Universidad Regional Amazónica Ikiam

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA APLICADA

1 PAO 2023

Docente: Carolina Proaño B. PhD.

Laboratorio: Laboratorio de Biología 2
Atención a estudiantes: Previa cita carolina.proano@ikiam.edu.ec

Políticas del curso:

● Obligatorio uso del mandil y mascarilla. Los mandiles deben estar rotulados con su nombre.
● En algunas prácticas se requiere el uso de guantes de látex o nitrilo.
● Prohibido el uso de teléfonos celulares.
● No se permite comer ni tomar bebidas dentro del laboratorio.
● Deben traer una pequeña libreta para anotaciones durante el laboratorio
● Deben llenar de manera posterior un cuaderno de laboratorio, de preferencia grapado, en el cual
mantendrá un registro detallado de las prácticas realizadas.
● Si durante la práctica debe salir del laboratorio, deberá sacarse el mandil y lavarse las manos con
jabón.
● Notifique inmediatamente al instructor si ocurre algún accidente: quemadura, heridas, rotura de
material, daño del equipo, derrame de sustancias, etc.
● Al finalizar el laboratorio debe lavar toda la cristalería usada y material usado
● Lave sus manos con agua y jabón antes y después de cada laboratorio.
● Usted es responsable del material y equipo con los que trabajará, cuídelos.

Símbolos de riesgo y seguridad

Leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos a emplear y familiarizarse con los símbolos de
riesgo o peligrosidad. Revisar las hojas técnicas, los equipos de protección, disposición de
desechos, medidas de primeros auxilios, etc.
TABLA DE SÍMBOLOS DE RIESGO O PELIGROSIDAD
RIESGO BIOLOGICO

Prácticas:
Cada estudiante deberá leer previamente y venir preparado para la práctica de laboratorio. Se
tomará una breve lección al inicio de la práctica.

1
La asistencia a los laboratorios es obligatoria. Las prácticas perdidas por inasistencia injustificada, no
podrán ser recuperadas y la nota correspondiente al informe será cero.
Se recomienda reforzar los conocimientos adquiridos en cada práctica con animaciones de los
procesos que se pueden encontrar en youtube.

Resultados:
En ciertas prácticas se requerirá la observación de resultados al día siguiente, para ello se
determinará una hora específica en la que todos los estudiantes podrán observarán sus resultados.
La asistencia para ver los resultados de las prácticas es OBLIGATORIA.

Informes:
Una vez concluida la práctica se elaborará un informe de una hoja impresa de ambos lados, que
deberá incluir las siguientes secciones: introducción, metodología, resultados, discusión (que incluye
observaciones, conclusiones y recomendaciones). La literatura citada puede ir en una hoja adicional
(Ver guía de elaboración del informe).
Los informes se calificarán sobre 10pts que equivaldrán al 15% de la nota final y serán entregados
una semana después de la finalización de la práctica o conjunto de prácticas.

Adicionalmente, se calificará la calidad de sus apuntes de laboratorio como un informe adicional.

Materiales:
Mandil, marcador de vidrio indeleble (punta fina y mediana), y cuaderno de laboratorio de pasta
dura y hojas cosidas por cada estudiante.
Todas las prácticas de laboratorio se trabajarán con guantes de látex y se solicita traer un rollo de
papel absorbente (de cocina), alcohol por cada grupo para la limpieza de los mesones de trabajo.
Es responsabilidad de los estudiantes traer los materiales requeridos. Y Entre todo el grupo deben
traer papel aluminio.

Cuaderno de laboratorio
Para cada práctica anotar:
Día, fecha
Título
Objetivo
Descripción detallada de la metodología, incluir cálculos, figuras, etc.
Resultados descriptivos si es necesario incluir una figura o tabla.
Conclusiones
Siguiente paso (plan para siguiente experimento).
● Dejar las primeras dos hojas para la tabla de contenidos.
● No se deben dejar espacios en blanco, es recomendable escribir solo en un lado del cuaderno, y
dejar el otro por si se requieren hacer correcciones posteriores. En caso de requerirse corregir
algo, debe tacharse con una sola línea y dejarlo legible.
● Las hojas deben estar numeradas.

2
Cronograma de prácticas:

Práctica TEMA Grupo 2 Grupo 1

0 Introducción, buenas práctica0s, libreta de laboratorio, 13 abril 14 abril
informes.
1 Producción y extracción de alcohol por medio de 20 abril 21 abril
fermentación. Parte 1. Preparación del fermentador
1 Producción y extracción de alcohol por medio de 27 abril 28 abril
fermentación. Parte 2. Destilación alcohol
1 Producción y extracción de alcohol por medio de 4 mayo 5 mayo
fermentación. Parte 3. Análisis del alcohol producido.
1 Producción y extracción de alcohol por medio de 11 mayo 12 mayo
fermentación Parte 4. Análisis de alcoholes destilados
por GS-MS
2 Análisis de calidad microbiológica del agua 18 mayo 19 mayo

3 Análisis microbiológico de Alimentos 25 mayo 19 mayo

4 Producción de Trichoderma. Gram y Sembrado 1 junio 2 junio
5 Biorremediación microbiana 8 junio 9 junio
4 Producción de Trichoderma. Gram, identificación y 15 junio 16 junio
aplicación en cultivo
6 Análisis microbiológico de muestras clínicas. Gram y 22 junio 23 junio
sembrado
6 Análisis microbiológico de muestras clínicas. Identificación 29 junio 30 junio
de Cocos
6 Análisis microbiológico de muestras clínicas. Identificación 6 julio 7 julio
de bacilos
6 Análisis microbiológico de muestras clínicas. Antibiograma 13 julio 14 julio
Jornadas Científicas Estudiantiles 19-21 julio 19-21 julio
4 Producción de Trichoderma: Evaluación en plantas. 27 julio 28 julio

Deben traer los cuadernos de laboratorio que serán revisados al inicio de cada práctica

3
 Guía para la elaboración del informe
Universidad Regional Amazónica Ikiam
Título de la práctica
Nombre:
Fecha
Longitud del informe 1 hoja de lado y lado, tamaño de letra 10 a espacio simple. Las referencias
pueden ocupar una hoja adicional. Los Informes serán calificados sobre 10 puntos tomando en
cuenta los siguientes criterios:

1. Introducción (2pts)
Describir en forma breve con sus propias palabras los principios en que se basa el experimento
realizado en la práctica y cuál es su utilidad. Escribir con estilo impersonal y en tiempo presente. La
introducción debe ser breve, clara y concisa. Debe recurrirse a bibliografía que sea actualizada y
relevante para dar soporte a las ideas expresadas.

2. Metodología (2pts)
Debe explicar en forma clara y resumida el desarrollo de la práctica, utilice pasado impersonal para
redactar esta sección. Ej: Se tomaron 3 tubos de ensayo y se marcaron a la altura de 1 y 3 cm. Esta
sección NO debe relatarse como receta.

3. Resultados (2.5pts)
En esta sección debe explicarse claramente los resultados obtenidos sin analizar si salieron bien o
mal los experimentos. Es preferible utilizar tablas y figuras para resumir los resultados. En ambos
casos debe incluirse un título de tabla (en la parte superior a la tabla) y un título de figura (debajo de
la figura). En ocasiones se incluirán fotos de geles, membranas, etc., las cuales deben ir rotuladas
adecuadamente, indicando las muestras que se colocaron en cada carril y que significado tienen las
bandas que se observan. Escribir con estilo impersonal en tiempo pasado.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 2,5% de productos de PCR St:

Estándar de peso molecular. Carril 1 y 2: controles negativos. Carril 3,
4,5, 6 y C2: controles positivos.

4. Discusión (2.5pts)
Esta es la parte más importante del informe. En esta sección usted debe analizar (comparar y
contrastar) los resultados obtenidos en sus experimentos en relación a los resultados esperados
según la teoría. En esta sección también es importante citar las bases teóricas que utiliza para la
comparación. De igual manera debe hacer referencia a las tablas y figuras que incluyó en sus
resultados. La escritura debe ser en tiempo presente.

5. Literatura citada (1pt.)

Incluir la bibliografía de los documentos adicionales que utilizó en la elaboración de este
informe y que citó apropiadamente durante el mismo. Se recomienda utilizar bibliografía actualizada
y de preferencia de libros, libros electrónicos, artículos científicos. El presente manual NO deberá ser

4
citado y tampoco se aceptarán como fuente de referencia bibliográfica páginas web no sujetas a
edición especializada, como por ejemplo, Wikipedia, Answers.com, Encarta, etc.

Tabla de contenido

PRÁCTICA No. 1 PRODUCCIÓN Y EXTRACCIÓN DE ALCOHOL POR MEDIO DE

FERMENTACIÓN. 6
PRÁCTICA No. 2: ANÁLISIS DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AGUA 9
PRÁCTICA No. 3: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS 13
PRÁCTICA No. 4: PRODUCCIÓN DE UN BIOINSUMO A PARTIR DE UN HONGO 20
PRÁCTICA No. 5: BIOREMEDIACIÓN MICROBIANA 22
PRÁCTICAS No. 6. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS CLÍNICAS. 24

5
 PRÁCTICA No. 1 PRODUCCIÓN Y EXTRACCIÓN DE ALCOHOL POR MEDIO DE FERMENTACIÓN.

OBJETIVO:

Producir y extraer etanol mediante fermentación alcohólica de jugo de caña y fruta

empleando a Sacharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN:

El proceso de fermentación alcohólica a partir de frutas tiene como objetivo la producción de

alcohol etílico a partir de la degradación del mosto azucarado en ausencia de oxígeno con ayuda de
microorganismos que lo llevan a cabo como parte de su actividad metabólica. Como en todo
proceso, sobre todo donde intervienen microorganismos, se rigen a condiciones óptimas para que
estos proliferen. Además, luego de la obtención del fermentado es necesaria la destilación de la
muestra y por último la medición del etanol obtenido, para este último se utilizan diferentes equipos
que facilitan el proceso, los más usados a nivel de laboratorio son: el alcoholímetro y el
cromatógrafo de gases (Guzmán, 2013). La destilación simple es un método en el cual se calienta
una muestra líquida hasta que sus componentes volátiles pasen a la fase de vapor, obteniendo un
compuesto volátil en forma pura. El alcoholímetro es un instrumento usado principalmente para
determinar el nivel de alcohol que se encuentra en un líquido. La cromatografía de gases es una
técnica usada para separar sustancias presentes en mezclas complejas de compuestos volatilizables
(Mulet-Hing, 2013).

PROCEDIMIENTO:

Materiales requeridos:
Grupo 1
1 botellones de agua de 4L (botella cerrada NUEVA)
4L jugo de caña
1 globos (para cerrar la tapa del botellón)
8 g levadura 

Grupo 2
1 botellones de agua de 4L (botella cerrada NUEVA)
1 piña
1 tabla de picar
1 cuchillo
1 cernidor
1 globos (para cerrar la tapa del botellón)
2lb azúcar
8g levadura 

Métodos

Parte 1. Preparación de los biorreactores

6
Bioreactor 1. Jugo de caña
1. Limpiar y desinfectar el área de trabajo.
2. Colocar 200ml de agua en un vaso de precipitación y calentarlo a 30°C.
3. Adicionar 8g de levadura granulada al agua y homogenizar. Esperar 20min a temperatura
ambiente mientras la levadura leuda.
4. Vaciar el agua del botellón NUEVO de 6L de agua.
5. Adicionar al botellón 3.8L de jugo de caña.
6. Añadir la levadura preparada en el paso 3.
7. Colocar un tapón con un globo y realizar agujeros con una aguja para liberar el CO2 producto de la
fermentación.
8. Permitir que la solución fermente durante 8 días a temperatura ambiente.
9. Monitoree el proceso de fermentación y anote sus observaciones. También debe liberar el CO2
producido con la trampa de aire.

Bioreactor 1. Jugo de piña

1. Limpiar y desinfectar el área de trabajo.
2. Colocar 200ml de agua en un vaso de precipitación y calentarlo a 30°C.
3. Adicionar 8g de levadura granulada al agua y homogenizar. Esperar 20min a temperatura
ambiente mientras la levadura leuda.
4. Vaciar el agua del botellón NUEVO de 6L de agua.
5. Adicionar al botellón 2lb de azúcar y adicionar jugo de piña hasta completar 3.8L.
6. Añadir la levadura preparada en el paso 3.
7. Colocar un tapón con un globo y realizar agujeros con una aguja para liberar el CO2 producto de la
fermentación.
8. Permitir que la solución fermente durante 8 días a temperatura ambiente.
9. Monitoree el proceso de fermentación y anote sus observaciones. También debe liberar el CO2
producido con la trampa de aire.

Parte 2. Destilación del alcohol producido

1. Arme el equipo de destilación dentro de la Sorbona.

2. Transcurrido el tiempo de fermentación transfiera 700mL de cada uno de los experimentos a un
balón de 1L
2. Adicione 6 núcleos de ebullición.
3. Encienda la plancha calentadora y controle la temperatura de destilación, la cual debe
mantenerse a 78°C (Punto de ebullición del etanol).
4. Continue con el proceso hasta que se detenga el proceso de fermentación. Este proceso dura todo
el día, por lo que debe turnarse con el grupo de trabajo.
5. Apague el equipo de destilación y desarme el equipo de destilación.
6. Rotule y guarde el alcohol destilado en la refrigeradora a 4°C.

Parte 3. Análisis del alcohol producido

1. Medir el volumen del alcohol destilado.
2. Colocar el alcohol destilado en una probeta y medir la concentración de alcohol producido

7
mediante un alcoholímetro.
3. Transferir un pequeño volumen del alcohol destilado a una caja Petri y realizar la prueba de la
llama. Esto es encender el alcohol. A menudo la llama no se puede observar por lo que debe acercar
un papel y ver si este de combustiona o no.
4. Si el alcohol se enciende o el papel se quema, la prueba es positiva.
5. Anote sus observaciones.
.
Parte 4. Caracterización de la composición del alcohol producido por cromatografía líquida acoplada
a espectrometría de masas (GC-MS).
1. Colocar 1ml del alcohol destilado en un vial ambar empleando un filtro de jeringa de 22um. Tapar
el vial.
2. Colocar el vial en la gradilla del automuestreador del cromatógrafo de gases acoplado a
espectrometría de masas.
3. Programar el análisis de la muestra
4. Analizar el espectro de masas obtenido para cada muestra.

BIBLIOGRAFÍA:

Guzmán Romero, R. A. (2013). Obtención de licor mediante la fermentación de piña y pera [Tesis de
Pregrado, Instituto Politécnico Nacional].
https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/17053/25-1-16616.pdf?sequence=1&isAllowed=
y
Mulet-Hing, M. (2013). Automatización de la destilación de alcohol de la UEB destilería de la ronera
Santiago de Cuba. Revista de Tecnología Química, 33(1).
Tunqui, C., Figueroa, A., Tejada, G., & Cjuro, I. (2018). Evaluación de las características del destilado
alcohólico de anÃs verde (Pimpinella anisum L.) obtenido por destilación simple. Revista de la
Sociedad Química del Perú, 84(4), 415-427.

8
 PRÁCTICA No. 2: ANÁLISIS DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AGUA

Elaborado por: Katherine Apunte MSc.

Revisado por: Carolina Proaño PhD.

OBJETIVO:

● Familiarizarse con los métodos de análisis microbiológico utilizados para el estudio de la

calidad microbiológica del agua potable y agua purificada envasada.
●
INTRODUCCIÓN:

El agua es un recurso que disponemos para diferentes usos: preparación de alimentos, para
consumo humano, para recreación, para riego de cultivos, entre otros. Ciertamente este es un
recurso muy importante para la vida y como es de esperar, en ella se puede encontrar una amplia
variedad de microorganismos los cuales dependiendo de su naturaleza pueden afectar o no la
calidad del agua.

Se han descrito varios géneros aislados comúnmente del agua, entre ellos tenemos: Pseudomonas,
Flavobacterium, Aeromonas, Achromobacter, Acinetobacter, entre otros. Sin embargo, así como
existen microorganismos que se hallan de forma común en el agua, también pueden encontrarse
aquellos que son patógenos para los animales o los humanos. Puesto que el agua puede actuar
como vehículo de transmisión, las aguas residuales que llevan un alto contenido de materia fecal
pueden alcanzar una fuente de agua utilizada para consumo y alterar su composición
microbiológica.

La Organización Mundial de la Salud en sus guías para la calidad del agua potable establece los
requisitos que se debe alcanzar para garantizar la inocuidad del agua. En términos generales las
normativas internacionales y nacionales establecen que el agua es apta para consumo si existe
ausencia de microorganismos entero-patógenos. Estos últimos son causantes de enfermedades
como la tifoidea (Salmonella typhi), el cólera (Vibrio cholerae) o la gastritis (Helicobacter pylori).

Por tal motivo, es imprescindible garantizar la inocuidad del agua potable mediante la investigación
de la presencia de coliformes fecales, ya que son fáciles de cultivar, son sencillas de identificar y han
sido catalogados como indicadores de contaminación porque no suelen estar presentes en agua o
suelo. Dentro de este grupo se encuentran los géneros de Escherichia, Citrobacter, Enterobacter,
Serratia y Klebsiella. Los cuales se caracterizan por ser bacilos Gram negativos, aerobios facultativos
capaces de usar la lactosa y la glucosa como fuente de carbono.

Para ello existen 2 métodos que son comúnmente usados para su detección: la filtración por
membrana y diluciones seriadas para realizar un recuento en placa.

La técnica de filtración por membrana tiene como fundamento el crecimiento, identificación y

contabilización de los microorganismos que son retenidos cuando un volumen conocido de agua es

9
filtrado a través de una matriz, y la misma es incubada en un medio de cultivo durante un tiempo y
una temperatura determinados.

En la técnica de diluciones seriadas y recuento en placa, lo que se trata es de contabilizar e

identificar los microorganismos presentes en una muestra de agua mediante la ejecución de varias
diluciones con volúmenes decrecientes de la muestra de estudio, que al ser cultivados permitirán en
determinadas concentraciones, contar el número de colonias y estimar el número de
microorganismos en la muestra original

Los requisitos microbiológicos para agua potable o agua envasada se describen en la Norma Técnica
Ecuatoriana correspondiente de la siguiente manera:

NTE-INEN 1108:2020 AGUA POTABLE

NTE-INEN 2200:2017 AGUA PURIFICADA ENVASADA. REQUISITOS

4.5 El agua purificada envasada o el agua purificada mineralizada envasada deben cumplir con los
requisitos microbiológicos establecidos en la Tabla 2

10
PROCEDIMIENTO:

RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA:

1. Si la muestra es colectada de un grifo dejar correr el agua por un minuto y llenar un frasco
estéril de al menos 100ml. Rotular el sitio la fecha y la hora de la recolección.
2. Para su transporte hacia el laboratorio debe mantenerse en un cooler y luego mantenerla a
4°C hasta su procesamiento, el cual no debe sobrepasar de 24h desde su colecta.
3. La muestra de agua envasada debe provenir de un envase sellado, se requiere mínimo 250
ml de muestra.

COLIFORMES FECALES, E. coli y Pseudomonas aeruginosa por 100ml

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA POR LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN

1. Montar el equipo de filtración previamente esterilizado y conectarlo a una bomba de vacío.

2. Con ayuda de una pinza estéril tomar un filtro de nitrocelulosa estéril de 0.45 micras y
colocarlo en el equipo de filtración.
3. Tomar la muestra de agua potable o envasada y transferir 100 mL al equipo de filtración
4. Encender la bomba de vació y esperar hasta que todo el volumen de agua haya pasado por el
filtro
5. Apagar la bomba de vació y retirar el embudo del equipo de filtración

11
 6. Con las pinzas estériles retirar el filtro y colocarlo sobre una placa Petri con agar cromocult
solidificado
7. Repetir el proceso, pasos 1 al 5. Colocar el filtro en un agar cetrimida para determinar el
número de Pseudomonas aeruginosa de ser requerido.
8. Incubar a 37°C por 18 horas
9. Contar las colonias e interpretar.

RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES POR ML

1. Sembrar 0.1ml de agua envasada sobre una placa con agar nutritivo.
2. Distribuir homogéneamente con un asa de Vibrasky
3. Incubar a 37°C por 18 horas
4. Contar las colonias e interpretar

Bibliografía

Berlanga, M. (2015). Brock Biology of Microorganisms (14th edn). Michael T. Madigan, John M.
Martinko (eds). International Microbiology, 8(2), 149-150.

Cappuccino, J. G., & Sherman, N. (1998). Microbiology: a Laboratory Manual 5th edition Menlo Park.

Trueba, G., Escobar, J. C. (2010). Laboratorio de microbiología aplicada. USFQ.

INEN, 2017. NTE-INEN 1108:2017 Agua potable.

INEN, 2200. NTE-INEN 2200:2020 Agua purificada envasada.

12
 PRÁCTICA No. 3: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

Elaborado por: MSc. Katherine Apunte

Revisado por: PhD. Carolina Proaño

OBJETIVOS:

● Determinar la calidad microbiológica de un alimento mediante el conteo de aerobios totales

y coliformes totales.

● Familiarizarse con la metodología del recuento de microorganismos.

INTRODUCCIÓN:

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Uno de los aspectos importantes que la industria de alimentos debe vigilar es la inocuidad de sus
productos. Según la Organización Panamericana de la Salud la inocuidad de un alimento es
garantizar que el mismo no causará daño al consumidor cuando este sea preparado o ingerido de
acuerdo con el uso que se destine.

Estos procesos de vigilancia previenen las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) y por ello
es imprescindible evaluar la calidad de un producto en términos de la carga de microorganismos que
posee. El hecho de que ciertos grupos de microorganismos se encuentren presentes en los
alimentos no necesariamente es un indicativo de un riesgo para la salud. Está descrito que los
microorganismos están presentes en plantas y animales, por tanto, es comprensible que los
alimentos que básicamente provienen de estas fuentes o de sus derivados contengan también
microorganismos. Sin embargo, cuantificar la carga microbiana e investigar la presencia de
microorganismos patógenos son fundamentales para establecer la calidad sanitaria de un alimento.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Una de las estrategias utilizadas para ello es el recuento de microorganismos en placa que se utiliza
como indicador de la calidad de un alimento o predice el tiempo de vida útil del mismo. Esta
metodología basa en el principio de que cada célula viable crecerá y se multiplicará hasta formar
una colonia (UFC), de tal modo que el número de colonias en la placa es el reflejo del número de
células viables presentes en la muestra.

En ese sentido, es necesario considerar que los microorganismos no se encuentran distribuidos de

forma homogénea en la muestra y por ello es necesario tomar varias muestras de un mismo
alimento para establecer su calidad microbiológica. No obstante, en algunos casos esto no es posible
por lo que es necesario tomar una muestra representativa con la ayuda de instrumentos estériles
para no alterar la carga microbiológica por causa de una contaminación. Si la muestra debe ser
transportada, estas deben mantener la cadena de frío a 4°C hasta su procesamiento que debe
ejecutarse dentro de las primeras 24 horas desde la toma de muestra. Por otro lado, si la muestra es

13
congelada esta debe mantenerse congelada hasta su análisis.

Este recuento se debe realizar en un medio que favorece el crecimiento de la mayoría de

microorganismos, por lo que generalmente se utiliza agar nutritivo. De igual manera el recuento en
placa se puede ejecutar utilizando 2 técnicas: vertido en placa o extensión en placa. En la técnica de
extensión en placa, sobre la superficie de una placa con agar se toma un volumen de 0,1 mL de un
cultivo diluido y se extiende la muestra con ayuda de un asa de Drigalsky. En la técnica de vertido en
placa se toma un volumen entre 0,1 a 1,0 mL de cultivo en una placa estéril, y a continuación se
añade agar nutritivo justo a la temperatura por encima del punto de solidificación y se mezcla con
cuidado moviendo suavemente la placa.

DILUCIONES SERIADAS

Para el análisis y recuento en placa primero se hacen diluciones en serie para conseguir una
concentración adecuada que permita sembrar y conseguir colonias que puedan contarse. Para hacer
una dilución seriada hasta 10-6 generalmente se mezcla 1 mL de muestra en 9 mL de cultivo líquido,
y a partir de esta dilución se transfiere 1 mL de la dilución en un tubo nuevo con 9 mL de medio
líquido de forma sucesiva 5 veces hasta completar 6 diluciones como se observa en la figura 1.

Posteriormente se toma un volumen de cada dilución (entre 0,1 – 1 mL) y se transfiere a una placa
con agar nutritivo y se extiende con la ayuda de un asa de Drigalsky y se incuba.

14
GUÍA PARA EL RECUENTO DE COLONIAS

Después de la incubación, las colonias que han crecido en cada caja petri deben ser contadas de
acuerdo al siguiente método, el cual ha sido adaptado del libro “The Compedium of Methods for the
Microbiological Examinatin of Foods”. El propósito de esta guía es asegurar la reproducibilidad de
resultados entre diferentes microbiólogos y laboratorios.

1. Cualquier colonia que esté físicamente distinguible se cuenta como una: Las colonias de algunas
bacterias pueden ser de forma irregular y por esto es difícil cuantificar las colonias. Este conteo
puede ser interpretado de diferente manera por cada investigador. Para estandarizar el conteo,
cualquier colonia distinguible se cuenta como una. Se debe asegurar que todas las colonias sean
contadas incluidas aquellas colonias que resaltan. Un aparato para conteo de colonias con
iluminación puede ser de gran ayuda al momento del recuento. Es muy importante diferenciar una
colonia de las partículas de alimento esparcidas en el medio de cultivo

2. Contar las cajas petri de todas las diluciones que contengan entre 25 y 250 colonias: Realizar un
promedio de las colonias que se hayan contado en las cajas Petri de la misma dilución, y utilizando la
ecuación descrita anteriormente, calcular el número de UFC/g ó ml del producto inicial.

3. Si sólo una caja petri de las dos contiene de 25 a 250 colonias, se debe contar ambas cajas petri
y realizar un promedio del conteo: Si ninguna otra dilución contiene entre 25 y 250 colonias, se
debe usar ésta para calcular el número de UFC/g ó ml del producto inicial.

4. Si dos diluciones consecutivas tienen de 25 a 250 colonias (por ejemplo: 10-4 y 10-5): Se debe
calcular las ufc/g de cada dilución y reportar el promedio como ufc/g. ó ml. Pero si el mayor contaje
es el doble del menor contaje, se debe reportar el menor contaje como ufc/g. ó ml.

5. Si todas las cajas petri contienen más de 250 colonias: Seleccione la muestra más diluida y
estime el número contando una porción de la caja. Use un contador de colonias con una caja guía
dividida en cm2 si es posible. Cuando hay menos de 10 colonias/cm, cuente 12 x 1cm2 y calcule el
promedio /cm2. Cuando hay más de 10 colonias/cm, cuente solo 4 x 1cm2 y calcule el promedio/cm2.
El área de las cajas petri convencionales (15x100) es aproximadamente 56 cm2. Multiplique el
número promedio/cm2 por 56 para determinar el número de colonias / caja petri. Luego calcule el
número de ufc/g ó ml.

6. Si todas las cajas petri contienen menos de 25 colonias: Considere el número de colonias de la
muestra menos diluida y reporte el contaje como un número estimado de ufc/g ó ml.

7. Si no hay colonias en ninguna de las cajas petri: Reporte el contaje estimado como menor a uno
(< 1) y multiplique por el inverso de la menor dilución. Por ejemplo si inocula las diluciones de 10-3 a
10-7 y no observa ninguna colonia en ninguna caja, reporte como <1 x 103 ufc/g ó ml.

15
8. Colonias extendidas: Hay algunas bacterias que forman colonias grandes en agar. (Bacterias del
género Proteus son invasoras y crecen extensivamente). Cuando se observan colonias extendidas
que pueden ser consideradas como una sola colonia, solo en caso de que no exceda el 50% del área
de la caja petri. Cuando la colonia excede el 50% de la caja petri, reporte esto como una colonia
extendida y no pueden ser utilizadas para calcular el número de ufc/g ó ml.

PROCEDIMIENTO:

A. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y DILUCIONES SERIADAS

4. De manera aséptica con instrumentos estériles y junto al mechero, pesar 25 gramos de una
muestra de alimento en una funda estéril y resuspender en 225 ml de agua peptonada.
5. Homogenizar la muestra con el agua peptonada.
6. De esta manera se ha preparado la primera dilución 1/10 ó 10-1
7. La dilución 10-2 resulta de transferir 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de agua peptonada y
así sucesivamente hasta la dilución 10-3
8. El número de diluciones se establece de acuerdo al grado de contaminación de la muestra.
9. En este caso suponemos que la muestra tiene un elevado número de bacterias por lo tanto el
número de diluciones recomendada es de 10-1 a 10-6

B. RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES

Es el recuento de organismos aerobios mesófilos para estimar la flora total presente en el
alimento.

1. Rotule las cajas adecuadamente (en la base del agar).

2. Inocule 100ul de cada dilución (10-1 -10-6) en dos cajas que contengan Agar Nutritivo o Agar
para conteo en placa.
3. Distribuir el inóculo en la superficie de manera aséptica empleando un asa de Digralsky
(cultivo por extensión)
4. Debe absorber en el agar por unos pocos minutos
5. Incube a 37°C por 16-18h, asegúrese que el agar se encuentre en la parte superior de la caja.

C. RECUENTO DE COLIFORMES Y Escherichia coli

Es el recuento de coliformes totales y E. coli para estimar la flora total presente en el alimento.

1. Rotule las cajas adecuadamente (en la base del agar).

2. Inocule 100ul de cada dilución (10-1 -10-6) en dos cajas que contengan Agar Chromocult
3. Distribuir el inóculo en la superficie de manera aséptica empleando un asa de Digralsky
(cultivo por extensión)
4. Debe absorber en el agar por unos pocos minutos
5. Incube a 37°C por 16-18h, asegúrese que el agar se encuentre en la parte superior de la caja.

DESCRIPCION DE LOS METODOS DE CULTIVO

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CULTIVO EN MEDIO SEMI-SÓLIDO:

Cultivo por vertido en placa

1. Limpiar su área de trabajo y tener el instrumental necesario para el cultivo
2. Ubicar la lámpara de alcohol en el área donde se va a manipular los medios de cultivo y las
muestras para mantener un espacio estéril.
3. Con una micropipeta colocar de 1 hasta 5 ml de cultivo de interés en una placa Petri vacía
etiquetada adecuadamente
4. Adicionar entre 20 y 25 ml de medio de cultivo agar estéril a 45°C para mantenerlo líquido
5. Homogeneizar con movimientos circulares la placa cerrada y dejar solidificar
6. Flamear las orillas de la placa, cerrar e incubar por 16h.

Figura 2. Método de siembra por vertido en placa

Cultivo por extensión

1. Limpiar su área de trabajo y tener el instrumental necesario para el cultivo
2. Ubicar la lámpara de alcohol en el área donde se va a manipular los medios de cultivo y las
muestras para mantener un espacio estéril.
3. Con una micropipeta colocar 100 μL del cultivo de interés en la placa Petri etiquetada
adecuadamente
4. Sumergir en alcohol el asa Digralsky, luego flamear y enfriar para esterilizar
5. Con ayuda de un asa Digralsky estéril dispersarla por toda la superficie de la placa hasta que
se absorba todo el cultivo y dejar secar en reposo por 5 minutos.
6. Flamear las orillas de la placa, cerrar e incubar por 16h.

Figura 3. Método de siembra por extensión

D. RECUENTO DE COLONIAS

1. Efectuar los contajes respectivos a las 24 y 48 horas.

2. Elegir las placas cuyos contajes se encuentren entre 25 y 250 UFC y seguir la guía para

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 recuento microbiano.
3. Expresar los resultados como UFC/gramo ó ml de muestra aplicando la siguiente ecuación:

UFC/ ml del cultivo = # de colonias en la placa x inverso de la dilución original

Volumen de muestra inoculado en el medio

* 1 ml en caso de la técnica de vertido en placa

0,1 ml cuando se utiliza la técnica de estriado en placa.

4. Los recuentos deben ser reproducibles es decir no debe existir un error mayor al 5% entre
duplicados.
5. El resultado se calculará tomando la media de los resultados de cada dilución y no debe existir
un error mayor al 10% entre diluciones. A continuación, se pone un ejemplo de un recuento
total

Bibliografía

Berlanga, M. (2015). Brock Biology of Microorganisms (14th edn). Michael T. Madigan, John M.
Martinko (eds). International Microbiology, 8(2), 149-150.

Cappuccino, J. G., & Sherman, N. (1998). Microbiology: a Laboratory Manual 5th edition Menlo
Park.

Zapata Mena, S. (2012). Manual de Laboratorio: Microbiología de alimentos. USFQ

Norma Peruana.
Microsoft Word - Proyecto de Actualización de la RM 615-2003.doc (minsa.gob.pe)

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 CUESTIONARIO

1. Demuestre los cálculos necesarios y estime el número de aerobios mesófilos totales en la

muestra del alimento analizado
2. Demuestre los cálculos necesarios y estime el número de coliformes totales y E. coli en la
muestra del alimento analizado
3. Interprete los resultados (busque la norma INEN o normas internacionales para determinar
los límites aceptables)

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 PRÁCTICA No. 4: PRODUCCIÓN DE UN BIOINSUMO A PARTIR DE UN HONGO

Elaborado por: Ing. Anghela Reinoso

Revisado por: Carolina Proaño, PhD

OBJETIVOS:
- Elaborar un bioinsumo a partir de hongos mediante fermentación en sustrato sólido

INTRODUCCIÓN:

Se denomina fermentación en sustrato sólido a aquel proceso que se da en una matriz sólida y
en ausencia de agua libre . Este proceso microbiológico ha generado gran interés debido a sus
amplias aplicaciones y a la posibilidad de usar residuos agroindustriales (Lizardi-Jiménez &
Hernández-Martínez, 2017). El uso de estos residuos convierte a este tipo de fermentación en
una herramienta para generar productos con valor agregado a base de residuos o productos con
poco o ningún valor . Residuos como cáscaras de frutas y bagazos de frutas en combinación con
ciertos microorganismos pueden llegar a generar desde enzimas, ácidos orgánicos, compuestos
bioactivos hasta agentes de control biológico (Chilakamarry et al., 2022).

Los agentes de control biológico surgen como una alternativa a la contaminación ambiental
causada por el uso excesivo de pesticidas, llamándose biopesticidas (Cavalcante et al., 2008). El
uso de la fermentación en sustrato sólido para la producción de biopesticidas ha ido
incrementando ya que el producto generado es más estable y tolerante en condiciones
ambientales reales (Lizardi-Jiménez & Hernández-Martínez, 2017). Los agentes de control
biológicos basados en Trichoderma poseen mejor capacidad para promover el crecimiento de
plantas y remediación del suelo en comparación con otros microorganismos (Cavalcante et al.,
2008; Rivera-Méndez, Brenes-Madriz & Zúñiga-Vega, 2018).

PROCEDIMIENTO:
Materiales requeridos
Métodos
PROCEDIMIENTO

1. Identificar el hongo entregado mediante el uso de claves taxonómicas

2. Colocar 15 mL de solución isotónica estéril 0.9% en la placa entregada.
3. Con un asa esteril y fría realizar un ligero raspado evitando perforar el agar
4. Inocular 13 mL de las esporas en solución en al sustrato seleccionado estéril (200 g de
arroz estéril)
5. Etiquetar e incubar durante dos semanas a 28°C
6. Colocar 200 gramos del bioproducto en 1 L de agua embotellada y agitar para separar
las esporas del sustrato
7. Filtrar con colador para separar el sustrato sólido de las esporas y colocar en un
atomizador
8. Rociar la mezcla en plántulas (una vez a la semana) durante x semanas

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 9. Evaluar la longitud de la raíz con y sin tratamiento

BIBLIOGRAFÍA:

Cavalcante, R. S., Lima, H. L. S., Pinto, G. A. S., Gava, C. A. T., & Rodrigues, S. (2008). Effect of moisture
on trichoderma conidia production on corn and wheat bran by solid state fermentation. Food
and Bioprocess Technology, 1(1), 100–104. https://doi.org/10.1007/s11947-007-0034-x

Chilakamarry, C. R., Mimi Sakinah, A. M., Zularisam, A. W., Sirohi, R., Khilji, I. A., Ahmad, N., & Pandey,
A. (2022, January 1). Advances in solid-state fermentation for bioconversion of agricultural
wastes to value-added products: Opportunities and challenges. Bioresource Technology. Elsevier
Ltd. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.126065

Lizardi-Jiménez, M. A., & Hernández-Martínez, R. (2017, May 1). Solid state fermentation (SSF):
diversity of applications to valorize waste and biomass. 3 Biotech. Springer Verlag.
https://doi.org/10.1007/s13205-017-0692-y

Rivera-Méndez, W., Brenes-Madriz, J., & Zúñiga-Vega, O. (2018). Efectos de la aplicación de

Trichoderma asperellum y su filtrado en el crecimiento de almácigos de cebolla (Allium cepa).
Revista Tecnología En Marcha, 31(2), 98. https://doi.org/10.18845/tm.v31i2.3627

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 PRÁCTICA No. 5: BIOREMEDIACIÓN MICROBIANA

Elaborado por: PhD. Carolina Proaño

OBJETIVOS:
1. Describir los pasos requeridos para armar un biorreactor casero.
2. Determinar la capacidad degradadora de hidrocarburos de Pseudomonas aeruginosa

INTRODUCCIÓN:
La biorremediación microbiana es el proceso biotecnológico que utiliza microorganismos o sus
enzimas derivadas para recuperar un medio ambiente alterado por contaminantes. Este proceso se
basa en el aprovechamiento de las capacidades metabólicas naturales de los microorganismos para
utilizar los contaminantes y degradarlos o convertidos en sustancias menos tóxicas.
La biorremediación es considerada una forma económica, versátil, y eficiente de lidiar con
contaminantes ambientales en comparación con los métodos físicos-químicos.

PROCEDIMIENTO:

Materiales requeridos:
● Botellas plásticas 600ml
● Mangueras
● Bomba para pecera
● Suelo contaminado con hidrocarburo
● Agua de Petróleo
● Caldo nutritivo
● Medio minimal: 13,6 g KH2PO4, 2g (NH4)2SO4, 0.24g MgSO4•7H2O. Disolver en 1L y ajustar
a pH 7.

METODOS

Experimento
1. Inocule Pseudomonas aeruginosa en 20ml de caldo nutritivo.
2. Incube a 37°C por 18h.
3. Tome 1ml del medio de cultivo anterior e inocule 400ml de medio minimal.
4. Adicione 1 ml de petróleo estéril.
5. Coloque en un biorreactor con aireación constante.
6. Incube a temperatura ambiente durante 60 días.
7. Cada 7 días mida la absorbancia a 600nm. El blanco es el medio minimal estéril sin inóculo
bacteriano con 1ml de petróleo estéril.

BIBLIOGRAFIA

Tekere M., 2018. Microbial Bioremediation and Different Bioreactors Design Applied.
IntechOpen. DOI: 10.5772/intechopen.83661 https://www.intechopen.com/chapters/65140

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 PRÁCTICAS No. 6. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS CLÍNICAS.
OBJETIVO:
● Aislar al agente causal de una infección
● Identificar al microorganismo mediante el uso de pruebas bioquímicas
● Determinar el perfil de susceptibilidad a los antibióticos del microorganismo aislado
● Elaborar un reporte microbiológico
● Comprender la secuencia de análisis de una muestra clínica.
INTRODUCCIÓN:

El laboratorio de microbiología tiene la responsabilidad de realizar los estudios en las muestras

clínicas relacionados a las enfermedades infecciosas. El objetivo es contribuir a un diagnóstico
oportuno mediante la identificación del microorganismo causante de una infección y de su
susceptibilidad a los antimicrobianos para de esta manera contribuir con el manejo terapéutico del
paciente por el médico tratante.
Las preguntas que generalmente plantea el médico al laboratorio son:
¿Existe una infección en el paciente?
¿Cuál es el agente causal?
¿Bacteria, virus, parásito, hongo?
¿Cuál es su susceptibilidad a los antimicrobianos?

El compromiso del laboratorio con el médico es el de proporcionarle la información que requiere en

forma gradual conforme se va generando en el proceso analítico a fin de que sea oportuna y
trascendente. Hoy día, la mayoría de los laboratorios de microbiología realizan el diagnóstico con
elementos básicos:
1. Identificación del microorganismo:
• Tinciones. • Medios de cultivo. • Pruebas bioquímicas.
2. Evaluación a la susceptibilidad a los antimicrobianos
• Pruebas de difusión en placa. • Pruebas de microdilución en placa • Pruebas de dilución
en tubo
Para obtener el máximo provecho del laboratorio microbiológico es indispensable que el médico
cumpla las siguientes premisas:
1. Aportar al laboratorio la información clínica indispensable.
2. Tener conocimientos básicos de microbiología clínica.
3. Conocer las indicaciones y las limitaciones de las pruebas.
4. Solicitar el estudio en forma precisa.
5. Comunicarse constantemente con el laboratorio.
6. Alertar al laboratorio sobre patógenos raros.
7. Tomar las muestras correctamente.
8. Conocer los criterios de trabajo del laboratorio.
9. Prestar atención a los resultados
Una toma de muestra apropiada es clave en el proceso preanallítico, pues es necesario que sea
representativa del proceso infeccioso. Cada tipo de muestra debe ser cultivada en medios de cultivo

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que favorezcan el crecimiento y posterior identificación de los microorganismos patógenos.
Posterior a ello es necesario realizar una identificación del microorganismo. Esto puede realizarse
mediante perfiles de pruebas bioquímicas empleando métodos tradicionales o rápidos. Sin
embargo, antes de esta identificación es primordial determinar la morfología de la colonia y la
morfología del microorganismo mediante microscopía óptica y tinción de Gram.
Finalmente, una vez identificado el género y especie del microorganismo patógeno es necesario
analizar su sensibilidad a los antibióticos para de esta manera orientar la terapia antibiótica
posterior para el paciente.
En el presente tiene el objetivo que los estudiantes sigan el procedimiento clásico para análisis
clínicas: Urocultivo, absceso y herida infectada y logren la identificación del microorganismo
patogénico. Al final del mismo deberán elaborar un reporte para el paciente.

METODOLOGIA
I. UROCULTIVO
II. ABCESO
III. HERIDA INFECTADA
PROCEDIMIENTO:
Día 1.
TINCIÓN GRAM
1. Prepare un portaobjeto con cada una de las muestras, deje que se sequen y fíjelas con calor
2. Coloque cristal violeta sobre la muestra previamente fijada. Esperar 1 minuto. Lavar la placa
con agua destilada
3. Colocar lugol por toda la placa. Dejar actuar 1 minuto. Lavar la placa con agua destilada
4. Colocar alcohol-cetona por toda la placa. Dejar actuar 15 segundos. Lavar la placa con agua
destilada.
5. Colocar safranina por toda la placa. Dejar actuar 1 minuto. Lavar la placa con abundante
agua. Dejar secar la placa al ambiente para observarla bajo el microscopio.
UROCULTIVO
1. Rotule la caja: fecha, código del paciente. Empleando el asa bacteriana siempre la muestra
de orina en un agar CLED. Como sustituto puede utilizar agar MacConkey y agar nutritivo
(finalidad pedagógica)
2. Siga el siguiente diagrama para sembrar la muestra en el CLED y agar nutritivo.

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 3. Incube a 37°C por 18h.
Absceso y Herida
1. Rotule la caja: fecha, código del paciente.
2. Inocule mediante estriado por agotamiento tres cajas Petri: Agar Sangre, Agar Chocolate,
Agar MacConkey
3. Incube a 37°C por 18h.
Día 2.
Urocultivo
1. Realice el recuento y determine la cantidad de colonias presentes
2. Revisa la morfología de las colonias presentes
3. Prepare una tinción Gram de la colonia más abundante
4. Revise en el microscopio óptico
Absceso y Herida
1. Revisa la morfología de las colonias presentes en los tres medios de cultivo
2. Prepare una tinción Gram de la colonia más abundante
3. Revise en el microscopio óptico
Dependiendo del resultado del Gram realice las siguientes pruebas:
Cocos Gram positivos:
1. Catalasa
2. Hemólisis en agar sangre
3. Coagulasa
4. Novobiocina
5. Agar Manitol Salado
6. Incube a 37°C por 18h
Bacilos Gram Negativos:
1. Oxidasa
Si es oxidasa positiva:
1. Cultive en Agar cetrimida
2. Siembre en un TSI (triple sugar iron)
3. Siembre en un MHA con disco de ampicilina
4. Incube a 37°C por 18h
Si es oxidasa negativa:
Realice una batería de pruebas bioquímicas
1. Siembre el microorganismo en Agar TSI en pico de flauta por estocada y en superficie
2. Siembre el microorganismo en Agar CIM por estocada
3. Siembre el microorganismo en Agar Citrato en pico de flauta
4. Siembre el microorganismo en Agar Urea en pico de flauta
5. Incube a 37°C por 18h

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 Día 3.
1. Realice la lectura de las pruebas bioquímicas efectuadas
2. Adiciones 2 gotas de reactivo de Kovac al medio CIM para determinar la producción de indol.
3. Prepare antibiogramas para los microorganismos identificados. Considere la edad del
paciente, si esta embarazada, si usa sonda, etc.
4. Incube a 37°C por 18h
Día 4.
1. Mida los halos de inhibición
2. Interprete si el microorganismo es sensible, intermedio o resistente
3. Elabore el reporte microbiológico para el paciente.
BIBLIOGRAFÍA
Garrido, D., Garrido, S., Gutiérrez, M., Calvopiña, L., Harrison, A. S., Fuseau, M., & Salazar Irigoyen, R.
(2017). Clinical characterization and antimicrobial resistance of Escherichia coli in pediatric patients
with urinary tract infection at a third level hospital of Quito, Ecuador. Boletín Médico Del Hospital
Infantil de México, 74(4), 265–271. https://doi.org/10.1016/J.BMHIMX.2017.02.004
Mora, Xavier. (2012). DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ Y GRAM-DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ Y
GRAM-DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ Y GRAM-DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ Y
GRAM-DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ Y GRAM-DIFERENCIANDO BACTERIAS GRAM+ y GRAM.
2–5.
Ruiz Martínez, L. (2007). “Pseudomonas aeruginosa”: Aportación al conocimiento de su estructura y al de
los mecanismos que contribuyen a su resistencia a los antimicrobianos. Universidad de Barcelona,
Tesis doct, 7–9. http://diposit.ub.edu/dspace/handle/2445/42532
Terrés Speziale AM. Diagnóstico Microbiológico. Capítulo 6.
 

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