exclusión alélica e involucra la asociación de fragmentos V L y JL. Existen dos locus
distintos para la cadena L:

- Kappa (κ) → los genes de esta cadena son los más simples y están codificados
en el cromosoma 2.
- Lambda (λ) → está codificada en el cromosoma 22.

De primero, la recombinasa intenta un rearreglo de la cadena Lκ y si no lo consigue, intenta

rearreglar esa misma cadena en el alelo presente en el otro cromosoma. Si estos intentos
no son exitosos, comienzan los rearreglos en la cadena Lλ, primero en un cromosoma y
luego en el otro.

Normalmente un 65% de los linfocitos B logra un rearreglo exitoso en la cadena Kappa y

el restante 35% en la cadena Lambda.

El primer gen denominado gen VL codifica el dominio variable y está contenido por 2
segmentos de gen separados, llamado segmento variable (V) y segmento de unión (J). Una
vez que se produjo la asociación V L – JL, este segmento queda separado de la región
constante de la cadena liviana (CL) por un intrón y esta configuración se transcribe al ARNm.

Para producir la cadena liviana completa, luego de la transcripción, el intrón se separa del
fragmento VL – JL del CL, por un proceso denominado corte y empalme (Splicing) del ARNm.

LINFOCITO B INMADURO
Una vez que los genes de la cadena L se reordenan con éxito, empieza a sintetizarse y se
combina con la cadena HM, que se encontrará anclada junto al heterodímero Ig - Igβ y
empieza a expresarse el BCR característico del estadio B inmaduro en la membrana celular.

Una vez que el linfocito alcanza el estadio B inmaduro, los mecanismos de control se
orientan hacia la especificidad del receptor y se activan mecanismos capaces de controlar
a los linfocitos cuyos BCR puedan reconocer moléculas propias en el ambiente de la médula
ósea.

BCR → receptor para el antígeno de células B

Los linfocitos B inmaduros que no reciben señales a través de su BCR, salen de la médula
ósea hacia el bazo, para continuar su proceso de maduración. La ausencia de señales a
través del BCR del linfocito B inmaduro induce disminución de la expresión de proteína RAG
(gen activador de recombinación) y el cese de los reordenamientos. Las proteínas RAG
continúan disminuyendo hasta desaparecer cuando el linfocito B alcanza la madurez en el
bazo.
Los linfocitos B inmaduros generados en la médula ósea que son capaces de reconocer
antígenos propios, tienen dos destinos:

- Si perciben una señal interna a través del BCR producen entrelazamiento

extensivo con los BCR de membrana
- Mueren por apoptosis en la médula ósea

Antes de morir el linfocito B puede reemplazar el BCR autorreactivo por otro que no lo sea,
a través de reactivar la proteína RAG, a este mecanismo se le conoce con el nombre de
Edición de BCR.

Los linfocitos B inmaduros que entrecruzan su BCR con antígenos propios solubles en la
médula ósea, se inactivan y entran en un estado irreversible de no respuesta a la que se
denomina anergia. Estos linfocitos B autoreactivos emigran de la médula ósea pero no son
capaces de activarse en la periferia y mueren pronto. Los linfocitos B que no reconocieron
antígenos propios en la médula ósea, porque no fueron expuestos a los mismos, pueden
en la periferia exponerse y entrar en anergia y luego apoptosis.

LINFOCITOS B MADUROS
Linfocitos B transicionales (BTr): tienen en su BCR una inmunoglobulina M, han
sobrevivido en la médula ósea de la selección central, un reconocimiento de antígenos
propios pasan al Bazo y tiene un periodo corto de tiempo cuando empiezan a expresar la
IgD de membrana.

LOS LINFOCITOS B TRANSICIONALES TIENEN 2 SUBPOBLACIONES:

Tipo 1 (BTr 1) Tipo 2 (BTr 2)
- IgM alto - IgM alto
- IgD bajo - IgD alto
- Se encuentran en circulación en - Se encuentran en los folículos
la vaina linfoide periarterial del esplénicos y luego pasan a
bazo linfocitos B maduros

Para que los BTr 2 pasen a los linfocitos maduros son necesarias señales de sobrevivencia
a través del BCR y el factor activador de los linfocitos B (BAFF) utiliza receptores de la
familia del FNT y es producido por macrófagos, células dendríticas y linfocito T activado y
es capaz de activar los factores de transcripción NF – KB y AP – 1 y es un factor importante
de sobrevivencia del linfocito B maduro.

En los linfocitos B maduros existen tres poblaciones:

- Células B1
- Células B2
- Células B de la zona marginal del bazo

LINFOCITOS B1
Son las primeras células B que se generan durante el desarrollo embrionario y el hígado
fetal, se encuentran raramente en órganos linfoideos secundarios y sangre, pero prevalecen
en las cavidades peritoneales y pleural.
Son capaces de autorenovarse localmente (expandirse sin el estímulo antigénico).
La quimiocina CXCL 13 cumple un papel fundamental en la migración y la residencia de los
linfocitos B1, expresan niveles altos de IgM y bajos de IgD y su principal función es la
producción de anticuerpos dirigida contra antígenos bacterianos no proteicos como
polisacáridos, fosfotidilcolina y lipopolisacáridos (antígenos T independientes de tipo 2 →
Ti-2), presentan epítopos repetidos que producen entrecruzamiento marcado con el BCR.
Estos linfocitos producen cantidades importantes de anticuerpos IgM que reciben el nombre
de anticuerpos naturales.

LINFOCITOS B DE LA ZONA MARGINAL DEL BAZO (BZM)

Estos linfocitos producen grandes cantidades de IgM en los primeros 3 a 4 días después
de la estimulación antigénica.

En la zona marginal esplénica, se reduce el flujo sanguíneo y permite el contacto íntimo

entre los antígenos y los linfocitos BZM, lo que posibilita que estos linfocitos sean los
primeros en entrar en contacto con antígenos que circulan en la sangre.

Una vez activados, se transforman en plasmoblastos, se dirigen a la periferia de la lámina

periarterial linfocítica y proliferan formando focos de células plasmáticas productoras de
anticuerpos IgM y responden preferentemente a antígenos polisacáridos de bacterias
capsulares.

El complemento y sus receptores representan un papel crucial en los linfocitos BZM. El

receptor 2 para el complemento (CR2 o CD21) al formar un complejo con CCD1 y TAPA-1,
constituye el correceptor del receptor de los linfocitos B para el antígeno (BCR). El receptor
CD21 une el componente C3d, fracción del complemento activado, sin las fracciones estas
del complemento, los linfocitos BZM no pueden unirse al antígeno eficientemente, lo que
reduce sus anticuerpos necesarios para opsonizar bacterias con cápsula y que puedan ser
fagocitadas.

LINFOCITOS B2
Constituyen el 90% de los linfocitos B de la sangre y de órganos linfoideos y su función
principal es reconocer antígenos proteicos y diferenciarse en células productora de
anticuerpos, gracias a la colaboración de los TH2.

El primer paso en la activación de los linfocitos B es el reconocimiento de antígenos solubles

por BCR. El cual puede ser en la sangre o en los folículos linfoideos de los órganos
linfoideos secundarios.

El entrecruzamiento del BCR de la membrana del linfocito induce la activación de

proteincinasa de la familia Src, que median la fosforilación de tirosina de los dominios ITAM,
del heterodímero Ig Alfa – Ig Beta. La fosforilación de los dominios ITAM, permite el
reclutamiento de otra tirosincinasa denominada Syk, que fosforila a la proteína adaptada
BNLK, esta última favorece el reclutamiento de las Tec cinasas, las cuales fosforilan y
activan a la enzima fosfolipasa C-Gamma (PLC – γ), que escinde a los fosfolípidos de
membrana PIP 2 y da lugar a la formación de IP3 y diacilglicerol (DAG). El IP3 induce la
liberación de calcio de los reservorios intracelulares, mientras el DAG activa la Protein
Cinasa C (PKC). Una tercera vía transduccional se pone en marcha que involucra la
activación de proteína G de bajo peso molecular, como Ras y Rac, por factores llamados
GEF, que conduce a la activación de los MAP cinasas (MAPK). Las distintas vías de
señalización conducen en última instancia a la activación de los factores de transcripción
NKkB, NFAT y AP-1 capaces de regular la transcripción de diversos genes que conducen
a la expresión de receptores para IL-2, IL-4, IL-5, Gamma Interferón, CCR2, así como
expresión de CD40, Cd80, Cd86 y CMH tipo II, que se traducirá en división celular y
presentación de antígenos a linfocitos TH2 y a recibir la cooperación T a través de
citoquinas.

El sólo reconocimiento del antígeno por el BCR no es suficiente para inducir proliferación
del linfocito B, para lo cual el linfocito B actúa como una célula presentadora de antígeno,
capta el antígeno con su receptor de membrana, lo introduce en una vacuola endocítica, lo
procesa y lo convierte en pequeños péptidos que introduce en las hendiduras de su CMH
tipo II y se los presenta a los linfocitos TH2 tipo II, en las áreas de folículos primarios a
donde acuden a través de CXCL13 aumentado la expresión del CCR7 específico para las
quimiocinas CCL19 y CCL21.

Una vez en el interior del folículo primario, siguen proliferando y dan lugar al centro germinal,
a estos linfocitos B se les conoce como Centroblastos, los centros germinales se
desarrollan una semana después de la estimulación antigénica, por linfocitos TCD4, que se
encuentran en los folículos, son parecidos a los TH0, producen CXCL13 y pueden producir
IL-4 y Gamma Interferón e IL-2, cuando los Centroblastos dejan de proliferar, se convierten
en los centrocitos.

En el centro germinal, los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de la Ig,
sufren modificaciones que darán como resultado la producción de anticuerpos de mayor
afinidad por el antígeno y de isotipo diferente de la IgM. Estas modificaciones moleculares
comprenden:

1. Hipermutación somática que altera la porción variable de la Ig

2. El cambio o switch del isotipo que reemplaza la porción constante de una cadena
pesada por otra de una clase diferente

HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA
Mecanismo por el cual la porción variable de las cadenas pesadas y livianas de las Ig sufren
mutaciones. Como consecuencia, luego de cada mitosis, las células hijas expresan
porciones V(D)J diferentes del linfocito B que les dio origen. Se da una mutación por cada
generación de linfocitos B.

Los linfocitos B que han reconocido antígenos por el BCR expresan receptor para la IL-2,
lo que inicia la generación de clonas de los linfocitos B en el folículo linfoideo, la activación
de la enzima citidina desaminasa que convierte los residuos de citidina del ADN en uracilo.

A su vez los residuos de uracilo son cortados por la enzima uracilo – ADN glucosilasa (UNG)
y en la siguiente replicación del ADN de la célula B, se introducen nucleótidos no
reconocidos.

Las mutaciones son al azar, muchas de ellas son perjudiciales para las células B.

Ejemplos:

a. Pueden impedir la expresión de la Ig de membrana, lo que conduce a la apoptosis

de la célula.
b. Disminuyen la capacidad de reconocimiento del epitopo antigénico, al no reconocer
el antígeno que hay que procesar para presentar al linfocito T y entonces no se
producen las moléculas cooperadoras que producen señales de supervivencia para
los linfocitos B y hay muchas muertes por apoptosis en los centros germinales y los
macrófagos de estas áreas los eliminan.

La región donde se producen la mayoría de cambios de la hipermutación somática son en

las regiones hipervariables de las regiones variables, que son las regiones de determinación
de complementariedad (CDR) y se designan CDR1, CDR2 y CDR3. La CDR3 es la más
larga y variable de las tres.

CAMBIO DE ISOTIPO
Proceso que ocurre luego del contacto antigénico. Los primeros anticuerpos producir en
una respuesta humoral son de isotipo M, pero a medida que progresa la respuesta
comienzan a observarse anticuerpos de igual especificidad antigénica, pero de distintos
isotipos. Esto es consecuencia de la asociación de la porción CDJ de la cadena H con una
porción constante diferente de la cadena M. A nivel genómico, se observa una región con
secuencias GAGCT y GGGGGT altamente repetidas a la izquierda (Upstream) de los genes
que codifican cada una de las porciones constantes. Estas regiones llamadas regiones de
switch, son imprescindibles para que se produzca la recombinación del ADN.

Las citoquinas Gamma Interferón inducen el cambio a IgG, la IL4 a IgE y el Factor de
transformación de Crecimiento Beta a IgA.

Cuando no se expresa la citidina desaminasa inducida por activación (AID), se produce el

síndrome de Hiper IgM, no hay cambio de isotipo y no hay hipermutación somática.

DIFERENCIACIÓN DE CENTROCITOS EN LINFOCITOS B DE MEMORIA O EN

CÉLULAS PLASMÁTICAS

Los centrocitos que sobreviven en el centro germinal, dan lugar a dos tipos de células:

- Plasmoblastos que abandonan el centro germinal para completar una

diferenciación a células plasmática productoras de Ig de alta afinidad
- Linfocitos B de memoria

Factores que inciden en uno u otro destino:

1. La afinidad del BCR por el antígeno y la

unión del Linfocito B a T
2. Si se establece una unión muy fuerte
entre CD40 y CD40L, favorece la
formación del LB de memoria.
3. La unión de la molécula OX40 y el OX40L
de los linfocitos T, favorece la diferencia
al fenotipo plasmocito.

También la expresión de citoquina como IL-10,

IL-4 e IL-5 favorece a la expresión de células
plasmáticas y solo la expresión de IL-4 a un
fenotipo de memoria.

El Blimp 1 su expresión es suficiente para inducir la formación de células plasmáticas y si

no se expresa este factor, la célula plasmática no produce anticuerpos.

Los plasmocitos son dos:

1. Uno de vida media corta (pocos días)

2. Uno de vida media larga (meses o años)

Es una respuesta inmune secundaria, la mayor parte de los anticuerpos séricos provienen
de estos plasmocitos de vida media larga, que siguen produciendo anticuerpos, aun cuando
el antígeno ya no esté presente.