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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)

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FES Zaragoza, QFB Bioquímica Clínica, 2009-2, 2802, Inmunología Clínica, Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay).
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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009

Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)
Universidad Nacional Autónoma de México.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Inmunología L-121, Campus I Pérez Pérez José Manuel1 ____________ Pérez Sevilla Alma Beatriz2 ____________ Equipo 3, Grupo 2802

Introducción:
La técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) es un procedimiento de ensayo inmunoenzimático. Se basa en la detección antígeno (Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fase sólida y mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto colorido, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Las enzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1.
Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasa alcalina y Peroxidasa y el color que se obtiene Enzima Cromogeno Color Fosfatasa p-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo Alcalina 5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitro Purpura azul de tetrazolium (BCIP/NBT) Naftol AS-TR fosfato/fast red RC Rojo Peroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 verde acido sulfonico o-fenilamino (OPD) Naranja 3,3’5,5’-tetrametilbencidina base o Azul dihidrocloruro (TMB) 3,3’-deaminobencidina (DAB) Marrón 3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo 4-cloro-1-naftol (4C1N) Azul

Fases de realización de una ELISA  Sensibilización de la placa.  Bloqueo de espacios vacíos.  El Ag o el Ac se fija a una superficie.  Aplicación del espécimen de prueba. Controles positivo y negativo  Detección y caracterización por Ac. 2° marcado.  Incubación con la muestra.  Incubación con el sistema de detección.  Adición del sustrato. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación: Anticuerpos Marcados  ELISA Directo  ELISA Indirecto  ELISA Sandwich o Doble (DAS) o Heterologo (HADAS) Antígenos Marcados  ELISA Competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado

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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA Sándwich Sandwich). “DAS” (Double Antibody capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA Sándwich “HADAS”. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de

Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adición de un substrato sobre el que sea
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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica, es proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos: • ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich. • ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350µL son especialmente ventajosas para procesar un elevado número de muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa. Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran número de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados. La enzima escogida como marcador debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; a continuación se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una así como los substratos que se emplean con cada una de ellas. La búsqueda de la concentración óptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado;
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para cualquier ELISA que utilice anti-anticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antígeno a concentración idóne a. Aquella dilución del conjugado que produzca menor reacción inespecífica (menor color de fondo o “background”) con muestras negativas e implique una clara distinción de las muestras positivas, será la óptima. La elección de una concentración de conjugado óptima va completamente ligada a planteamientos económicos en los que se ha de procurar el mayor aho rro del conjugado aún a costa de aumentar el tapizado. La elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparación, así como estabilidad después de la parada de la reacción. Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a los substratos y, por lo tanto, el método de detección de los complejos antígeno-anticuerpo como los sistemas de detección colorimétricos, fluorescentes y luminiscentes. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Objetivo:
 Cuantificar el contenido de antígeno (gammaglobulina humana) y la dilución del conjugado del Anticuerpo (antigammaglobulina) para ésta técnica.  Conocer el fundamento y las fases en la realización de la técnica de ELISA, y cuáles son las variantes de este método.

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Diagrama de Flujo:
Diluir la solución de gammaglobulinas

Resultados:
Para la tabla de resultados referirse al anexo 1, página 5, y la grafica en el anexo 2, página 6. La lectura de la placa de ELISA fue llevado acabo a 490 nm. En la técnica de ELISA que se realizo fue estandarizada para la cantidad de 16µg/mL de antígeno (gammaglobulina humana) en una dilución del anticuerpo conjugado a 1:20000, debido a que al interpolar en la grafica 1, anexo 2, página 6, se obtuvo un valor de 4.3 obteniendo por anti-logaritmo el valor de 19952, debido a las complicaciones para llevar acabo una dilución precisa y por su cercanía se redondea el valor a 20000.

Rotular tubos del 1 al 7 del A al G Colocar en 6 tubos solución de IgG acepto el A Colocar un testigo negativo en la lgG terminando en la A Colocarlos en una cámara húmeda 18hr 4°C

Eliminar el sobrenadante durante 30m

Análisis de Resultados:
Con base en los resultados obtenidos la cantidad de antígeno requerido en el ensayo por medio de ELISA es de 16µg/mL de gammaglobulina con una dilución de anticuerpo (anti-gammaglobulina) a 1:20000 para obtener una lectura adecuada ya que fue la más alta. Aunque se observa en la tabla 1 y grafico 1 del anexo 1 y 2 respectivamente valores por encima, al obtener la pendiente el pocillo con la letra D con una concentración de 16µg/mL fue la que se obtuvo mejor lectura, evitando así otros valores que se pueden deber a la prozona y postzona. Son los factores que afectan la medida de la actividad enzimática (temperatura, pH, fuerza iónica, composición del tampón, reducción del substrato, desnaturalización de la enzima y algunos casos, exposición a la luz), también el desarrollo de las diluciones que son los que más afectan al ensayo además de la experiencia del analista, hoy en día, son el tiempo de reacción, la temperatura y la exposición a la luz, los cuales al realizar de manera manual se eleva el error. Cabe señalar que éste tipo de estudios se realizan para estandarizar un método de ELISA para un antígeno deseado. En ésta práctica se realizo de manera demostrativa como se realiza la técnica de ELISA

Lavar con PBS –Tween 4 veces y reposar 1 min

Etiquetar 11 tubos y colocarle el conjugado Colocar regresivamente un testigo conjugado e inc a 37°c 1hr

Lavar con PBS tween.

Adicionar sustrato con el cromógeno Incubar 15 min a 37°C

Leer a 490 nm en lector de ELISA.

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Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) Mayo 20, 2009 desde el pegado de antígeno a la placa, las diluciones del mismo, así como la dilución del anticuerpo antigammaglobulina. Una vez estandarizo el método se realizan los estudios de corte para saber que paciente presentan alguna enfermedad con base en un estudio estadístico al 95% de confianza, y obtener de los límites de referencia establecidos en el estudio para pacientes que presentan enfermedad a partir del resultado obtenido y que pacientes se descartan, con esto tener la normatividad del laboratorio.

Conclusión:
Con base en el análisis de resultados a se cuantifico la cantidad de antígeno de gammaglobulina humana obteniendo 16µg/mL para la detección por ELISA en ésta técnica con una dilución de anticuerpo de 1:20000. En ésta práctica se conoció los fundamentos y la realización de la técnica de ELISA, así mismo los factores que afectaron durante el experimento, en éste caso las diluciones, tiempo de incubación.

Referencias:
Hudson L. C. Hay F. Inmunología práctica. España: Ed. Jims, 1979: Roitt I, et al. Inmunología. 5ª edición. España: Harcourt, 2000: Aníbal Margni R. Inmunología e inmunoquímica fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana, 1996:

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ANEXO 1: Tabla 1, Absorbancia y dilución de la placa de ELISA

WL= 450 nm Antigeno (µg/mL) 128 64 32 16 8 4 2 1

log Dilución pozo 1A 1B 1C 1D 1E 1F 1G 1H

2.70 3.00 3.30 3.60 3.90 4.20 4.51 4.81 5.11 5.41 5.71 Control 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000 1:250000 1:512000 Negativo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3.333 2.623 2.861 1.967 1.131 0.684 0.448 0.212 0.157 0.041 0.02 0.045 3.333 3.333 3.239 2.147 1.267 0.713 0.574 0.443 0.327 0.249 0.181 0.001 3.333 3.333 3.333 1.913 1.525 0.729 0.521 0.388 0.191 0.073 0.19 0.039 3.333 3.333 1.538 2.33 1.514 0.99 0.765 0.485 0.422 0.278 0.316 0.01 3.332 3.332 3.332 1.943 1.124 0.762 0.49 0.312 0.214 0.078 0.133 0.056 3.332 3.332 2.845 1.791 1.188 0.782 0.561 0.556 0.353 0.328 0.267 0.001 3.332 3.332 2.757 1.882 1.102 0.735 0.456 0.277 0.212 0.036 0.019 0.027 1.585 1.003 1.069 0.619 0.205 0.468 0.37 0.177 0.2 0.155 0.164 0.049

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ANEXO 2: Grafico 1

Grafico 1. Curva de calibración de absorbancia contra logaritmo de la dilución para la concentración optima del antigeno y dilución detectable para ELISA
3.76
3.51 3.26 3.01 2.76 2.51 2.26 Absorbancia 2.01 1.76 1.51 1.26 1.01 0.76 0.51 0.26 0.01 2.60 2.75 2.90 3.05 3.20 3.35 3.50 3.65 3.80 3.95 4.10 4.25 4.40 4.55 4.70 4.85 5.00 5.15 5.30 5.45 5.60 5.75 5.90 6.05 6.20 Log de dilución
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Pocillo de la placa de

A B C D E F G

H
Lineal (D) Lineal (E)

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