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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS


LABORATORIO DE PARASITOLOGA CLNICA
NOMBRE: Diana L. Jerves G.
CURSO: P1
FECHA: 20/05/2013
1. TEMA: Pruebas Inmunolgicas tipo ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
2. OBJETIVOS:
2.1 OBJETIVO GENERAL:
- Determinar los fundamentos de la prueba inmunolgica tipo ELISA
2.2 OBJETIVO ESPECFICO:
- Determinar la tcnica de la prueba ELISA para protozoos intestinales.
3. MARCO TERICO:
La prueba de ELISA es utilizada regularmente para la deteccin de numerosas molculas
biolgicas, basndose en la especificidad del reconocimiento antgeno-anticuerpo y en la
sensibilidad de las pruebas enzimticas.
El rea de sus aplicaciones mdicas se ha expandido en forma sostenida, siendo la tcnica de
referencia utilizada para la medicin de determinadas hormonas, toxinas, inmunoglobulinas,
antgenos y anticuerpos desarrollados en todo tipo de infecciones, tanto bacterianas como
fngicas, parasitarias o vricas.
Se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de
los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un
soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por
tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la
enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Pasos generales de un ELISA:
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima

10. Desarrollo del color


Tipos de ELISA:
1. ELISA Directo:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de anticuerpos. Lavado para eliminar los
anticuerpos deficientemente o no fijados.
Adicin de la muestra problema con antgenos. Lavado de los antgenos que no
reaccionaron.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos
reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
2. ELISA Indirecto:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
3. ELISA Competitivo:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos desconocidos de la
muestra y antgenos conocidos del anticuerpo utilizado en el paso anterior.
Paralelamente, aadir anticuerpos, marcados con una enzima (conjugado). Lavar para
eliminar todo lo que no haya reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado o no coloreado de la prueba
que indicara una prueba positiva o negativa.

4. GRFICOS

5. CONCLUSIONES:
- ELISA se basa en la reaccin inmunolgica (antgeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte
slido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el
reactivo complementario.
- El complejo inmunolgico, una vez formado, es reconocido por molculas capaces de
reconocer a su componente ms superficial, marcadas con una enzima que
posteriormente se agrega posteriormente un sustrato cromgeno.
- Posteriormente este sustrato cromgeno es medido por espectrofotometra la
cantidad de producto enzimtico resultante, cuantificando as la cantidad producto
enzimtico marcado, y por tanto resultante de la reaccin inmunolgica, unin
antgeno-anticuerpo de inicio.
- La fase de lavado es muy importante debido a que as se puede eliminar cualquier
exceso que pueda reaccionar con el resto de componentes a agregar originando un
falso positivo o un falso negativo.
- Se puede usar esta tcnica para un parasitismo intestinal ya que en el caso en que
exista invasin de parsitos o una parasitosis extraintestinal se va a originar una
respuesta inmunitaria que se la puede comprobar por medio de ELISA. En el caso de
una infeccin aguda se detecta anticuerpos de tipo IgM o de tipo crnico donde se
detecta anticuerpos de tipo IgG.

6. DISCUSIONES:
- El uso de la tcnica de ELISA puede ser aplicado a la identificacin de protozoarios
intestinales y an ms extra intestinales ya que la respuesta inmunolgica va ligada
directamente a la estructura compleja de protenas del protozoario que va a actuar
como antgenos.
- La prueba directa de ELISA es menos sensible que la forma indirecta de la prueba ya
que en el caso de ELISA indirecto, el anticuerpo primario no se etiqueta y, por tanto,
conserva su inmunorreactividad. Adems, cada anticuerpo primario tiene muchos
eptopos que pueden unirse con el anticuerpo secundario, lo que permite la
amplificacin de la seal y por lo tanto la mejora de la sensibilidad del mtodo. Sin
embargo, hay una posibilidad de reactividad cruzada entre el antgeno y el anticuerpo
secundario, dando lugar a un error en los resultados.
- La adicin de un sustrato cromgeno se explica para la posible produccin de color.
Esto se debe a que se produce una larga cadena de insaturaciones que ampla la
longitud de absorcin trasladndose al espectro visible para el caso de ELISA directo e
indirecto o a dems puede agregarse sustratos que se puedan oxidar a causa del
oxgeno liberado originando cambio de color.
- Se agrega un complejo que posee una enzima debido a su habilidad de producir una
reaccin en catlisis para obtener un producto de fcil deteccin.
7. CUESTIONARIO:
1. Composicin de Agares

Agar SS (salmonellashigella). Este medio selectivo ejerce una buena inhibicin sobre
agentes coliformes, sin limitar el desarrollo de los patgenos gramnegativos.
Contiene:
Sales biliares
Lactosa,
Citrato y tiosulfato sdico
Citrato frrico,
Verde brillante
Rojo neutro como indicador.

Agar MacConkey. Es un medio selectivodiferencial que contiene:


sales biliares, las cuales inhiben la flora grampositiva.
Los agentes del grupo coliforme dan colonias de color rojo, debido a que fermentan la
lactosa. En cambio, Salmonella y Shigella sp. forman colonias incoloras.

Agar XLD (XilosaLisinaDesoxicolato). Medio indefinido, mixto, slido y diferencial.


En l crecern microorganismos quimiohetertrofos formadores de sulfhdrico a partir
de sulfato.
En la receta aparece rojo fenol, en el cual acta el indicador de pH.
Xilosa 3,75 g
L- Lisina 5,0 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Rojo Fenol 0,08 g

Desoxicolato de Sodio 2,5 g


Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Frrico de Amonio 0,8 g
Agar 15,0 g
Agua destilada c.s.p. 1000 mL (Microbiologa)

Caldo con tetrationato (Mueller y Kauffmann). Este mtodo posee la propiedad de


inhibir o destruir el crecimiento de Salmonella y Shigella. Contiene:
Tiosulfato de sodio,
Sales biliares
Yodo

Caldo con selenito (Leifson).


Contiene:
Selenito,
cido de sodio

2. Coprocultivo para protozoos intestinales


El coprocultivo o examen coproparasitoscpico consiste en el cultivo de materia fecal. Es un
mtodo de diagnstico microbiolgico que permite identificar diferentes organismos
causantes de enfermedades gastrointestinales.
Entamoeba histolytica y otras especies del gnero
Medio TYI-S-33 Trypticase 2.0 g
- Extracto de levaduras 1.0 g
- Glucosa 1.0 g
- Cloruro de sodio 200.0 mg
- Fosfato de potasio dibsico 100.0 mg
- Fosfato de potasio monobsico 60.0 mg
- Cloruro de l-cistena 100.0 mg
- l-cido ascrbico 20.0 mg
- Citrato de hierro y amonio 2.28 mg
- Agua desionizada (aforar) 100.0 ml
Para Amebas de Vida libre:
Medio NNE
- Cloruro de sodio 120.0 mg
- Sulfato de magnesio (7H2O) 4.0 mg
- Cloruro de calcio (2H2O) 4.0 mg
- Fosfato de sodio dibsico 142.0 mg
- Fosfato de potasio monobsico 136.0 mg
- Agar 15.0 g
- Agua destilada (aforar) 1000.0 ml
Medio SCGYEM
El medio SCGYEM (casena, glucosa, extracto de levaduras) se utiliza para purificar los cultivos
monoaxnicos de amebas de vida libre.

Casena purificada 10.0 g


Fosfato de sodio dibsico 1.325 g
Agua destilada 800.0 ml

Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis)


Medio TYI-S-33 (Trypticase, extracto de levaduras, hierro y suero)
-

Trypticase 2.0 g
Extracto de levaduras 1.0 g
Cloruro de sodio 200.0 mg
Fosfato de potasio dibsico 100.0 mg
Fosfato de potasio monobsico 60.0 mg
Cloruro de l-cistena 100.0 mg
l-cido ascrbico 20.0 mg
Citrato de hierro y amonio 2.28 mg
Bilis bovina 100.0 mg
Agua desionizada (aforar) 100.0 ml

Cryptosporidium parvum
-

RPMI-1640 100 ml
Glutamina 30 mg
Bicarbonato de sodio 300 mg
Bilis bovina 20 mg
Glucosa 100 mg
cido flico 25 microgramos
cido 4-aminobenzoico 100 microgramos
Pentotenato de calcio 50 microgramos
cido ascrbico 875 microgramos
Suero fetal de ternera 1%
HEPES 360 mg
Penicilina 10 000 U
Estreptomicina 10 mg
La solucin se ajusta a pH 7.40

(Navarro)

8. BIBLIOGRAFA:
Libros:
(2006). Protenas: Estructira Primaria. En D. Voet, Fundamentos de Bioqumica (pgs. 94-118).
Madrid: MDICA PANAMERICANA.
Pginas Web: Buscador Google
-

Stevenson,I (2006).Amibiasis Intestina. Obtenido de BlogSpot: http://amibiasisintestinal.blogspot.com/ 23:53 19/05/2013

- Microbiologa. (s.f.). UCV. Obtenido de


http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Agar_
XLD.pdf 23:50 19/05/2013

- Navarro, E. C. (s.f.). Scielo. Obtenido de Diagnstico de protozoarios intestinales


frecuentes en nios: http://www.scielo.org.bo/pdf/rbp/v47n3/a08v47n3.pdf 12:08
20/05/2013