UNIVERSIDAD PRIVADA NORBERT WIENER

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

E.A.P TECNOLOGA MDICA EN ANATOMA PATOLGICA Y LABORATORIO
CLNICO

INMUNOLOGA II

SECCIN: LC7M1

PRCTICA N 6

PRUEBAS DE ELISA



Docente: LIC. TM. PUNCHIN GARCIA, ELSA.

Alumno(s):

DAMIAN SALAZAR, JUAN JOS.
PASTOR MATIAS, HANNZ ALEXIS.
SAAVEDRA MOSCOL, DANIEL.


LIMA-PER

2014
INTRODUCCIN

El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima,
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica
como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo)
marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la
reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente
revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima
producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Tipos de ELISA
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
ELISA competitivo
ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado
para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos
objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.
2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
3. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales
reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y
que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico
(antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al
soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y
los restos de la muestra no fijados.
3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un
eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)
conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos
aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los
anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich HADAS.
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico
(antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al
soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y
los restos de la muestra no fijados.
3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un
eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra
problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para
eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
4. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos
empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente
patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
2. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del
anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y
antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir
nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados
con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan
reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son
anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos
empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de
ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado
serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la
diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del
antgeno problema en la muestra.



OBJETIVOS
El alumno aprendi a familiarizarse con el mtodo ELISA, desde los
conocimientos tericos bsicos hasta la observacin de las pruebas.
Se conoci las diferentes tipos de ELISA en la bsqueda del antgeno y
anticuerpo.
Se entendi los usos del ELISA y su aplicacin en las diferentes pruebas.
MATERIALES Y EQUIPOS
Pocillos de ELISA para hepatitis B y C
Equipo automatizado de pruebas ELISA
Reactivos de pruebas ELISA para hepatitis B y C
Pipetas automticas
Insertos de las diferentes pruebas ELISA


Procedimiento en el laboratorio:
Hepatitis B:
Para realizar el procedimiento de ELISA para hepatitis B, utilizamos los insertos
facilitados por la docente en los cules se detallaron los pasos que se explicarn a
continuacin:
Se prepar el buffer de lavado haciendo una dilucin 1/20 entre ste y agua
desionizada, para un volumen final de 100 ml.

- 5 ml de buffer de lavado concentrado + 95 ml de agua desionizada

A continuacin se prepararon microplacas rotuladas como: A1, B1, C1, D1,
E1, F1, G1 y H1; donde: A1 es el blanco; B1, C1 y D1 son los controles
negativos; E1 y F1 son los controles positivos; G1 y H1 son muestras
problema. Estas microplacas se colocaron en un soporte para poder
movilizarlas a todas al mismo tiempo.

Se agregaron 50 ul. de reactivo control positivo, control negativo y las
muestras problema en sus respectivas microplacas.



A continuacin se agreg el conjugado a cada recipiente (excepto al blanco
A1). Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se llevaron a
incubar durante 1 hora a una temperatura de 37 grados.

Una vez finalizada la incubacin, se procedi a realizar el lavado utilizando
el buffer preparado al inicio de la prctica. Para llevar a cabo dicho lavado
se hizo lo siguiente:
- Con una micropipeta se retir el contenido de todos los recipientes y se
elimin (cambiando de punta en cada recipiente para evitar la
contaminacin de los mismos).
- Se agreg el buffer de lavado (aproximadamente 400 ul. entre el total de
recipientes) y se mantuvo en las microplacas durante 40 segundos
aproximadamente.
- Una vez transcurridos los 40 segundos, se retir con una micropipeta el
contenido de todas las microplacas.
- Luego se agreg nuevamente el buffer de lavado hasta completar 5
ciclos. Al finalizar el ltimo lavado, las microplacas se voltearon y
golpearon contra papel absorbente utilizando la fuerza para eliminar los
residuos lquidos del buffer de lavado. NO HAY RIESGO DE
ESTROPEAR LA MUESTRA DEBIDO A QUE UNA VEZ PRODUCIDA
LA UNIN ANTGENO CON LOS ANTICUERPOS ADHERIDOS A LAS
MICROPLACAS, RESULTA DIFICULTOSO DESHACER DICHO
COMPLEJO QUE SE HA FORMADO.




Se agregaron los cromgenos A y B a todos los recipientes (incluido el
blanco A1) y se incubaron las microplacas nuevamente a 37 grados durante
15 minutos.

Transcurrido el tiempo de incubacin, se agreg 50 ul. de la solucin de
parada o solucin Stop a cada microplaca. Los controles positivos y las
muestras positivas se tornaron de azul a amarillas.

Finalmente, una vez detenida la reaccin en las microplacas, proseguimos
con la lectura de los recipientes utilizando el espectrofotmetro a 450 nm.
de longitud de onda.

- Se obtuvieron las siguientes densidades pticas:

Microplaca Densidad ptica
A1 Blanco 0.000
B1 QC ( - ) 0.001
C1 QC ( - ) 0.000
D1 QC ( - ) 0.004
E1 QC ( + ) 2.771
F1 QC ( + ) 3.044
G1
514304000
3.047
H1 11186 2.978

Para poder evaluar los resultados, se debe hallar un dato llamado Cut-off
que nos permitir establecer parmetros para poder decir si el resultado es
positivo, negativo o indeterminado. El Cut-off se halla de la siguiente
manera:


Cut-off (C.O.) = Promedio de controles negativos + 0.100

- En primer lugar hallamos el promedio de los controles negativos:

Promedio = (0.001 + 0.000 + 0.004)/3 = 0.00166 = 0.002
- Ahora hallamos el Cut-off utilizando la frmula:

C.O = 0.002 + 0.100 = 0.102

Una vez hallado el Cut-off realizaremos una recta en donde indicaremos de
donde a donde se extender la zona gris que toda prueba debe tener.


Los resultados que se ubiquen dentro de la zona gris se reportarn
como indeterminados

Se evalan los resultados de las muestras problema G1 y H1.

- Ambos sueros muestran absorbancias muy por encima del Cut-off y de
la zona gris, por ende se puede decir que las muestras G1 y H1 son
REACTIVAS para Hepatitis B.

Descripcin del frasco
de muestra
Cdigo Resultado
Tapa verde 514304000 REACTIVO
Tubo largo 11186 REACTIVO


Qu hubiera pasado si la absorbancia de una de las muestras hubiera
estado dentro de la zona gris?
La muestra se habra reportado como indeterminada.
Incluso, si la absorbancia est fuera de la zona gris pero con un valor
extremadamente cercano a esta, tambin debe reportarse como
indeterminado.






Hepatitis C:
Para realizar el procedimiento de ELISA para hepatitis C, utilizamos los insertos
facilitados por la docente en los cules se detallaron los pasos que se explicarn a
continuacin:
Se prepar el buffer de lavado haciendo una dilucin 1/20 entre ste y agua
desionizada, para un volumen final de 100 ml.

- 5 ml de buffer de lavado concentrado + 95 ml de agua desionizada

A continuacin se prepararon microplacas rotuladas como: A1, B1, C1, D1,
E1, F1, G1 y H1; donde: A1 es el blanco; B1, C1 y D1 son los controles
negativos; E1 y F1 son los controles positivos; G1 y H1 son muestras
problema. Estas microplacas se colocaron en un soporte para poder
movilizarlas a todas al mismo tiempo.

Se agregaron 100 ul. del diluyente de muestra a cada microplaca (excepto
al blanco).

Se agregaron 10 ul. de reactivo control positivo, control negativo y las
muestras problema en sus respectivas microplacas.

Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se llevaron a incubar
durante media hora a una temperatura de 37 grados.

Una vez finalizada la incubacin, se procedi a realizar el lavado utilizando
el buffer preparado al inicio de la prctica. Para llevar a cabo dicho lavado
se hizo lo siguiente:

- Con una micropipeta se retir el contenido de todos los recipientes y se
elimin (cambiando de punta en cada recipiente para evitar la
contaminacin de los mismos).
- Se agreg el buffer de lavado (aproximadamente 400 ul. entre el total de
recipientes) y se mantuvo en las microplacas durante 40 segundos
aproximadamente.
- Una vez transcurridos los 40 segundos, se retir con una micropipeta el
contenido de todas las microplacas.
- Luego se agreg nuevamente el buffer de lavado hasta completar 5
ciclos. Al finalizar el ltimo lavado, las microplacas se voltearon y
golpearon contra papel absorbente utilizando la fuerza para eliminar los
residuos lquidos del buffer de lavado. NO HAY RIESGO DE
ESTROPEAR LA MUESTRA DEBIDO A QUE UNA VEZ PRODUCIDA
LA UNIN ANTGENO CON LOS ANTICUERPOS ADHERIDOS A LAS
MICROPLACAS, RESULTA DIFICULTOSO DESHACER DICHO
COMPLEJO QUE SE HA FORMADO.

A continuacin se agreg 100 ul. del conjugado a cada recipiente (excepto
al blanco A1). Con parafilm se cubrieron todos los contenedores y se
llevaron a incubar durante 30 minutos a una temperatura de 37 grados.

Se realiz un segundo lavado siguiendo el mismo procedimiento del primer
lavado.

Se agregaron 50 ul. de los cromgenos A y B a todos los recipientes
(incluido el blanco A1) y se incubaron las microplacas nuevamente a 37
grados durante 10 minutos.

Transcurrido el tiempo de incubacin, se agreg 50 ul. de la solucin de
parada o solucin Stop a cada microplaca. Los controles positivos y las
muestras positivas se tornaron de azul a amarillas.

Finalmente, una vez detenida la reaccin en las microplacas, proseguimos
con la lectura de los recipientes utilizando el espectrofotmetro a 450 nm.
de longitud de onda.

- Se obtuvieron las siguientes densidades pticas:

Microplaca Densidad ptica
A1 Blanco 0.007
B1 QC ( - ) 0.004
C1 QC ( - ) 0.006
D1 QC ( - ) 0.004
E1 QC ( + ) 2.581
F1 QC ( + ) 2.620
G1
514304462
0.015
H1 11248 0.009



Para poder evaluar los resultados, se debe hallar un dato llamado Cut-off
que nos permitir establecer parmetros para poder decir si el resultado es
positivo, negativo o indeterminado. El Cut-off se halla de la siguiente
manera:


Cut-off (C.O.) = Promedio de controles negativos + 0.120

- En primer lugar hallamos el promedio de los controles negativos:

Promedio = (0.004 + 0.006 + 0.004)/3 = 0.00466 = 0.005

- Ahora hallamos el Cut-off utilizando la frmula:

C.O = 0.005 + 0.120 = 0.125

Una vez hallado el Cut-off realizaremos una recta en donde indicaremos de
donde a donde se extender la zona gris que toda prueba debe tener.


Los resultados que se ubiquen dentro de la zona gris se reportarn
como indeterminados

Se evalan los resultados de las muestras problema G1 y H1.

- Ambos sueros muestran absorbancias muy por debajo del Cut-off y de
la zona gris, por ende se puede decir que las muestras G1 y H1 son NO
REACTIVAS para Hepatitis C.

Descripcin del
recipiente de muestra
Cdigo Resultado
Tapa verde 514304462 NO REACTIVO
Tubo largo 11248 NO REACTIVO
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
En cuanto al ELISA para hepatitis B se obtuvo ambos resultados reactivos con
densidades pticas sobre el valor de corte, por tal motivo nos est indicando que
posiblemente los pacientes pueden tener la infeccin viral. En cuanto al control de
calidad nos puede dar la seguridad que los reactivos y el trabajo de los analistas
estuvieron bien y sin errores sistemticos ni aleatorios.
En cuanto al ELISA para hepatitis C se obtuvo ambos resultados no reactivos con
densidades pticas muy bajos, por tal motivo nos est indicando que los pacientes
no tienen la infeccin viral. En cuanto al control de calidad nos puede dar la
seguridad que los reactivos y el trabajo de los analistas estuvieron bien y sin
errores sistemticos ni aleatorios.
CUESTIONARIO
1) Los mtodos ELISA son usados actualmente en los laboratorio?

Los mtodos de Elisa s son utilizados en la actualidad en los
laboratorios. Ya qu, en los centros de salud se utiliza principalmente
para identificar antgenos o anticuerpos que se encuentran en la sangre,
orina, esputos, etctera. Sin embargo, La tcnica se ha generalizado
con el empleo de equipos simples y muy baratos que se utilizan todava
hoy en muchos centros diagnsticos de todo el mundo.

2) Los mtodos ELISA se hicieron conocidos por el VIH?

Las Enzyme Linked Inmuno Ensayo Sorbent o pruebas de ELISA s se
hicieron conocidos por el VIH, debido a que fueron en un momento el
nico modo de su anlisis. Hoy en da es la prueba ms eficaz y sencilla
que hay actualmente en el mercado para detectar en la sangre de las
personas si son portadoras del virus VIH.

3) Los diferentes tipos de ELISA han permitido el avance en el
diagnstico de enfermedades?

S, debido a que gracias a esta tcnica se han podido realizar estudios
cientficos en campos como la biologa, la bioqumica y la medicina.
Dentro de sus principales aplicaciones, se encuentra el diagnstico
mdico, en estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinos,
oncolgicos, en la medicina forense y antropologa. Con el propsito
mdico se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas
plasmticas, antgenos tumorales, drogas, antgenos y anticuerpos de
microorganismo (parsitos, hogos, bacterias).

4) Su uso es rutinario en los diferentes laboratorios?

Su uso si es rutinario en los diferentes laboratorios, ya qu su campo de
aplicacin se ha amplificado en diferentes patologas. Por ejemplo, es
una de las pruebas iniciales de deteccin ms comn para el VIH, y
tambin abarca diagnstico de patologas causadas por parsitos,
hongos, bacterias.

CONCLUSIONES

El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno
o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada
por tanto ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato
especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple
vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro.

Existen diferentes criterios de clasificacin para estos ensayos: segn la
naturaleza del sistema pueden ser competitivos o no, conforme a la
naturaleza del conjugado se han identificado los ensayos con antgenos o
anticuerpos marcados. Sin embargo, la clasificacin ms usada se basa en
si se requiere o no de procedimientos para separar las fases del ensayo; de
acuerdo con este criterio los inmunoensayos enzimticos se clasifican
respectivamente en heterogneos homogneos. s preferible hablar de
separacin de fases en lugar del empleo o no de lavados a que eisten
otros mtodos como los basados en principios inmunocromatogrficos lo
que nos puede llevar a un error de clasificacin.

BIBLIOGRAFA

1. choa . istemas LA en ensaos clnicos de vacunas estudios
seroepidemiolgicos. (esis para optar por el rado de octor en iencias
Mdicas). Instituto Superior de Ciencias Mdicas de La Habana; 2002.