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TCNICA DE DIAGNOSTICO ELISA (ensayo inmuno absorbente ligado a

enzimas)

Es un mtodo para detectar y cuantificar una protena especfica en una mezcla compleja,
descrito por Engvall y Perlmann (1971), se basa en la deteccin de un antgeno
inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reaccin cuyo producto reflejara un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro (Cultek, 2006).

La prueba ELISA se basa en varias teoras:

1. El antgeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y


retener su reactividad inmunolgica
2. Las enzimas tienen actividad especfica alta y convierten una cantidad
relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar
concentraciones muy bajas del ligando
3. La actividad enzimtica o reactividad inmunolgica de los conjugados se preserva
y permanece estable durante el anlisis y el almacenamiento
4. Las enzimas no estn presentes en el lquido biolgico que se va a analizar
(Cultek, 2006).

Figura 1.Curva de precipitacin tras la unin antgeno-anticuerpo (Manzanares y et-al,


2014).

En la actualidad existen muchas variantes de ELISA que se han desarrollado y utilizado


en diferentes situaciones, todas dependen de la misma base elementos:
1. Recubrimiento / captura: inmovilizacin directa o indirecta de antgenos en la
superficie de pozos de microplacas de poliestireno.
2. Bloqueo de placa: adicin de protena irrelevante u otra molcula para cubrir todos
los sitios de unin a superficie insaturados de los pozos de microplaca.
3. Sonda / Deteccin: incubacin con anticuerpos especficos de antgeno que se
unen por afinidad a los antgenos.
4. Medicin de seal: deteccin de la seal generada a travs de la etiqueta directa o
secundaria en el anticuerpo especfico (Thermo SCIENTIFIC, 2005)

TIPOS DE ELISA

1. ELISA DIRECTO: Se utiliza para la detencin de antgenos

Etapas

1. El antgeno es inmovilizado sobre la fase slida en los pocillos de la placa de


ELISA.
2. Se realiza un lavado con solucin salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los
antgenos no fijados.
3. Se adiciona anticuerpos marcados con una enzima (peroxidasas o fosfatasas) si
los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado.
4. Se nuevamente el lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
6. Se realiza la lectura colorimtrica del producto final coloreado (Cultek, 2006).

Figura 2. Tcnica de Elisa directo


2. ELISA INDIRECTO: se basa en la deteccin de anticuerpos, el sistema de deteccin
emplea dos anticuerpos, un primario contra el antgeno y un secundario marcado contra
el primario, la deteccin posee mayor sensibilidad por la unin de dos o ms anticuerpos
secundarios por cada primario y es la base para el examen de V.I.H (Hnasko, 2015),

Etapas

1. La Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos


objeto de estudio. Lavado con solucin salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar
los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte.
3. Lavado con solucin salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
4. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan
con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran
fijados a los antgenos. Lavado con solucin salina Tween 20 de pH 7.2 para
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reaccin si se desea.
6. Lectura visual del producto final coloreado.

Figura 3. Mtodo indirecto de ELISA


BIBLIOGRAFA

Cultek, S. (2006). Fundamentos y tipos de Elisas. Obtenido de


http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-
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Disponible en: http://www.gastrolabperu.com/examenes/clostridium-difficile-toxina-a-
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Disponible en: http://www.zeulab.com/es/productos/toxinas/153-aflatoxin-b1-test-
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