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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009

Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno


Sorbent Assay)
Universidad Nacional Autónoma de México.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Laboratorio de Inmunología L-121, Campus I

Pérez Pérez José Manuel1 ____________

Pérez Sevilla Alma Beatriz2 ____________

Equipo 3, Grupo 2802

Introducción: Fases de realización de una ELISA


 Sensibilización de la placa.
La técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno  Bloqueo de espacios vacíos.
Sorbent Assay) es un procedimiento de ensayo  El Ag o el Ac se fija a una superficie.
inmunoenzimático. Se basa en la detección antígeno  Aplicación del espécimen de prueba.
(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fase Controles positivo y negativo
sólida y mediante anticuerpos que directa o  Detección y caracterización por Ac. 2°
indirectamente producen una reacción, la prueba marcado.
recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó  Incubación con la muestra.
anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto  Incubación con el sistema de detección.
colorido, puede ser medido espectrofotométricamente.  Adición del sustrato.
Este principio tiene las propiedades de un
inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su Los diferentes tipos de ELISA son los que se
realización, emplea reactivos económicos y consigue, enumeran a continuación:
mediante el uso de la fase sólida, de una separación
fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Las Anticuerpos Marcados
enzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1.  ELISA Directo
 ELISA Indirecto
Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasa  ELISA Sandwich
alcalina y Peroxidasa y el color que se obtiene
Enzima Cromogeno Color
o Doble (DAS)
Fosfatasa p-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo o Heterologo (HADAS)
Alcalina 5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitro Purpura Antígenos Marcados
azul de tetrazolium (BCIP/NBT)
Naftol AS-TR fosfato/fast red RC Rojo
 ELISA Competitivo
Peroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 verde
acido sulfonico ELISA Directo.
o-fenilamino (OPD) Naranja Consta de las siguientes etapas:
3,3’5,5’-tetrametilbencidina base o Azul
dihidrocloruro (TMB) Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos
3,3’-deaminobencidina (DAB) Marrón específicos. Lavado para eliminar los antígenos
3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo fijados deficientemente o no fijados. Adición de
4-cloro-1-naftol (4C1N) Azul
anticuerpos marcados (“conjugados”) con una
enzima; si los anticuerpos reaccionan con los
antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado
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para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar del producto final coloreado.
la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica
del producto final coloreado. ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
ELISA Indirecto. • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
Consta de las siguientes etapas: específicos del agente patógeno a detectar. Lavado
• Fijación al soporte insoluble de antígenos para eliminar los anticuerpos fijados
específicos para los anticuerpos objeto de estudio. deficientemente o no fijados. Adición de la muestra
Lavado para eliminar los antígenos fijados problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
deficientemente o no fijados. Adición del suero etc.), de tal forma que si está presente el agente
problema, de tal forma que sus anticuerpos patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
reaccionarán específicamente con los antígenos específicamente con los anticuerpos fijados al soporte.
fijados al soporte. Lavado para eliminar los Lavado para eliminar los antígenos que no hayan
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adición de anti-anticuerpos conjugados con una Adición de anticuerpos específicos del antígeno a
enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos detectar (deben tener un epítopo diferente de los
específicos añadidos en el paso anterior y que se anticuerpos con los que se han tapizado el soporte),
encuentran fijados a los antígenos. Lavado para los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan la muestra problema y que se encuentran fijados a los
reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que
capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar no hayan reaccionado. Adición de anticuerpos
la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica conjugados con una enzima anti-anticuerpos
del producto final coloreado. empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar
los anti-anticuerpos marcados que no hayan
ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea
Sandwich). capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar
la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica
Consta de las siguientes etapas: del producto final coloreado.
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
específicos del agente patógeno a detectar. Lavado ELISA Competitivo.
para eliminar los anticuerpos fijados Consta de las siguientes etapas:
deficientemente o no fijados. Adición de la muestra • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos
problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, específicos del agente patógeno a detectar. Lavado
etc.), de tal forma que si está presente el agente para eliminar los anticuerpos fijados
patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará deficientemente o no fijados. Adición en
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. concentración conocida de una mezcla de antígenos
Lavado para eliminar los antígenos que no hayan del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados
reaccionado y los restos de la muestra no fijados. con una enzima y antígenos desconocidos objeto de
Adición de anticuerpos específicos del antígeno a estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos
detectar (deben tener un epítopo diferente de los del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados
anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que
conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre
los antígenos añadidos con la muestra problema y que el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o
eliminar los anticuerpos marcados que no hayan colorimétrica del producto final coloreado de ambas
reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de
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ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudio para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerpos
no tienen nada que ver con los anticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones
empleados para tapizar el soporte. Si hay del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a
diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas
antígeno objeto de estudio, está relacionado con antígeno a concentración idóne a. Aquella
serológicamente con el anticuerpo empleado para dilución del conjugado que produzca menor reacción
tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica, inespecífica (menor color de fondo o “background”)
es proporcional a la concentración del antígeno con muestras negativas e implique una clara
problema en la muestra. distinción de las muestras positivas, será la óptima. La
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden elección de una concentración de conjugado óptima
resumir en dos grandes grupos: va completamente ligada a planteamientos
• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich. económicos en los que se ha de procurar el mayor aho
• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs rro del conjugado aún a costa de aumentar el tapizado.
indirectos. La elección del substrato es de gran importancia para
la estandarización del método ELISA y hay que tener
La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil varios factores en cuenta, como son sensibilidad,
manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y
reproducibilidad de la unión de antígenos o complejidad de preparación, así como estabilidad
anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 después de la parada de la reacción.
pocillos y un volumen de 350µL son especialmente Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a los
ventajosas para procesar un elevado número de substratos y, por lo tanto, el método de detección de
muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado los complejos antígeno-anticuerpo como los sistemas
permanece reactivo mucho tiempo siempre que se de detección colorimétricos, fluorescentes y
mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se luminiscentes. Este método ha tenido una enorme
utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano aplicación en todos aquellos campos en los que se
que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa. Las precisaba la cuantificación de productos mediante
técnicas de ELISA se realizan mediante la adición anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
secuencial de todos los reactivos necesarios separados clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de
por etapas de lavado. Cada una de las operaciones anticuerpos monoclonales, etc.
puede realizarse manualmente con micropipetas o con
equipamiento para la automatización de todas y cada Objetivo:
una de las etapas. Esta completa automatización se
 Cuantificar el contenido de antígeno
justifica por la necesidad de procesar y analizar
(gammaglobulina humana) y la dilución del
un gran número de muestras y necesitar una
conjugado del Anticuerpo (anti-
elevada repetibilidad de resultados.
gammaglobulina) para ésta técnica.
La enzima escogida como marcador debe unirse
 Conocer el fundamento y las fases en la
fácilmente a antígenos y anticuerpos, encontrarse en
realización de la técnica de ELISA, y cuáles
estado puro a un precio razonable y tener un substrato
son las variantes de este método.
cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil
preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatas
alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; a
continuación se muestra una tabla con las ventajas y
desventajas de cada una así como los substratos que
se emplean con cada una de ellas.

La búsqueda de la concentración óptima de uso


depende ligeramente del tipo de ELISA empleado;
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Diagrama de Flujo: Resultados:


Diluir la solución de gammaglobulinas Para la tabla de resultados referirse al anexo 1,
página 5, y la grafica en el anexo 2, página 6.

La lectura de la placa de ELISA fue llevado acabo a


Rotular tubos del 1 al 7 del A al G
490 nm.

En la técnica de ELISA que se realizo fue


Colocar en 6 tubos solución de IgG acepto el A
estandarizada para la cantidad de 16µg/mL de
antígeno (gammaglobulina humana) en una dilución
Colocar un testigo negativo en la lgG terminando del anticuerpo conjugado a 1:20000, debido a que al
en la A interpolar en la grafica 1, anexo 2, página 6, se obtuvo
un valor de 4.3 obteniendo por anti-logaritmo el valor
de 19952, debido a las complicaciones para llevar
Colocarlos en una cámara húmeda 18hr 4°C acabo una dilución precisa y por su cercanía se
redondea el valor a 20000.

Eliminar el sobrenadante durante 30m


Análisis de Resultados:
Con base en los resultados obtenidos la cantidad de
Lavar con PBS –Tween 4 veces y reposar 1 min antígeno requerido en el ensayo por medio de ELISA
es de 16µg/mL de gammaglobulina con una dilución
de anticuerpo (anti-gammaglobulina) a 1:20000 para
obtener una lectura adecuada ya que fue la más alta.
Etiquetar 11 tubos y colocarle el conjugado Aunque se observa en la tabla 1 y grafico 1 del anexo
1 y 2 respectivamente valores por encima, al obtener
la pendiente el pocillo con la letra D con una
Colocar regresivamente un testigo conjugado e concentración de 16µg/mL fue la que se obtuvo mejor
inc a 37°c 1hr lectura, evitando así otros valores que se pueden deber
a la prozona y postzona.

Lavar con PBS tween. Son los factores que afectan la medida de la actividad
enzimática (temperatura, pH, fuerza iónica,
composición del tampón, reducción del substrato,
desnaturalización de la enzima y algunos casos,
Adicionar sustrato con el cromógeno exposición a la luz), también el desarrollo de las
Incubar 15 min a 37°C diluciones que son los que más afectan al ensayo
además de la experiencia del analista, hoy en día, son
el tiempo de reacción, la temperatura y la exposición a
la luz, los cuales al realizar de manera manual se eleva
Leer a 490 nm en lector de ELISA.
el error.

Cabe señalar que éste tipo de estudios se realizan para


estandarizar un método de ELISA para un antígeno
deseado. En ésta práctica se realizo de manera
demostrativa como se realiza la técnica de ELISA
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desde el pegado de antígeno a la placa, las diluciones


del mismo, así como la dilución del anticuerpo anti-
gammaglobulina. Una vez estandarizo el método se
realizan los estudios de corte para saber que paciente
presentan alguna enfermedad con base en un estudio
estadístico al 95% de confianza, y obtener de los
límites de referencia establecidos en el estudio para
pacientes que presentan enfermedad a partir del
resultado obtenido y que pacientes se descartan, con
esto tener la normatividad del laboratorio.

Conclusión:
Con base en el análisis de resultados a se cuantifico la
cantidad de antígeno de gammaglobulina humana
obteniendo 16µg/mL para la detección por ELISA en
ésta técnica con una dilución de anticuerpo de
1:20000.

En ésta práctica se conoció los fundamentos y la


realización de la técnica de ELISA, así mismo los
factores que afectaron durante el experimento, en éste
caso las diluciones, tiempo de incubación.

Referencias:
Hudson L. C. Hay F. Inmunología práctica. España: Ed.
Jims, 1979:
Roitt I, et al. Inmunología. 5ª edición. España: Harcourt,
2000:
Aníbal Margni R. Inmunología e inmunoquímica
fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana, 1996:

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ANEXO 1: Tabla 1, Absorbancia y dilución de la placa de ELISA

WL= 450 nm log 2.70 3.00 3.30 3.60 3.90 4.20 4.51 4.81 5.11 5.41 5.71 Control
Dilución 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000 1:250000 1:512000 Negativo
Antigeno (µg/mL) pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
128 1A 3.333 2.623 2.861 1.967 1.131 0.684 0.448 0.212 0.157 0.041 0.02 0.045
64 1B 3.333 3.333 3.239 2.147 1.267 0.713 0.574 0.443 0.327 0.249 0.181 0.001
32 1C 3.333 3.333 3.333 1.913 1.525 0.729 0.521 0.388 0.191 0.073 0.19 0.039
16 1D 3.333 3.333 1.538 2.33 1.514 0.99 0.765 0.485 0.422 0.278 0.316 0.01
8 1E 3.332 3.332 3.332 1.943 1.124 0.762 0.49 0.312 0.214 0.078 0.133 0.056
4 1F 3.332 3.332 2.845 1.791 1.188 0.782 0.561 0.556 0.353 0.328 0.267 0.001
2 1G 3.332 3.332 2.757 1.882 1.102 0.735 0.456 0.277 0.212 0.036 0.019 0.027
1 1H 1.585 1.003 1.069 0.619 0.205 0.468 0.37 0.177 0.2 0.155 0.164 0.049

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ANEXO 2: Grafico 1

Grafico 1. Curva de calibración de absorbancia contra logaritmo de la dilución para la


concentración optima del antigeno y dilución detectable para ELISA
3.76

3.51

3.26
Pocillo de la
3.01 placa de

2.76

2.51 A
B
2.26
C
Absorbancia

2.01
D
1.76 E
F
1.51
G
1.26
H
1.01 Lineal (D)

0.76 Lineal (E)

0.51

0.26

0.01
2.60 2.75 2.90 3.05 3.20 3.35 3.50 3.65 3.80 3.95 4.10 4.25 4.40 4.55 4.70 4.85 5.00 5.15 5.30 5.45 5.60 5.75 5.90 6.05 6.20
Log de dilución

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