CÓDIGO:

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090

VERSIÓN: 01
EMISIÓN:
02/03/2020
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA
1 DE 3

FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO: BACTERIOLOGÍA
PROGRAMA: BACTERIOLOGÍA
NOMBRE DEL CURSO: QUÍMICA CLÍNICA
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE COLESTEROL
NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
TOTAL.

1. OBJETIVO

Determinar la concentración de colesterol en suero plasma, utilizando el método de colesterol

oxidasa/peroxidasa.

2. INTRODUCCIÓN

El colesterol en circulación se encuentra de forma libre o esterificada formando las lipoproteínas. En el

estudio de las hiperlipidemias, la determinación de colesterol total es parte del estudio de laboratorio que se
realiza al hacer un perfil lipídico. Este último involucra encontrar las concentraciones de las distintas clases
de colesterol como el colesterol HDL, colesterol LDL y colesterol VLDL. Estos tienen una importante
implicación en la evaluación del riesgo cardiovascular. La muestra a utilizar puede ser suero o plasma
recogidos mediante procedimientos estándar, es estable 7 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes como la
heparina, EDTA, oxalato o fluoruro, no interfieren.
El método para la determinación de colesterol total en suero se basa en la acción de tres enzimas:
colesterol esterasa (CE), colesterol oxidasa (CO) y peroxidasa (POD). En presencia de POD la mezcla de
fenol y 4-aminoantipirina (4-AA) se condensan por acción del peróxido de hidrógeno, formando una
quinonaimina coloreada proporcional a la concentración de colesterol en la muestra y medible a 500nm.

3. PROCEDIMIENTO

 Teniendo en cuenta las normas de bioseguridad, tomar por grupo de trabajo una muestra
sanguínea en tubo sin anticoagulante y dejar coagular por 15 minutos a temperatura ambiente.
 Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm, separar en un tubo de ensayo el suero del paquete celular.
 Si el equipo es programable, se le cargan los datos del método y el resultado se muestra
automáticamente finalizado el examen. Si no admite programación alguna, escoger la longitud
de onda y cuadrar la absorbancia.

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 A manera de demostración el docente se encargará de montar el blanco y el patrón para

calibrar el equipo. Todos los estudiantes deberán marcar un tubo con sus nombres y el número
de la muestra.
 Pipetear de la siguiente forma:

Blanco reactivo Estándar Muestra

Patrón N/A 10 uL N/A
Muestra N/A N/A 10uL
Reactivo 1000 μL 1000 μL 1000 μL

 Agitar e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.

 Leer la determinación a 500 nm frente al blanco y, en caso necesario, realizar el siguiente
cálculo:

 Reportar los resultados obtenidos y compararlos con los del resto del grupo.

4. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS.

Los materiales necesarios para llevar a cabo el rocedimiento son los siguientes:
 Elementos de protección personal.
 Jeringas o sistemas de extracción de sangre al vacío.
 Algodón.
 Tubos al vacío sin anticoagulante.
 Torniquete.
 Pipetas.
 Cubetas de espectrometría.
 Tubos de ensayo.
 Centrífuga.
 Reactivo. Pipes 35 mmol/L, colato sódico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2
U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH
7,0.
 Patrón de colesterol total.
 Papel craft.
 Espectrofotómetro

5. EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y/O COLECTIVA.

Gorros, visor de acrílico o gafas protectoras, batas largas antifluidos por encima de los uniformes antifluidos,
guantes de látex y zapatos cerrados.

6. MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.

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Los residuos biológicos se desecharán en contenedores adecuados con una solución inactivadora (hipoclorito
de sodio a 5000 ppm) y los objetos corto punzantes en un guardián, cuando este se llene se le agrega solución
inactivadora. Las soluciones producto de las determinaciones se descartan en un recipiente aparte para su
disposición final. Por ningún motivo se eliminan en el sistema de drenaje del laboratorio. Finalmente, cada tipo
de residuo en sus respectivos recipientes se entrega a un recolector debidamente autorizado para su destino
final.

7. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.

Se les solicita un informe escrito de lo realizado anotando las posibles fuentes de error que pudieron haber
incidido en el resultado obtenido.

8. BIBLIOGRAFÍA

 Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W and Fu PC. Enzymatic determination of total serum
cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-475.
 Meiattini F, Prencipe L, Bardelli F, Giannini G and Tarli P. The 4-hydroxybenzoate/4-aminophenazone
chromogenic system used in the enzymic determination of serum cholesterol. Clin Chem 1978; 24:
2161-2165.
 National Cholesterol Education Program Expert Panel. Third report of the National Cholesterol
Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood
Cholesterol in Adults (ATP III). NIH Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute;
2001.
 Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 5th ed. AACC Press, 2000.
 Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4th ed. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns
DE. WB Saunders Co, 2005.
 Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press, 2001.
 Rifai, N. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry and molecular diagnostics, 8th edition, Saunders
Company, Philadelphia, PA, 2018.
 Bailey D. N. Clinical Chemistry: Practical Laboratory Diagnosis of Disease. American Society of Clinical
Pathologists Press, 2018.

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