CENTRO DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA
ACADEMIA DE BIOQUIMICA






MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA






LIC. EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

1er. SEMESTRE


ENERO JUNIO 2007






PROFESOR: M en C Gonzalo Muoz Andrade
M en C Marco Antonio Zamarripa T.

TECNICO: LAQB Ma. Guadalupe Lpez
LAQB. Hctor Rangel











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REGLAMENTO DE LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE QUIMICA


Antes de asistir a la prctica debers leer el texto completo y traer por escrito o en un
diagrama el planteamiento del experimento a realizar.

Es obligatorio el asistir con bata y lentes de seguridad.

Prohibido comer, fumar, beber y masticar chicle.

Usar guantes de ltex desechables y cubre boca cuando se trabaje con muestras
biolgicas y/o material patolgico.

Se debe de informar inmediatamente al profesor o al tcnico cualquier accidente que
ocurra durante la prctica.

Los remanentes de reactivos utilizados no deben regresarse a los envases originales, y
deben manejarse con pipetas y esptulas limpias.

La mayora de los disolventes orgnicos son voltiles e inflamables, al trabajar con ellos
deber hacerse en lugares ventilados y nunca cerca de la flama. Los recipientes que los
contienen deben mantenerse cerrados, en lugares frescos y secos.

Nunca debern efectuarse experimentos no descritos en la prctica.

Salvo indicaciones precisas, nunca tape un tubo de ensaye con el dedo.

Si es necesario inhalar algn gas se provocar una corriente de aire con la mano entre la
boca del recipiente y la nariz.

No deber verterse nunca agua a los cidos, sino al contrario, teniendo precaucin,
asimismo deber tenerse mucho cuidado cuando se vierta amoniaco a un lquido caliente,
a un cido concentrado a una base fuerte y viceversa.

Al terminar cualquier experimento el profesor o el tcnico indicarn donde se deben de
colocar los residuos.

Siempre consulte al instructor para aclarar cualquier duda.

Al retirarse del laboratorio dejar su lugar de trabajo limpio.












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OBJETIVO GENERAL

El alumno adquirir los conocimientos, habilidades y actitudes necesarias para un
desempeo adecuado en el laboratorio.





METODOLOGIA

Al inicio del semestre el alumno recibe el manual de laboratorio.

Los alumnos trabajan en equipo; todos debern participar en la realizacin de la prctica.
Al finalizar la prctica, se analizarn y discutirn los resultados obtenidos.

Una semana despus de concluida la prctica, el alumno entregar un reporte que deber
contener:
Presentacin 5%
Objetivos 5%
Introduccin 5%
Planteamiento 10%
Resultados 10%
Discusin de Resultados 25%
Cuestionario 10%
Conclusiones 25%
Bibliografa 5%

Para la elaboracin del reporte, el alumno deber consultar al menos dos fuentes de
informacin bibliogrfica, y cuando menos una de ellas deber ser un libro.



CRITERIOS DE EVALUACION

Los requisitos que debe reunir el alumno para poder aprobar el laboratorio son los
siguientes:

Asistencia al 80% de las sesiones - Derecho a calificacin

Valoracin previa a cada prctica - Derecho a entrar a la prctica

Entrega puntual de reportes - 75% de la calificacin final

Evaluacin final - 15% de la calificacin final

Participacin y trabajo en el laboratorio - 10% de la calificacin final










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INDICE



No. NOMBRE DE LA PRACTICA PAG.
1 Uso del material de laboratorio 4
2 Preparacin de soluciones 6
3 Fragilidad osmtica de eritrocitos 12
4 Medicin de la actividad del in hidrgeno en soluciones acuosas 14
5 Titulacin cido base y determinacin de acidez en la leche 21
6 Preparacin de un Buffer y su accin amortiguadora 24
7 Propiedades qumicas de carbohidratos 27
8 Preparacin de una curva patrn de glucosa 29
9 Separacin de aminocidos por cromatografa en papel 31
10 Examen qumico de orina 33
11 Determinacin de protenas por el mtodo de Biuret 39
12 Determinacin cuantitativa de la actividad de amilasa en lquidos biolgicos 41
13 Anlisis de lpidos 43




































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PRACTICA No. 1

USO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO:

1.- Conocer el material ms utilizado en el laboratorio de Bioqumica
2.- Desarrollar las habilidades necesarias para pesar, pipetear y titular con precisin.


INTRODUCCION:

Existe gran variedad en lo que a material de laboratorio se refiere debido a la diversidad de
necesidades en la practica y experimentos de laboratorio. El material de vidrio esta elaborado con
vidrio de borosilicato que resiste las altas y bajas temperaturas (no cambios bruscos de
temperatura), es fcil de desinfectar, inerte y principalmente muy frgil. Adems se requiere de
material de porcelana, aluminio, plstico, etctera, que sirve para cubrir una amplia gama de usos.

El laboratorio es donde se desarrollan las ciencias experimentales, est provisto de
instalaciones especiales, materiales, aparatos, recipientes y elementos indispensables, donde se
puede llevar a la practica lo visto en teora. El llevar a cabo experimentos en laboratorio permite la
comprensin y entendimiento de los fenmenos y los hechos que se dan en la naturaleza.

Entre las sustancias delicadas se encuentran los cidos y las bases, que deben de ser
manipulados con mucho cuidado, el alumno debe de seguir las indicaciones que el maestro seale,
as como tener un comportamiento cuidadoso y de disciplina mientras permanezca en el
laboratorio. Si no se tienen los suficientes cuidados se pueden tener accidentes en el laboratorio
que pueden manifestarse como lesiones el alumno o dao al material. Para evitar peligros en el
laboratorio es necesario evitar:

a) Incendio o explosin al utilizar solventes inflamables.
b) El uso de reactivos venenosos, corrosivos o custicos.
c) Quemadura y escaldaduras, incluyendo las provocadas por choque elctrico.
d) Laceraciones provocadas por vidriera rota, cuchillas, navajas, etc.
e) Peligros por agentes reactivos, mutagnicos y /o cancergenos.

Es importante que cada estudiante ejecute todos los experimentos por si mismo, es decir que
tenga una participacin en la practica.
La limpieza es esencial en todo trabajo bioqumico, por lo tanto todas las precauciones que se
tomen en un anlisis cualitativo y cuantitativo deber ser tomado en este curso. Frecuentemente,
restos de algn compuesto qumico en el material de laboratorio dan resultados errneos en el
experimento que se esta realizando, por lo tanto, todo el material de vidrio deber lavarse despus
de ser utilizado. Todo material biolgico deber ser desechado de acuerdo a las especificaciones
especiales que les sean dadas por el maestro o instructor de laboratorio tan pronto se haya
terminado de usar. Adems las mesas debern limpiarse antes y despus de llevar a cavo la
practica.
En las tarjas no debern ser arrojados papel filtro, vidrio o material parcialmente insoluble. Cuando
se tenga duda de cmo desechar un material, se debe de preguntar al maestro de laboratorio o al
instructor. Los mecheros deben de apagarse si no se estn utilizando.








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MATERIAL: REACTIVOS:
Balanza Agua
Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Sacarosa
Bureta cloruro de sodio
Soporte
Pinzas para bureta
Vasos de precipitado
Esptula
Matraz Erlenmeyer


METODO:

1. Pipetear distintos volmenes, utilizando la pipeta adecuada, hasta dominar la tcnica.
2. Pesar distintas sustancias, tomando en consideracin la tara.
3. Titular repetidamente hasta lograr un control de la tcnica.


CUESTIONARIO:

1. De la siguiente lista de materiales entregar: Esquema y utilidad de:

Material de vidrio.

Varilla.
Agitador.
Pipetas.
Tubos de ensaye.
Vasos de precipitado.
Matraces.
Probetas.
Refrigerantes.
Vidrio de reloj.
Otros.

Material de porcelana.

Cpsula.
Crisol
Mortero.
Embudo Bucher.
Otros.

Otros materiales.

Conexiones.
Mangueras de hule.
Tubos de vidrio.
Soporte



Aparatos:

Balanza.
Centrfuga.
Estufa.
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PRACTICA No. 2
PREPARACIN DE SOLUCIONES


OBJETIVO:
Al finalizar la prctica el alumno sera capaz de:
1.- Definira: molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad.
2.- Preparar los tipos de soluciones ms frecuentemente empleadas en el laboratorio de
bioqumica.


INTRODUCCIN:

En la naturaleza encontramos dos clases de substancias puras: los elementos y los
compuestos; las dems son mezclas. Una mezcla consiste en dos o ms substancias puras,
separables por medios fsicos. Su composicin es variable y sus propiedades dependen de sta y
de las propiedades de las substancias que forman parte de ella.

Las mezclas son de dos tipos: heterogneas y homogneas. Una mezcla heterognea no
es completamente uniforme y sus componentes son distinguibles, en ocasiones a simple vista
(ejemplo: una mezcla de azcar y arena). Una mezcla homognea tiene apariencia uniforme; las
llamadas soluciones son ejemplos de mezclas homogneas.

De acuerdo a su estado fsico las soluciones se clasifican en gaseosas, lquidas y slidas.
Las soluciones lquidas son las ms comunes y, tal vez, las ms importantes para el qumico.

Generalmente se llama disolvente al componente de una solucin que se encuentra en
mayor cantidad; los otros componentes se llaman solutos.

El agua es la molcula ms abundante en los sistemas vivientes y de ah la importancia de
abordar el estudio de las soluciones acuosas en un curso de Bioqumica.

Maneras de expresar la concentracin

A. El mol.

Nos ocuparemos en primer lugar del mol. La razn de su existencia es que los tomos de
los diferentes elementos no tienen la misma masa.
Para expresar la masa de los tomos se recurre a una unidad que no es el gramo ni el
miligramo, sino que es la masa de uno de ellos: el tomo de hidrgeno por ser el ms sencillo. A su
masa se le da el valor convencional de 1 (uno). Las masas relativas de los dems elementos son
mltiples de este nmero; as, la masa del tomo de sodio es 23 veces la del tomo de hidrgeno;
la del cloro, 35.5 veces la del hidrgeno, etc. A estas cifras, por referirse a relaciones de masa
entre los tomos, se les denomina masas atmicas.

Teniendo presente esta relacin constante entre las masas de los diferentes tomos, se
pueden utilizar cualquiera de las habituales unidades de masa ya que siempre que mantengamos
dicha proporcin de 1 para el hidrgeno por 39 para el potasio estaremos poniendo en contacto el
mismo nmero de tomos. As, 1 kilogramo de hidrgeno tendr el mismo nmero de tomos que
23 kilogramos de sodio o que 39 kilogramos de potasio o que 35.5 kilogramos de cloro. Lo mismo
se puede afirmar de 1 gramo de hidrgeno con respecto a 23 gramos de sodio, o de 39 miligramos
de potasio con respecto a 35.5 miligramos de cloro. De todas estas unidades, la perteneciente al
Sistema Internacional de unidades es el gramo y por ello es la que debe utilizarse.

As pues, un tomo-gramo es la masa atmica expresada en gramos. Por ello se tiene que
un tomo-gramo de hidrgeno es 1 gramo de hidrgeno; un tomo-gramo de sodio son 23 gramos
de sodio; un tomo-gramo de potasio son 39 gramos de potasio; y, un tomo-gramo de cloro son
35.5 gramos de cloro.
8
Ahora bien, los tomos se unen para formar molculas. Por ejemplo, el carbono, el oxgeno
y el hidrgeno se unen para formar, entre otras sustancias, glucosa (frmula: C
6
H
12
O
6
). La masa
molecular de la glucosa es la suma de las masas de los tomos constituyentes, a
saber:(12x6)+(1x12)+(16x6) = 72+12+96 = 180. Esta masa puede ser expresada en gramos y, si
cuando se habla de tomos se le llamaba tomo-gramo, cuando se refiere a molculas, se le
denomina molcula-gramo o mol. Por el mismo razonamiento se podra hablar de in-gramo.

Todas las molculas-gramo tendrn el mismo nmero de molculas y as se cuenta con
una unidad que expresa la proporcin de molculas en una sustancia. En consecuencia, como la
masa molecular de la glucosa es 180, un mol de glucosa pesa 180 gramos, 2 moles de glucosa
pesan 360 gramos, etc.

Se puede establecer la frmula siguiente:

MASA EN GRAMOS = MASA MOLECULAR x NMERO DE MOLES

y, despejando:

NMERO DE MOLES = MASA EN GRAMOS/ MASA MOLECULAR

Para usos biolgicos la unidad mol es muy grande y entonces se utiliza el milimol (mmol),
unidad mil veces menor. Por lo tanto, un milimol es igual a la masa molecular expresado en
miligramos. As,

NMERO DE MILIMOLES = MASA EN MILIGRAMOS/ MASA MOLECULAR

Comprendidos los conceptos anteriores, se puede pasar a definir qu es una solucin
molar.

B. Soluciones molares (M).

La molaridad de una solucin expresa el nmero de moles de soluto presentes en un litro
de solucin final. Esto quiere decir que si se disuelven en agua 1 mol de glucosa (180 gramos) y se
aade agua suficiente ("se afora") hasta completar un litro, se obtiene una solucin molar (1.0M) de
glucosa.

Para ilustrar ms este punto, supongamos que se quieren preparar 500 mililitros de una
solucin 0.4 M de cloruro de sodio (NaCl). Cuantos gramos de NaCl deben prepararse, sabiendo
que la masa "molecular" de la sal es de 58.5? El problema puede abordarse siguiendo este
razonamiento: si 1 litro de solucin 1.0 M contiene 58.5 gramos de NaCl y 1 litro de solucin 0.4 M
contiene x gramos de NaCl, entonces x = (0.4)(58.5)/1 = 23.4g de NaCl.

Estos 23.4 gramos de NaCl sirven para preparar 1 litro (1000 ml) de solucin; pero
solamente se requiere 0.5 litro (500 ml). Entonces, como 1 litro de solucin 0.4M contiene 23.4
gramos de NaCl , 0.5 litro de solucin 0.4 M contiene x gramos de NaCl, esto es, x =
(0.5)(23.4)/1 = 11.7 gramos de NaCl. Por lo tanto, se requieren 11.7 gramos de NaCl y disolverlos
en agua hasta completar un volumen de 0.5 litro (500 ml).

En el ejemplo anterior, como se pudo ver, se multiplic la molaridad del problema (0.4) por
la masa "molecular" (peso frmula) del NaCl (58.5) y por el volumen del problema (0.5 litro).
Posteriormente se dividi entre 1 litro.

Simplificando el procedimiento, se puede aplicar la frmula siguiente:

GRAMOS REQUERIDOS DE LA SUSTANCIA = MOLARIDAD X PESO MOLEC. X VOLUMEN
(en litros).

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C. El equivalente (Eq).

Desde el punto de vista electroqumico existen dos clases de substancias: unas, que al
estar en solucin permiten el paso de la corriente elctrica, reciben el nombre de electrolitos; las
otras, que no lo permiten, son llamadas no electrolitos. Ejemplos de electrolitos son el cloruro de
sodio, el fosfato de potasio, etc. La glucosa y la urea son ejemplos de no electrolitos.
Se sabe que una propiedad de los tomos es la de poderse combinar. En trminos
qumicos esta capacidad de combinacin se denomina valencia.

La valencia no guarda relacin con la masa atmica, sino con el nmero de electrones
combinables; en otras palabras, existen tomos con gran poder combinatorio cuya masa ("peso
atmico") es menor que la de otros tomos con valencia menor. Por ejemplo, el sodio tiene un
peso atmico de 23 y una valencia de 1; el oxigeno tiene un peso atmico de 16 y una valencia de
2; el carbono tiene un peso atmico de 12 y una valencia de 4, etc.

Se requiere, pues, contar con una unidad que evite la dificultad de que los tomos no
tengan la misma masa y que permita comparar "actividades" (cargas) por nmero y no por peso.
Por ejemplo, si se tratara de un regimiento de soldados, se hablara del nmero de soldados y no
del peso corporal del pelotn. Pero esto no es todo: los soldados pueden estar armados de manera
diferente, valer cada uno por dos o tres, y es esta razn del valor diferente, de diferente valencia o
actividad qumica la que lleva a la introduccin de una nueva unidad: el equivalente (Eq).

Se entiende por equivalente qumico el peso atmico o molecular de una sustancia,
expresado en gramos, y dividido entre su valencia: equivalente (Eq) = masa/ valencia

Por tratarse de una unidad demasiado grande para usos biolgicos, se utiliza una unidad
1000 veces menor: el miliequivalente (mEq). Otra comparacin que ayuda a ilustrar la importancia
de determinar equivalentes en lugar de gramos es la siguiente: si se invita a una fiesta 1000 Kg. de
nios y 1000 Kg. de nias, no se puede estar seguro de que se invit a cantidades equivalentes de
nios y nias. Pero si se invita a 10 nios y a 10 nias sin tener en cuenta su peso, se puede tener
la seguridad de que en la fiesta la cantidad de nios ser equivalente a la de las nias.

Si se considera que la actividad fisiolgica y qumica es proporcional a la cantidad de
partculas por unidad de volumen (moles o mili moles por litro), y ms directamente al total de
cargas elctricas por unidad de volumen (equivalentes o mili equivalentes por litro), con esta ltima
unidad se puede tener una mejor idea de la verdadera accin qumica que tienen los iones en el
organismo. Por ejemplo, en el suero existen 3.65 g de Cl
-
por litro y 3,25 g de Na
+
por litro, y en
apariencia hay un mayor nmero de iones Cl
-
que de iones Na
+
; sin embargo, si se toma en cuenta
que la masa de un in Cl
-
es mayor que la de un in Na
+
, se puede sospechar que en el suero
existe una menor accin qumica del primero que del segundo. Expresado en mili equivalentes ya
se expresa esta diferencia, puesto que hay 103 mEq de Cl
-
por 142 de Na
+
.

Para obtener la actividad qumica se divide la cantidad necesaria de sustancia (en gramos)
entre la valencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta ambas caractersticas de peso y valencia, se
puede generalizar el concepto para todos los elementos, diciendo que las cantidades que
representan la masa atmica ("peso atmico") dividido por su valencia, son qumicamente
equivalentes. As, 1 gramo de H/1 = 1 g; 23 gramos de Na /1 = 23 g; 39 gramos de K/1 = 39 g; 40
gramos de Ca /2 = 20 g; 16 gramos de O/2 = 8 g; y, 12 gramos de C/4 = 3 g, son equivalentes; en
otras palabras, qumicamente valen igual y son capaces de neutralizarse exactamente. De lo
expuesto se deduce que es fcil convertir gramos en equivalentes y viceversa.

Si se quiere saber cuntos equivalentes son 69 gramos de Na, como el peso atmico de
Na = 23 y un equivalente de Na = peso atmico en gramos/ valencia = 23 g/1 = 23 gramos de Na,
entonces, 3 equivalentes tienen (3)(23) = 69 gramos de Na.

Si se quiere saber cuntos mEq son 69 gramos de Ca, dado que el peso atmico de Ca =
40 y un equivalente de Ca = (peso atmico en gramos)/valencia = 40 g/2 = 20 gramos de Ca,
entonces 69 gramos de Ca son
x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq.
10
Soluciones normales (N).

La normalidad de una solucin expresa el nmero de equivalentes de soluto presentes en
un litro de solucin final. Por ejemplo, si se disuelve en agua destilada el peso equivalente de una
sustancia, a completar 1 litro (1000 ml), se habr preparado un litro de una solucin 1 Normal (1 N).
Como se recordar, la frmula utilizada para calcular la cantidad de sustancia necesaria
para preparar cualquier volumen de una solucin de molaridad determinada es:

VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen se expresa en litros y,

VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen es expresado en mililitros.

Para calcular la cantidad en gramos de una sustancia, necesaria para preparar un volumen
determinado de una solucin de cierta normalidad, se pueden usar las frmulas siguientes:

VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen se expresa en litros, y

VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen ha sido expresado en mililitros.

Ejemplo: Preparar 300 ml de una solucin 0.1 N de cloruro de calcio (CaCl
2
).
Volumen = 300 ml Normalidad = 0.1 N
Equivalente del CaCl
2
:
Peso atmico de Ca = 40; peso atmico de Cl = 35.5 x 2 (en CaCl
2
) = 71.0; peso frmula = 40 + 71
= 111.
Valencia (capacidad de combinacin) = 2.
Peso equivalente = 111 g/2 = 55.5 gramos
Substituyendo en la frmula:
gramos de CaCl
2
= 300 x 55.5 x 0.1/1000 = 1.665
Resultado: Se necesitan 1.665 g de CaCl
2
para preparar 300 ml de una solucin 0.1N .

D. Soluciones porcentuales (%).

En las soluciones, el soluto puede encontrarse a diferentes diluciones en relacin con el
solvente. Es por ello que se recurre a una terminologa especial que indica la cantidad de soluto
presente en relacin al volumen total de la solucin. Dicha relacin se puede expresar de varias
maneras, una de las cuales son las llamadas soluciones porcentuales. Este porcentaje puede ser:
de volumen en volumen (v/ v), de peso en peso (p /p) y de peso en volumen (p /v).

1. De volumen en volumen.

En general se emplea para soluciones de lquido en lquido. Por ejemplo: soluciones de
etanol en agua, ambos son lquidos.

Para preparar una solucin porcentual se considera que las substancias "qumicamente
puras" estn formadas slo por soluto; es decir, estn al 100%. Para fines prcticos se usan 100 ml
como volumen total de solucin; la cantidad de mililitros de soluto empleados en dicha dilucin
(v/v), es expresa en forma porcentual. As, si se tiene una solucin de etanol al 96% (v /v), quiere
decir que por cada 100 ml de solucin total, 96 ml corresponden al soluto (alcohol qumicamente
puro) y el resto, al agua u otro solvente empleado.

Ejemplo: se desea preparar una solucin de fenolftaleina al 0.5% (v/ v) en alcohol al 96%.
En este caso el soluto es la fenolftaleina, y el solvente el alcohol (etanol) al 96%.

11
Si slo se cuenta con alcohol qumicamente puro (al 100%), se debe preparar primero una
solucin de alcohol al 96% (v/v). El mtodo a seguir es el siguiente: en una probeta de 100 ml se
vierten 96 ml de alcohol absoluto (100%); posteriormente se aade agua destilada suficiente para
completar los 100 ml. Es necesario que el procedimiento se haga en el orden mencionado para que
sea exacto: primero el alcohol y luego el agua. A primera vista, parecera lo mismo aadir primero 4
ml de agua y a continuacin 96 ml de alcohol absoluto, obteniendo de este modo 4 + 96 = 100 ml
de solucin. Sin embargo, hay que considerar que puede haber un margen de error, ya que se trata
de dos lquidos cuya densidad es diferente: las molculas de alcohol no mantienen la misma
"distancia" entre ellas cuando el alcohol es qumicamente puro que cuando se encuentra mezclado
con agua. Esta pequea diferencia puede alterar el volumen final de solucin (100 ml).

Una vez preparada la solucin de alcohol al 96%, se procede a preparar la solucin de
fenolftalena al 0.5% (v/ v). En una probeta de 100 ml se coloca 0.5 ml de fenolftalena, aadiendo
posteriormente la cantidad necesaria de alcohol al 96% para completar el volumen de 100 ml.

Es importante insistir que los trminos porcentuales expresan siempre una relacin; es
decir, se pueden variar los volmenes siempre y cuando no se pierda dicha relacin.

Por ejemplo, si en lugar de 100 ml de la mencionada solucin de fenolftalena al 0.5% (v /v)
en alcohol al 96%, slo se deseasen preparar 25 ml, se sigue el planteamiento siguiente: como 100
ml de solucin contienen 0.5 ml de fenolftalena, entonces 25 ml de solucin contienen x ml de
fenolftalena, por lo que:
x = 25 x 0.5/100 = 0.125 ml de fenolftalena
Resultado: se necesita 0.125 ml de fenolftalena, y suficiente alcohol al 96% para completar un
volumen de 25 ml.

El alcohol etlico comn tiene 96% de pureza (v /v ). Por lo tanto, si no se cuenta con
alcohol puro y se quiere preparar una solucin de alcohol al 24%, el planteamiento es como sigue:
como 100 ml de solucin contienen 96 ml de alcohol puro y x ml de solucin contienen 24 ml de
alcohol puro, entonces:
x = 24 x 100/96 = 25 ml de alcohol al 96% (v/ v)
Resultado: Se necesitan 25 ml de solucin de alcohol al 96% y completar con agua un volumen de
100 ml.

Si tan solo se desean 50 ml de esta nueva solucin: como 100 ml de alcohol al 24% tienen
25 ml de alcohol al 96%, entonces 50 ml de alcohol al 24% tienen x ml de alcohol al 96%,

x = 50 x 25/100 = 12.5 ml de alcohol al 96%

Resultado: Se requieren 12.5 ml de alcohol al 96% y completar con agua destilada un volumen final
de 50 ml.

2. De peso en volumen (p /v).

Expresa el nmero de gramos de soluto en 100 ml de la solucin final, independientemente
de la naturaleza del solvente. Son las ms comnmente utilizadas en los laboratorios de
Bioqumica.

3. De peso en peso (p /p).

Expresa el nmero de gramos de soluto en 100 gramos de la solucin final. Generalmente
estas soluciones no se preparan en los laboratorios convencionales, pero conviene conocerlas ya
que muchos reactivos comerciales son envasados como soluciones porcentuales de peso en peso.
Por ejemplo, los cidos clorhdrico, sulfrico, etc. son envasados de esta manera. As, para al cido
clorhdrico (HCl) al 37% (p /p) en cada 100 gramos de solucin, 37 gramos son de HCl puro.




12
E. Soluciones molales (m).

Una solucin molal es la que contiene el peso molecular de una sustancia en 1000 gramos
de solvente; es decir, la cantidad de solvente es fija y a ella se agrega la sustancia por disolver. Por
ejemplo, una solucin 1 molal (1 m) de glucosa, cuyo peso molecular es de 180, se prepara
agregando a 1000 g de agua, 180 g de glucosa.

MATERIAL: REACTIVOS:
Balanza Agua
Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Sacarosa
Vasos de precipitado 50 y 100 ml Cloruro de sodio
Esptula Etanol
Matraces aforados 50 y 100 ml cido clorhdrico
cido sulfrico

METODO:

Preparacin de soluciones

A. Soluciones porcentuales (%).

Material: cloruro de sodio (NaCl); sacarosa (C
11
H
22
OH
10
); agua destilada.

Procedimientos:
a. Preparar 50 ml de solucin de cloruro de sodio al 10% (p /v).
b. A partir de la solucin de cloruro de sodio al 10%, preparar 100 ml de una solucin
salina al 1%.
c. A partir de una solucin de etanol al 96% (v /v), preparar 50 mililitros de una solucin
de etanol al 18 % (v/ v) en agua.

B. Soluciones molares.

Material: cloruro de sodio; agua destilada, cido sulfrico (H
2
SO
4
), cido clorhdrico (HCl).
Procedimientos:
Preparar 100 ml de una solucin de cloruro de sodio 0.5M.
a. A partir de la solucin anterior, preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cloruro de
sodio.
b. Preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cido clorhdrico.
c. Preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cido sulfrico.

C. Soluciones normales

Material: cloruro de sodio; agua destilada, cido sulfrico (H
2
SO
4
), cido clorhdrico (HCl).
Procedimiento:
a. Preparar 50 ml de una solucin de NaCl 0.4 N
b. Prepare 50 ml de los reactivos restantes a una concentracin 0.4 N.

D. Soluciones molales.

Material: sacarosa; agua destilada.
Procedimiento: Preparar 100 ml de una solucin de sacarosa 0.5 molal.


CUESTIONARIO:


Defina los siguientes trminos: mol, equivalente qumico, normalidad, molaridad, molalidad,
solucin porcentual p/ p, solucin porcentual p/ v, solucin porcentual v/ v.

13

PRACTICA NO. 3
FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS

OBJETIVO:

El alumno efectuar e interpretar la prueba de fragilidad osmtica de los eritrocitos frente
a soluciones salinas hipotnicas.

INTRODUCCIN:

La osmolaridad del plasma sanguneo oscila normalmente entre 290 a 310 miliosmolas por
litro. Una solucin con esta osmolaridad es isotnica con respecto al plasma y recibe el nombre de
solucin fisiolgica.

Ejemplo: Una solucin de cloruro de sodio al 0.8 por ciento (p/v) y una solucin de glucosa
al 5 por ciento (p/v) son isotnicas con respecto al plasma y, por lo tanto, son soluciones
fisiolgicas.

Las soluciones que contienen mayor nmero de osmolas por litro que el plasma son
hipertnicas, en tanto que las que tienen menor nmero de osmolas son hipotnicas.

Cuando se depositan glbulos rojos en una solucin isotnica al plasma, no sufren
cambios en su volumen y contenidos; en cambio, si se colocan glbulos rojos en una solucin
hipertnica, sale agua del interior celular. Por otra parte, al poner en contacto glbulos rojos con
una solucin hipotnica o, en un caso extremo, con agua destilada, el agua penetra al interior de
las clulas.

Una anemia hemoltica es el resultado de una elevada tendencia a la destruccin de los
glbulos rojos; la clasificacin de este tipo de anemias se basa en la identificacin del factor
causante de la hemlisis, el cual puede ser de naturaleza hereditaria (factor intracorpuscular) o
adquirida (factor extracorpuscular).

Se ha estudiado el lmite de tonicidad de los eritrocitos y se ha visto que la fragilidad
osmtica est aumentada en la esferocitosis hereditaria, en algunas ocasiones en la enfermedad
hemoltica autoinmune, en la enfermedad hemoltica del recin nacido (por anticuerpos anti-A y,
con menos frecuencia, por anticuerpos anti-Rh) y en la anemia hemoltica por envenenamiento
qumico o por quemaduras graves. Por el otro lado, se ha observado una menor fragilidad osmtica
de los eritrocitos en la talasemia, en la anemia de clulas falciformes (drepanocitosis) y en
trastornos en los que aparecen eritrocitos de escaso espesor (dianocitos o clulas en blanco de
tiro).

MATERIAL: REACTIVOS:
Tubos de ensayo de 5 ml Tubo con Heprina sdica
Gradilla NaCl 0.5% (p/v)
Pipetas de 1 y 5 ml Agua destilada
Jeringa
Torunda
Torniquete
Guantes desechables
Parafilm



14
METODO:
1.- Obtener por puncin venosa sangre heparinizada (10 ml).
2.- Montar una serie de tubos como se indica en la tabla siguiente:

Tubo NaCl 0.5%
(ml)
Agua destilada
(ml)
Sangre completa
(ml)
Con
(%)
1 2.5 0.0 0.05 0.50
2 2.4 0.1 0.05 0.48
3 2.3 0.2 0.05 0.46
4 2.2 0.3 0.05 0.44
5 2.1 0.4 0.05 0.42
6 2.0 0.5 0.05 0.40
7 1.9 0.6 0.05 0.38
8 1.8 0.7 0.05 0.36
9 1.7 0.8 0.05 0.34
10 1.6 0.9 0.05 0.32
11 1.5 1.0 0.05 0.30
12 1.4 1.1 0.05 0.28

3.- Tapar cada tubo. Agitar suavemente por inversin.
4.- Dejar reposar durante 1 a 2 horas, observando cada 30 minutos. Importante: no mover la
gradilla.
5.- Se debe tener cuidado de no agitar los tubos para poder observar si en el sobrenadante hay
hemlisis. Anotar en qu tubo se inicia sta y en cul es total



INTERPRETACIN

Normal: Inicio de hemlisis........................... 0.44 a 0.38%
Hemlisis total................................. 0.34 a 0.30%

CUESTIONARIO:
Defina los trminos siguientes:
a) osmolaridad
b) smosis
c) solucin isotnica
d) solucin hipertnica
e) solucin hipotnica
f) fragilidad osmtica, anemia
g) anemia hemoltica,
h) anemia auto inmune,
i) talasemia,
j) drepanocitosis,
k) dianocito.

15


PRACTICA NO. 4

MEDICION DE LA ACTIVIDAD DEL ION HIDROGENO EN
SOLUCIONES ACUOSAS



OBJETIVO:
1.-Conocer y aplicar algunos mtodos para la determinacin de pH.
2.- Determinar el pH de varias sustancias problemas.


INTRODUCCIN:

CONCEPTO DE pH

Para poder comprender qu es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales
como: cido, base, disociacin, ionizacin y concentracin. Por otra parte, resulta indispensable
tener una idea precisa acerca de los logaritmos.

Disociacin. La disociacin es el proceso de separacin de uno o ms elementos de una
molcula compuesta, que da como resultado fragmentos ms simples: tomos, radicales libres,
iones.
En los sistemas biolgicos, el agua es el solvente en el que se encuentran disueltos los
compuestos disociados. Cuando una molcula se separa dando iones positivos (cationes) e iones
negativos (aniones), el proceso de disociacin puede ser tambin llamado ionizacin.

cido y base. Se define como cido a una sustancia capaz de ceder protones (H
+
) en solu-
cin. El grado de acidez depender del nmero de protones o hidrogeniones libres.

En general, se consideran dos tipos de cidos: fuertes y dbiles. Un cido fuerte es el que
se disocia casi por completo y, por tanto, deja libres a prcticamente todos los hidrogeniones que
posee. Un cido dbil es aqul que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayora de los
protones se encuentran unidos al anin (base conjugada) y slo una pequea proporcin de ellos
estn libres.

Una base o lcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz
de incrementar la concentracin de iones oxhidrilo (OH
-
) en solucin.

Los cidos y las bases se neutralizan mutuamente, molcula a molcula, ya que las bases
aceptan los protones de los cidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece
un equilibrio entre las cargas del cido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones
libres.

Las substancias que pueden actuar indistintamente como cidos o como bases son
conocidas como anfotricas.

Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una
sustancia, se ide una escala basada en la concentracin de hidrogeniones libres obtenidos por la
disociacin del agua. La cantidad de molculas de agua disociadas puede variar conforme a su pu-
reza y a la temperatura, pero la relacin entre la concentracin de molculas de agua disociadas y
la concentracin de molculas de agua no disociadas permanece constante. A esta constante se le
denomina constante de disociacin del agua (K
D
).

K
D
= [H
+
][ OH
-
]/[H
2
O] (1)

16
El agua pura, a 25 C, tiene una [H
+
] = [OH
-
] = 1.0 x 10
-7
M. La [H
2
O] = 55.555 M. y, para
fines prcticos, se puede considerar que permanece constante ante el evento de disociacin. Por lo
tanto, la ecuacin (1) puede rearreglarse definiendo una nueva constante, la K
W
o constante del
producto inico del agua, la cual tiene un valor numrico, a 25 C, de 1.0 x 10
-14
(por qu?).

[H
2
O] K
D
= K
W
= [H
+
][ OH
-
] = 1.0 x 10
-14
(2)

El dans Srensen invent una manera abreviada para referirse a la concentracin de protones
libres en solucin, que denomin pH, el cual se define como:

pH = log 1/[ H
+
] = - log [H
+
] (3)

De manera anloga, podra definirse pOH como:

pOH = log 1/[ OH
-
] = - log [OH
-
] (4)


Generalizando, pK = log 1/K = - log K (5)


As pues, el pH del agua pura a 25 C es igual a 7, y el pOH = 7.0 (por qu?).

Si se aplican logaritmos negativos a cada uno de los miembros de la ecuacin (2), se obtiene la
relacin siguiente:
pKw = pH + pOH = 14 (6)
En consecuencia, el valor mnimo de pH es 0 y su valor mximo es 14. Asimismo, pOH
puede tener un valor mnimo de 0 y un valor mximo de 14. De la ecuacin (6) tambin se deduce
que al aumentar el valor de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa.

Es c al a de pH.

[
H
+
] pH pOH [OH

]
1 0 14
1 x 10
-14

1 x 10
-1

1 13
1 x 10
-13

1 x 10
-2

2 12
1 x 10
-12

1 x 10
-3

3 11
1 x 10
-11

1 x 10
-4

4 10
1 x 10
-10

1 x 10
-5

5 9
1 x 10
-9

1 x 10
-6

6 8
1 x 10
-8

1 x 10
-7

7 Sol. NEUTRA 7
1 x 10
-7

1 x 10
-8

8 6
1 x 10
-6

1 x 10
-9

9 5
1 x 10
-5

1 x 10
-10

10 4
1 x 10
-4

1 x 10
-11

11 3
1 x 10
-3

1 x 10
-12

12 2
1 x 10
-2

1 x 10
-13

13 1
1 x 10
-1

1 x 10
-14

14 0 1
*Concentraciones en molas/litro a 25

C.

Se dice que el pH = 7 es neutro, ya que en dicha situacin [ H
+
] = [OH
-
]. Un pH menor que
7 es cido, pues predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que
7 es bsico o alcalino, ya que predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solucin.
17




INDICADORES DE pH

Existen varios colorantes orgnicos, sintticos o de origen natural, que cambian de color
cuando vara el pH de la solucin en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayora de los
cidos y las bases empleados en el laboratorio son incoloros, los indicadores son tiles al hacer
posible que los cambios de pH sean observables por las variaciones en la coloracin de las
soluciones.
Los indicadores de pH son usualmente cidos o bases dbiles. En el caso de un cido, su
disociacin puede representarse como sigue:

HInd H
+
+ Ind
-



Cuando se agrega una base a la forma cida del indicador (HInd), aqulla reacciona con l
para obtener la forma bsica del indicador (Ind
-
). Se forma de este modo un sistema amortiguador
y, por lo tanto, su pH se puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras.

En el caso de algunos indicadores, su color es determinado por la disociacin de la
sustancia, como sucede con el rojo de metilo. La forma cida (no disociada) es roja; la forma
bsica es amarilla. Dependiendo de la proporcin que guarden las concentraciones de ambas
formas, se pueden observar todas las tonalidades intermedias entre estos colores extremos. En
otros casos, como el de la fenolftaleina, una forma del indicador es incolora y la otra es coloreada.
El color final de la solucin depende de la cantidad presente de la forma coloreada.

Los indicadores pueden usarse para determinar el pH de alguna solucin, mediante la
comparacin entre el color del indicador en una solucin de pH conocido y el color del indicador en
la solucin problema.


ALGUNOS I NDI CADORES DE pH DE USO FRECUENTE

NOMBRE VULGAR pK COLOR Y ZONA TI L DE pH
Azul de timol 1.7 rojo 1.2 amarillo 2.8
Anaranjado de metilo 3.5 rojo 3.1 amarillo 4.4
Verde de bromocresol 4.7 amarillo 3.8 azul 5.5
Azul de bromofenol 4.0 amarillo 3.0 azul 4.6
Rojo de metilo 5.1 rojo 4.2 amarillo 6.3
Rojo de clorofenol 6.0 amarillo 5.1 rojo 6.7
Prpura de bromocresol 6.2 amarillo 5.4 prpura 7.0
Azul de bromotimol 7.0 amarillo 6.0 azul 7.6
Rojo de fenol 7.9 amarillo 6.8 rojo 8.4
Rojo de cresol 8.3 amarillo 7.2 rojo 8.8
Azul de timol 8.9 amarillo 8.0 azul 9.6
Fenolftalena 9.7 incoloro 8.3 rojo 10.0
Timolftalena 9.9 amarillo 9.3 azul 10.5
Rojo congo azul-rojo 3.0 violeta 5.2
Rojo de alizarina amarillo 3.7 rosa 4.2
Tornasol rojo 5.0 azul 8.0
Rojo neutro 6.85 amarillo 6.8 naranja 8.0




18


preparacion de una escala colorimtrica de pH mediante el uso de buffer estandar e indicadores

Este mtodo de estimar el pH se basa en el hecho de que un indicador cido-base, existe
en solucin como dos especies de diferente color en un intervalo de pH alrededor de su pKa.

Los indicadores son cidos dbiles cuyas formas no disociadas (Hind) y disociada (Ind)
tienen color diferente. Por medio de la preparacin de una serie de soluciones amortiguadoras
cuyos valores de pH son conocidos y se agrupan alrededor del pKa del cido indicador, y que
contienen la misma concentracin del mismo, se obtiene una escala colorida estndar en la que la
tonalidad de cada solucin depende de su valor de pH particularmente aadiendo la misma
concentracin de indicador que la presente en las soluciones estndar. El color de la solucin
problema es entonces comparado visualmente o colorimtricamente con los colores de la serie de
los buffers estndar. De esta manera es posible conocer el pH de una solucin con una
aproximacin de 0.2 unidades de pH.

Este procedimiento esta sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen protenas
muestran grandes variaciones de pH debido a que las protenas pueden unirse a una u otra forma
del indicador, por lo que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociacin. Un segundo
error es causado por la presencia de otras sustancias coloridas en la solucin. Este puede
cancelarse, si la interferencia no es muy grande, mediante el empleo de un tubo blanco de la
sustancia colorida en el que el indicador esta ausente.

Uso del potencimetro:

El pH es formalmente definido como el logaritmo negativo de la actividad del in hidrgeno.
Algunas aproximaciones a la verdadera actividad del in hidrgeno pueden ser medidas por medio
del electrodo de hidrogeno. Este consiste en un electrodo platinado sumergido en la solucin que
va a ser probada. Se hace pasar gas hidrogeno a travs de la solucin la media celda as formada
consiste de H
2
gaseoso en equilibrio con iones H
+
, generndose un potencial elctrico medible.

El potencial medido con un electrodo de hidrgeno, a una atmsfera de presin y en una
solucin que contiene la unidad de actividad del in hidrgeno, es considerado igual a cero a todas
las temperaturas. Este es el estndar. En ocasiones, el pH determinado con el electrodo de
hidrgeno es arbitrario, y se han adoptado algunas conversiones para la relacin entre el pH y el
potencial elctrico, de manera que los valores de pH determinados por otros procedimientos y en
diferentes laboratorios pueden ser comparados. En todos los casos, la solucin estndar usada
para relacionar el pH a la fuerza electromotriz deber especificarse.

Como el electrodo de hidrgeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que
contienen substancias reductoras, es necesario usar otro mtodo para dichas soluciones. Uno
conveniente emplea el electrodo de vidrio.

El electrodo de vidrio es una membrana delgada de un vidrio especial. Esta membrana
encierra una media celda delgada de plata-cloruro de plata (Ag -AgCl). La otra mitad de la celda es
un electrodo de calomel formado por cloruro de mercurio (HgCl
2
) sobre mercurio slido. En el
interior de la celda de vidrio que contiene el electrodo de calomel hay cido clorhdrico 0.1 M,
solucin que establece un pH constante y conocido en un lado de la membrana de vidrio. Un
puente de KCl conecta la solucin de pH desconocido con la media celda.






19

MATERIAL: REACTIVOS:
15 Tubos de ensayo de
CH
3
COOH 0.2 M.
Gradilla
CH
3
COONa 0.2 M.
2 Pipetas de 10 ml
KH
3
PO
4
0.1 M
4 pipetas de 5 ml
NaOH 0.1 M

cido brico-KCl 0.1 M

cido brico 0.1 N.

INDICADORES:

Anaranjado de metilo.

Rojo de metilo.

Azul de bromotimol .

Rojo de cresol.

Fenolftalena.

Azul de timol.

3 soluciones problema de pH desconocido.



METODO:

PREPARACION DE ESCALA COLORIMETRICA DE pH UTILIZANDO INDICADORES

1.- Para realizar la escala de pH en un rango de 3.6 - 10, se dividir el grupo en 3 equipos cada
uno de los equipos preparar una serie de pH, en donde tendrn once valores de pH diferentes,
a cada equipo corresponde preparar lo siguiente:

EQUIPO No. 1

No. DE TUBO pH A PREPARAR CH
3
COOH 0.2 M CH
3
COONa 0.2 M
1 3.6 9.3 ml 0.7 ml
2 3.8 8.8 ml 1.2 ml
3 4.0 8.2 ml 1.8 ml
4 4.2 7.3 ml 2.7 ml
5 4.4 6.3 ml 3.7 ml
6 4.6 5.1 ml 4.9 ml
7 4.8 4.0 ml 6.0 ml
8 5.0 2.9 ml 7.1 ml
9 5.2 2.1 ml 7.9 ml
10 5.4 1.4 ml 8.6 ml
11 5.6 0.9 ml 9.1 ml
ADICIONAR PRIMERO ADICIONAR
DESPUES

Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

A la primera serie de 5 tubos (tubos del 1 al 5) adicionar 5 gotas del indicador anaranjado
de metilo y agitar cada tubo. A los tubos 6 al 11 adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y
agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores
de pH obtenidos.

Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas.



20

EQUIPO No. 2

No. DE TUBO pH A PREPARAR KH
2
PO
4
0.1 M NaOH 0.1 M H
2
O DEST.
12 6.0 5 ml O.6 ml 4.4 ml
13 6.2 5 ml 0.8 ml 4.2 ml
14 6.4 5 ml 1.2 ml 3.8 ml
15 6.6 5 ml 1.7 ml 3.3 ml
16 6.8 5 ml 2.3 ml 2.7 ml
17 7.0 5 ml 2.9 m 2.1 ml
18 7.2 5 ml 3.4 ml 1.6 ml
19 7.4 5 ml 3.9 ml 1.1 ml
20 7.6 5 ml 4.2 ml 0.8 ml
21 7.8 5 ml 4.5 ml 0.5 ml
22 8.0 5 ml 4.6 ml 0.4 ml
ADICIONAR EN
1 LUGAR
ADICIONAR EN
2 LUGAR
ADICIONAR EN
3 LUGAR

Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:
A los tubos del 12 al 18 adicionar 5 gotas del indicador azul de bromotimol y del 19 al 22
rojo de cresol, y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada
uno de los valores de pH obtenidos.

Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas.

EQUIPO No. 3

No. DE TUBO pH A PREPARAR AC. BORICO-KCl
0.1 M
NaOH 0.1 M H
2
O DEST.
23 8.2 5 ml 0.6 ml 4.4 ml
24 8.4 5 ml 0.8 ml 4.2 ml
25 8.6 5 ml 1.2 ml 3.8 ml
26 8.8 5 ml 1.6 ml 3.4 ml
27 9.0 5 ml 2.1 ml 2.9 ml
28 9.2 5 ml 2.7 ml 2.3 ml
29 9.4 5 ml 3.2 ml 1.8 ml
30 9.6 5 ml 3.7 ml 1.3 ml
31 9.8 5 ml 4.1 ml 0.9 ml
32 10.0 5 ml 4.4 ml 0.6 ml
ADICIONAR EN
1 LUGAR
ADICIONAR EN
2 LUGAR
ADICIONAR EN
3 LUGAR


Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:
A los tubos del 23 al 26 adicionar 5 gotas del indicador azul de timol y agitar cada tubo. A los tubos
del 27 al 32 adicionar 5 gotas del indicador fenolftaleina y agitar los tubos. Observe los distintos
tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos.

Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas.

2.- Renanse los 3 equipos con la serie de tubos que prepararon para llevar a cabo la
comparacin visual de sus problemas.

21
3.- Determinar el pH de las tres soluciones problema por medio de comparacin visual.
Para determinar el pH tomar 10 ml de cada solucin, colocarlas en su respectivo tubo de ensaye y
agregar 5 gotas del indicador que se le indique. Comparar la coloracin de valor de pH medido con
el potencimetro para realizar la comparacin prctica.

Reportar los valores de pH obtenidos en la prctica y tericamente en una tabla.

PROBLEMA
SOLUCION DE: pH ESCALA
COLORIMETRICA
pH POTENCIOMETRO
1
2
3












TAREA: TRAER PARA LA PRCTICA SIGUIENTE MUESTRAS DE LECHE BRONCA Y DE
DISTINTAS MARCAS DE LECHE PASTEURIZADA Y ULTRAPASTEURIZADA.
































22

PRACTICA No 5

TITULACIN CIDO - BASE Y
DETERMINACIN DE LA ACIDEZ EN LA LECHE
OBJETIVOS:

Al trmino de la prctica el alumno ser capaz de:
1.- Determinar la normalidad aparente de un cido, titulndolo con una base cuya concentracin
es conocida.
2.- Determinara la acidez o alcalinidad de diferentes muestras de leche e indicar si la leche es
apta para consumo humano.


INTRODUCCIN.


La titulacin es un tipo de anlisis volumtrico mediante el cual se determina la
concentracin de una sustancia en solucin utilizando otra solucin cuya concentracin se conoce.

Titulacin cido-bsica: Una solucin conocida de una base puede utilizarse para
determinar la concentracin de un cido y viceversa. Como es sabido, los cidos y las bases se
neutralizan mutuamente: cido + base = sal + agua. Ejemplo: HCl + NaOH = NaCl + H
2
0.

Un mol de base neutraliza exactamente a un mol de cido, de tal manera que, conociendo
la concentracin y el volumen de base empleados para neutralizar un volumen conocido de un
cido, se puede calcular la concentracin del cido problema. Como no sera posible darse cuenta
de cmo ocurre esta reaccin y en cul momento se ha neutralizado por completo la solucin
problema (sa cuya concentracin se desconoce), se requiere el empleo de algo que posibilite su
observacin; por ejemplo, una sustancia que cambie de color al variar el pH de la solucin que la
contiene (indicador de pH).

La titulacin cido-bsica puede efectuarse de la manera siguiente: la solucin tipo o
estndar (solucin cuya concentracin se conoce) se coloca en una bureta. Al leer la graduacin
debe tomarse como referencia el nivel inferior del menisco (parte ms convexa) cuando se
emplean lquidos transparentes, y el nivel superior cuando se trata de lquidos opacos. El ojo del
observador debe estar al nivel del menisco para evitar errores de paralaje.

La solucin problema se coloca en un matraz Erlenmeyer. Se le aaden unas gotas de
indicador de pH, el cual le dar un color caracterstico. Por ejemplo, el rojo de fenol es de color
amarillo en solucin cida y de color rojo en solucin alcalina. As, si se tiene un cido fuerte cuya
concentracin se desconoce, se le agrega rojo de fenol y se aade gota a gota una solucin bsica
de concentracin conocida, llegar un momento en el que el color no ser amarillo ni rojo, sino un
color intermedio correspondiente a una solucin neutra.

La solucin tipo debe dejarse caer gota a gota sobre la solucin problema, al tiempo que se
agita el matraz. Es conveniente colocar debajo del matraz que contiene la solucin problema una
hoja de papel blanco, para observar el cambio de coloracin (punto de vire).

Acidez y pH. Existen dos maneras de expresar la acidez de una solucin. La primera es la
acidez total o titulable. La segunda es la concentracin de iones hidrgeno (H
+
) libres en solucin.
Por ejemplo, una solucin 1 N de cido benzoico tiene la misma acidez total que una de cido
clorhdrico 1 N, pero esta ltima tiene una concentracin de iones hidrgeno libres que es cerca de
100 veces ms grande que la primera (por qu?).

23
Srensen (1909) adopt el trmino pH como una medida de la concentracin de iones
hidrgeno y lo defini como el logaritmo (base 10) negativo de la concentracin de iones
hidrgeno, expresada en moles por litro: pH = log
10
1/[H
+
] = - log
10
[H
+
].

Clculos estequiomtricos. La unidad prctica usada en los clculos de estequiometra es
el miliequivalente (mEq: milsima parte de un equivalente). Un mililitro (ml) de una solucin 1 N
contiene un miliequivalente de soluto. Esta es una unidad prctica y conveniente ya que se puede
calcular el nmero de mili equivalentes de soluto en una solucin dada, multiplicando simplemente
su normalidad (mEq/ ml) por el volumen (en ml). Por ejemplo, 25.0 ml de NaOH 0.080 N contienen
25.0 x 0.080 = 2 mEq de NaOH.
Ya que un miliequivalente de cido equivale qumicamente a un miliequivalente de base, la
siguiente relacin resulta obvia:

Normalidad
1
x Volumen
1
= mEq = Normalidad
2
x Volumen
2

y en forma abreviada: N
1
x V
1
= N
2
x V
2
.

La ecuacin anterior puede utilizarse en la resolucin de problemas como el que a
continuacin se plantea: 25.0 ml de NaOH 0.080 N fueron neutralizados exactamente con 32.0 ml
de una solucin de HCl. Cul es la normalidad de la solucin de cido?

Dado que N
1
x V
1
= N
2
x V
2
, entonces N
1
= (N
2
x V
2
)/V
1
= (25.0 x 0.080)/32 = 0.0625 N


Determinacin de la Acidez de la Leche.


La prueba se basa en la saturacin de las funciones cidas de la leche mediante un lcali,
en presencia de un reactivo indicador cuyo color descubre el final de la reaccin.

Estequiometra. El nmero de mililitros (ml) gastados de NaOH 0.1 N se puede transformar
en partes de cido lctico por volumen de leche multiplicndolo por 0.009, factor que representa la
cantidad de cido neutralizada por un ml de sosa 0.1 N. Ejemplo: se gastaron 2.2 ml de
NaOH 10 N para titular 10 ml de leche. Entonces, la leche contiene 2.2 x 0.009 = 0.0198 partes de
cido Lctico 10 ml, o bien, 0.198 partes en 100 ml, o bien, 1.98 partes en 1,000 ml.

El Reglamento de la Secretara de Salud establece que la leche apta para su consumo
debe tener, en cuanto a acidez en cido lctico, no menos de 1.4 ni ms de 1.7 por mil.




METODOLOGA.

Experimento #1: Titulacin de un cido fuerte con una base fuerte.

Materiales. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de
precipitado, pipetas de Mohr, solucin de cido clorhdrico (problema), solucin de hidrxido de
sodio 0.1 N, solucin de azul de bromotimol.

Procedimiento. Medir exactamente 10.0 ml de una solucin problema de cido clorhdrico y
verterlos a un matraz Erlenmeyer. Aadir tres gotas de azul de bromotimol. Titular con NaOH 0.1 N
hasta el punto final. Calcular la normalidad aparente del cido.





24

Experimento #2: Titulacin de un cido dbil con una base fuerte.

MATERIALES.

Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de precipitado,
pipetas de Mohr, solucin de cido actico (problema), solucin de hidrxido de sodio 0.1 N,
solucin de fenolftalena.

PROCEDIMIENTO.

Medir exactamente 10.0 ml de una solucin problema de cido actico y verterlos a un
matraz Erlenmeyer. Aadir tres gotas de fenolftalena. Titular con NaOH 0.1 N hasta el punto final.
Calcular la normalidad aparente del cido.


Experimento # 3: Determinacin de la Acidez de la Leche.

MATERIALES.

Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, cpsula de porcelana, agitador de vidrio,
vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solucin de hidrxido de sodio 0.1 N, solucin de
fenolftalena al 1% en alcohol, muestra (s) de leche.

PROCEDIMIENTO

1. Llenar la bureta con la solucin de NaOH 0.1 N.
2. Mezclar perfectamente la leche que va a ser estudiada (bronca, pasteurizada o
ultrapasteurizada.
3. Transferir 10 ml de leche a la cpsula de porcelana.
4. Aadir tres gotas de solucin de fenolftalena a la muestra de leche. Mezclar.
5. Aadir gota a gota a la cpsula de porcelana la solucin de NaOH que contiene la
bureta, agitando constantemente. La prueba termina cuando se obtiene un color rosa o salmn en
la leche.
6. Repetir el procedimiento con todas las muestras de leche.


RESULTADOS

Calcular la acidez en cido lctico (partes por 1,000 ml) de cada una de las muestras.
Cumple(n) la(s) leche(s) con el reglamento sanitario?


















25
PRACTICA NO. 6

PREPARACIN DE UN BUFFER Y SU ACCION AMORTIGUADORA

OBJETIVO.

Preparar una solucin buffer y observar su accin amortiguadora en material biolgico.

INTRODUCCIN.

La definicin ms general de una solucin amortiguadora o buffer es que son soluciones
que resisten mucho los cambios de pH cuando se les aaden cidos o bases. Casi siempre estn
formadas por cidos dbiles y sus sales.

Al agregar iones de hidrgeno en forma de un cido fuerte a una solucin amortiguadora,
descompone la sal de la mezcla buffer y se forma un cido dbil que se disocia poco a poco y por
lo tanto no modifica el pH en forma significativa. Cuando se aade a la misma solucin
amortiguadora iones OH
-
en forma de una base fuerte, reacciona con el cido de la mezcla buffer y
se forma agua y una sal disociada, que tampoco determina una notable variacin del pH.

Ejemplo:

Se tiene una solucin amortiguadora formada por un cido dbil, cido actico y su base
conjugada (acetato de sodio) en solucin, el cido actico esta dbilmente ionizado y el acetato de
sodio esta fuertemente ionizado:

CH
3
COOH H + CH
3
COO
-
CH
3
COONa Na + CH
3
COO
-

La mayor parte de los iones CH
3
COO
-
provienen del acetato de sodio si se le aade un
cido fuerte por ejemplo HCl la reaccin que ocurre es la siguiente:

Na
+
+ CH
3
COO
-
+ H
+
+ Cl
-
Na
+
+ Cl
-
+ CH
3
COOH
Si a ese sistema se le aade una base fuerte por ejemplo NaOH se le da la siguiente
ecuacin:

H
+
+ CH
3
COO
-
+ Na
+
+ OH
-
CH
3
COONa + H
2
O

Por lo anterior se asume que el cambio de pH es mnimo.

El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuacin de Henderson-
Hasselbalch.

pH = pKa + log (CH
3
COO
-
/CH
3
COOH)

Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulacin del
pH en los medios biolgicos celulares y extracelulares. Su funcin es reducir al mnimo los cambios
en la concentracin de iones hidrgeno y por lo tanto, tambin en la concentracin de iones
hidroxilo, cuando se agregan pequeas cantidades de cidos o bases.




Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parmetros:

1.- El pH de la solucin amortiguadora: El cual indica la regin de concentracin del in hidrgeno
en el cual se realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).
26
2.- La Capacidad Amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adicin de cido o base con
poco cambio de pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentracin de todos los
constituyentes del amortiguador.

Para que los procesos bioqumicos del cuerpo se produzcan en forma adecuada es
necesario que la concentracin de iones hidrgeno se controle con extrema precisin. Por ejemplo,
el pH de la sangre se encuentra dentro de los limites de 7.3 - 7.5 siendo regulado por el sistema
amortiguador bicarbonato/ cido carbnico. Otro sistema importante son los grupos laterales de la
histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema cido Carbnico /Bicarbonato y Fosfato.

Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actan son los siguientes:



Amortiguador. PH aproximado.
Fosfato cido de potasio. cido clorhdrico. 1.8 3.8
Acetato de sodio. cido actico. 3.6 5.6
Ftalato cido de potasio. Hidrxido de sodio. 4.0 6.0
Fosfato cido de potasio. Hidrxido de sodio. 5.8 7.8
cido brico. Borato de sodio. 7.5 9.5
cido brico. Hidrxido de sodio. 8.2 10.2
Fosfato disdico. Hidrxido de sodio. 10.5 12.0





MATERIAL Y REACTIVOS.

4 vasos de precipitado de 100 ml
2 pipetas de 10 ml
4 pipetas de 5 ml
6 tubos de ensaye
1 gradilla
2 pipetas Pasteur con bulbo
1 Vaso de precipitado de 250 ml
1 Potencimetro
100 ml. de KH
2
PO
4
0.15 M.
100 ml. de Na
2
HPO
4
0.15 M.
NaOH 0.1 M
HCl 0.1 M
Albmina de huevo al 2 %, 75 ml
Agua destilada


PROCEDIMIENTO.

I.- PREPARACIN DE LA SOLUCION BUFFER.

En un vaso de precipitado de 250 ml colocar 77 ml de la solucin de KH
2
PO
4
0.15 M.
Aadir 49 ml de la solucin de Na
2
HPO
4
0.15 M y medir con el potencimetro hasta
obtener un pH de 7.0 (Si es necesario regular utilice cualquiera de las dos soluciones para lograr el
pH solicitado. Guarde su solucin buffer para el experimento nmero dos.











27
II.- ACCIN AMORTIGUADORA DEL BUFFER PREPARADO Y UN BUFFER BIOLGICO.

Poner en una gradilla dos series de tubos numerados del 1 al 6, seguir con las indicaciones
dadas por la siguiente tabla:

TUBO No. SOLUCION A
COLOCAR
PH INICIAL ADICIONAR pH FINAL
1 10 ml H
2
O
destilada
4 gotas HCl 0.1 N
2 10 ml solucin
buffer preparada
4 gotas HCl 0.1 N
3 10 ml albmina de
huevo
4 gotas HCl 0.1 N
4 10 ml H
2
O
destilada
4 gotas de NaOH
0.1 N

5 10 ml solucin
buffer preparada
4 gotas de NaOH
0.1 N

6 10 ml de albmina
de huevo
4 gotas de NaOH
0.1 N



1.- Realizar primero la medicin del pH de las soluciones que se indican en el tubo 1 al 6 antes de
agregar el HCl y el NaOH.

2.- Despus con el mismo potencimetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solucin
midiendo el pH final despus de la adicin del cido y la base fuerte.



PRESENTACION DE RESULTADOS.

a) Del experimento I, reportar el pH obtenido para la solucin buffer preparada.
b) Del experimento II, reportar el pH inicial y final obtenido para cada tubo y explicar sus resultados
obtenidos.


CUESTIONARIO.

1.- Por qu el agua destilada observa mayor alteracin de pH?.

2.- Por qu considera que la albmina de huevo debe tener propiedades amortiguadoras?.

3.- Que papel desempean las soluciones buffer dentro de la bioqumica? (En general.

4.- Qu sucede cuando en un sistema amortiguador la concentracin molar de la sal y el cido que
integran la solucin son iguales?.


28
PRACTICA NO. 7

PROPIEDADES QUMICAS DE CARBOHIDRATOS


OBJETIVO

Caracterizar, hasta donde sea posible, un carbohidrato problema mediante algunas
pruebas qumicas cualitativas.


INTRODUCCIN.

Los azcares se comportan como cidos dbiles y tienen las caractersticas qumicas de
aldehdos o cetonas. Por ello, los lcalis aumentan la enolizacin de los azcares.

La tautomerizacin es una reaccin tpica de azcares, los cuales contienen un grupo
aldehdo libre o un grupo cetnico. En ausencia de lcali existe un equilibrio entre las formas
enlicas y cetnicas, predominando estas ltimas. Cuando se les aade lcali, los enoles cidos
forman una sal y, por efecto de la accin de masas, se desplaza el equilibrio hacia la derecha. La
adicin de cido a una mezcla en equilibrio alcalino, restablece el equilibrio tautomrico hacia la
forma cetnica.

Otra reaccin importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando
hemiacetales y acetales.

Un monosacrido posee ambos grupos funcionales (carbonilo y alcohol) en su molcula y
puede reaccionar con otros azcares. La reaccin puede ocurrir tambin dentro de una misma
molcula de azcar, dando paso a la formacin de hemiacetales cclicos. Ahora bien, muchas de
las propiedades de los azcares simples slo pueden ser explicadas suponiendo la formacin del
anillo, siendo sta la forma ms estable de las molculas. Los lcalis disminuyen la formacin del
anillo al favorecer la formacin de la sal enlica.



PARTE EXPERIMENTAL

Para el desarrollo de los siguientes experimentos se utilizarn soluciones de glucosa,
fructosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y almidn, a una concentracin de 1 % (p/v).


A. PRUEBA DE MOLISH.

Objetivo. Detectar la presencia de carbohidratos.
Reactivos. Reactivo de Molish (sol. de alfa-naftol en etanol, al 95%) y cido sulfrico
concentrado.
Fundamento. La reaccin depende de la formacin de furfural y sus derivados por la accin
deshidratante del cido sobre un carbohidrato. El furfural se combina con el alfa-naftol para formar
un compuesto coloreado. Aunque no es una prueba especfica, un resultado negativo (ausencia de
color) sugiere la ausencia de carbohidratos.
Procedimiento. A 0.5 mililitro (ml) de cada una de las soluciones que van a ser probadas,
aada 1 gota del reactivo de Molish. Agite los tubos. En cada caso, incline el tubo y aada, de
manera lenta y cuidadosa, 0.75 ml de cido sulfrico concentrado (15 gotas).
Resultado positivo. Aparicin de un color violeta en la unin entre los lquidos.





29
B. PRUEBA DE BENEDICT.

Objetivo. Deteccin de azcares reductores.
Fundamento. Las soluciones alcalinas de cobre son reducidas por azcares que poseen
un grupo aldehdo o cetnico libre y se forma xido cuproso insoluble.
Reactivo. Solucin de Benedict (contiene sulfato cprico, carbonato de sodio y citrato de
sodio). Procedimiento. A 1.25 ml de solucin de Benedict aada exactamente 0.25 ml de cada una
de las soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en un bao de agua hirviente durante
5 minutos. Posteriormente, permita que se enfren lentamente. Observe el color y si se forma un
precipitado. Un cambio en el color de la solucin no indica un resultado positivo. Deber producirse
un precipitado de color amarillo, verde o rojo.


C. PRUEBA DE BARFOED.

Objetivo. Detectar monosacridos en presencia de disacridos
Fundamento. La reaccin de Barfoed difiere de la de Benedict en que la reduccin ocurre
en medio cido. IMPORTANTE: Los disacridos tambin respondern a la prueba si la solucin de
azcares es hervida durante un tiempo suficiente para producir hidrlisis.
Reactivos. Reactivo de Barfoed: Contiene sulfato cprico y cido lctico disueltos en agua.
Procedimiento. Coloque en un tubo de ensaye 0.25 ml de la solucin problema y 0.25 ml
de la solucin de Barfoed (hacerlo para todas las soluciones que se van a probar). Prepare un
tubo control: 0.25 ml de agua ms 0.25 ml de la solucin de Barfoed.
Sumerja los tubos en un bao de agua hirviente durante 3 minutos. Permita que se enfren.
Aada a cada tubo 0.25 ml del reactivo de cido fosfomolbdico. Agite los tubos.
Resultado positivo. Un color azul oscuro es indicativo de la presencia de monosacridos.


D. PRUEBA DE SELIWANOFF.

Objetivo. Deteccin de cetosas.
Fundamento. Esta prueba depende de la formacin del 4-hidroximetil-furfural y de su
reaccin posterior con el 1,3-dihidroxibenceno (resorcinol), de la que resulta un compuesto de color
rojo cereza.
En general, la prueba es especfica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de
glucosa u otros azcares pueden interferir produciendo compuestos de color similar.
Reactivo. Reactivo de Seliwanoff: Contiene resorcinol disuelto en cido clorhdrico.
Procedimiento. A 0.5 ml del reactivo de Seliwanoff aada 1 gota de cada una de las
soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en agua hirviente durante 2 minutos.
Observe el color que se desarrolla. Si se produce un precipitado, fltrelo y disulvalo en etanol, el
cual, en caso de un resultado positivo, debe adquirir color rojo.
Resultado positivo. Un color rojo cereza es indicativo de la presencia de cetosas.


RESULTADOS

Construya una tabla con los resultados obtenidos con las diferentes soluciones (incluyendo
la solucin problema) en las diferentes pruebas.


DISCUSIN

Para cada una de las soluciones problema conteste las siguientes preguntas
1. Contiene carbohidratos?
2. Si la respuesta anterior es afirmativa,
a. Se trata de un carbohidrato reductor?
b. Es un monosacrido?
c. Es una cetosa?
30
PRACTICA NO. 8

PREPARACION DE UNA CURVA PATRON PARA GLUCOSA

OBJETIVOS

Al finalizar esta prctica, el alumno sabr:
1.- Preparar una curva patrn para glucosa.
2.- Determinar la concentracin de glucosa de una solucin problema, interpolando la curva
patrn.

INTRODUCCIN

Una curva patrn se construye al graficar valores conocidos de concentracin de una
sustancia de inters contra las unidades obtenidas al aplicar a dicha sustancia un mtodo qumico
cuantitativo. Por ejemplo, en un medio alcalino la glucosa reduce al cobre cprico, para formar
oxido cuproso insoluble el cual, a su vez, puede reducir al arsenomolibdato formndose un in
colorido. La intensidad del color depende de la cantidad de glucosa presente; la absorbencia de
dicha solucin puede determinarse colorimtricamente. Al graficar la absorbencia medida versus
concentraciones conocidas de glucosa se construye de una curva patrn. Ahora bien, si se tiene
una solucin problema de glucosa se le puede someter al mismo procedimiento que a las
soluciones de concentracin conocida. Posteriormente, la absorbencia de la solucin problema
puede interpolarse en la curva patrn para determinar su concentracin.

Bases qumicas:
Al hacer reaccionar glucosa (agente reductor) con hidrxido cprico en medio alcalino, se
forma oxido cuproso (color rojo). El xido cuproso es insoluble y se precipita, por lo que no puede
valorarse colorimtricamente. Cuando se aade a esta solucin fosfomolibdato, ste se reduce a
un in de color azul cuya absorbencia puede medirse con un colormetro.

GLUCOSA (agente reductor)
+
Reactivo de cobre (Cu
+
)

incubacin e
-


Oxido cuproso
+
Fosfomolibdato



Compuesto coloreado en proporcin a la concentracin
a la concentracin (medible colorimetricamente)



agua destilada



compuesto coloreado con volumen
adecuado para medicin calorimtrica.



31

MATERIAL Y REACTIVOS:

a). Reactivos:
1.- Solucin patrn de glucosa (20mg/100 ml)
2.- Reactivo de cobre estabilizado en medio
alcalino.
3.- Reactivo de fosfomolibdato.
4.- Solucin de glucosa de concentracin
desconocida (problema)
b). Aparatos:
1.- Espectrofotmetro.
2.- Recipiente con agua a ebullicin.


PROCEDIMIENTO

1.- Disponga 6 tubos de ensaye de la manera siguiente:

TUBO 1
blanco.
2 3 4 5 6
problema.
Patrn de
glucosa (ml)
0 0.25 0.50 0.75 1.0 0
Agua
destilada
(ml)
1.0 0.75 0.50 0.25 0 0
Reactivo de
cobre (ml)
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Sol.
problema
(ml)
0 0 0 0 0 1.0

Agitar e incubar durante 20 minutos a ebullicin, permita que los tubos se enfren.

Reactivo de
fosfomolibda
to (ml)
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agua
destilada
(ml)
9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5

2.- Agite los tubos. Determine la absorbencia a 540 nm.
3.- Dibuje la curva patrn: grfica de absorbencia vs. concentracin de glucosa (microgramos/ ml).

RESULTADOS

Interpole la absorbencia de la solucin problema en la curva patrn, para determinar la
concentracin de glucosa.


CUESTIONARIO

1.- Que es una curva patrn?.
2.- Que utilidad tiene?
3.- Como se interpola un valor?
4.- Cul es el efecto de la glucosa sobre el reactivo de cobre?.



32

PRACTICA NO.9

SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL


OBJETIVO:

Separar una mezcla de compuestos qumicamente semejantes para su identificacin.


INTRODUCCION:

En 1903 el botnico ruso M. T. Sweet elabor la primera tcnica para separar distintos
componentes coloreados de un extracto vegetal. A esta tcnica se la ha dado el nombre de
cromatografa debido a que la separacin de las sustancias dan diferentes colores.

Existen diferentes tipos de cromatografa. La cromatografa en papel es una forma sencilla
que ha llegado a ser un instrumento analtico extraordinariamente valioso para el qumico orgnico
y para el bioqumico. En esta tcnica se emplea papel filtro, una gota de solucin que contiene la
muestra y que se coloca en cierto punto sobre el papel de donde hay una migracin como
resultado de flujo por una fase mvil. El movimiento de la fase mvil es causado por fuerzas
capilares. La gravedad tambin contribuye al movimiento.

Puede decirse que la cromatografa en papel es un tipo de cromatografa por particin en el
que la fase estacionaria es agua absorbida sobre la superficie hidroflica del papel. Un disolvente
orgnico acta como fase mvil. Por tratamiento apropiado del papel, el agua puede ser sustituida
por una fase lquida estacionaria no polar; pueden usarse soluciones acuosas como reveladores.
En otra variacin, el papel es impregnado con slice anhidra o una resina de intercambio de iones.

La trayectoria de una muestra se puede describir en funcin de su factor de retardo o
relacin al frente que se define como:

Factor de retardo = Rf = Distancia del movimiento del soluto
Distancia del movimiento del solvente

Para compensar las variables intercontroladas, la distancia recorrida por un soluto se
compara frecuentemente con la de una sustancia estndar en idnticas condiciones.

La cromatografa presta valiosa ayuda en el anlisis de sustancias complejas como
protenas, tierras raras, etc.


MATERIAL Y REACTIVOS:


2 tiras de papel filtro
2 frascos con disolvente y tapa
1 parrilla elctrica
Muestras de aminocido: (leucina y cido
asprtico)
Solucin disolvente (butanol: cido actico:
agua, 4:1:1)
Solucin reveladora de ninhidrina






33



PROCEDIMIENTO:

1.- En un extremo del papel filtro, hacer dos pequeas marcas con lpiz a un extremo del borde y
separarlas entre s una distancia de un centmetro.

2.- Poner una gota en una de las marcas sealadas del aminocido No. 1.

3.- Repetir la operacin con una gota del aminocido No. 2.


4.- En otro papel colocar una gota de una mezcla de los aminocidos.

5.- Introduzca las tiras de papel filtro en un frasco o vaso que contenga la mezcla del solvente
(utilice un frasco para cada tira).

6.- Deje avanzar el frente del solvente hasta aproximadamente 1 cm antes de que llegue al borde
superior.

7.- Una vez seco el papel, rociar con solucin de ninhidrina (revelador especfico) para aminocido.
Dejar secar nuevamente.

8.- Calentar las hojas de papel filtro en una parrilla elctrica (tener cuidado de no quemarlas) hasta
la aparicin de manchas coloreadas. Ellas representan el sitio donde se encuentran los
aminocidos que reaccionaron con la ninhidrina.


RESULTADOS:

1.- Medir la distancia desde el punto de colocacin de la solucin de los aminocidos al centro de
las manchas (d).

2.- Medir la distancia del sitio de colocacin de los aminocidos al sitio donde lleg el solvente (D).

3.- Calcular el Rf para cada aminocido, de acuerdo a la siguiente frmula:

Rf = d/ D

4.- El Rf se calcular para cada uno de los aminocidos individuales y para la mezcla.

5.- Identificar cada aminocido.

6.- Cual corri ms y por que?.














34
PRACTICA NO.10

DETERMINACION DE PROTEINA POR EL METODO DE BIURET


OBJETIVO:

Determinar fotocolorimetricamente la concentracin de protena de una solucin problema,
usando una curva estndar.

FUNDAMENTO:


ESPECTROFOTOMETRA DE BIOMOLCULAS.
Tomado de: Boyer, R.F.: Modern Experimental Biochemistry, 1s
t
ed., Benjamin/Cummings, Menlo
Park, CA, 1986, pp. 145-157.

Algunas de las primeras mediciones experimentales sobre las biomolculas incluan un
estudio de sus interacciones con la luz. Las observaciones iniciales mostraron que cuando la luz
incide sobre una solucin, ocurren por lo menos dos procesos distintos: la dispersin y la absorcin
de luz. Ambos fenmenos constituyen ahora la base de algunas tcnicas tiles para analizar y
caracterizar biomolculas.

En el caso de algunas biomolculas, el proceso de absorcin de luz es seguido por la
emisin de luz de una diferente longitud de onda. Este proceso, llamado fluorescencia, depende de
la estructura molecular y de factores ambientales y sirve como una valiosa herramienta para la
caracterizacin y el anlisis de molculas y procesos dinmicos biolgicamente significativos.

Otra tcnica que involucra las molculas y la luz es la polarimetra. En este caso se estudia
la interaccin de la luz polarizada en un plano con molculas pticamente activas.

A. Principios bsicos de la espectrofotometra de absorcin.

El espectro electromagntico est formado por un continuo de ondas con propiedades
diferentes. Las regiones de importancia primaria en bioqumica incluyen la luz ultravioleta (UV, 180-
320 nm) y la luz visible (320-800 nm). La luz en estas regiones del espectro tienen la energa
suficiente para excitar los electrones de valencia de las molculas. La longitud de onda de la luz,
definida por la ecuacin (1) es la distancia entre las crestas de ondas adyacentes.

= c/v (1)

donde = longitud de onda
c = velocidad de la luz
v = frecuencia, nmero de ondas que pasan por cierto punto por unidad de tiempo.
La luz tambin se comporta como si estuviera formada por partculas energticas. La
cantidad de energa, E, asociada con estas partculas (o fotones), est dada por la ecuacin

E = hv (2)

en la que h = constante de Planck

Cuando un fotn de cierta energa interacciona con una molcula, puede ocurrir uno de dos
procesos. El fotn puede ser desviado (dispersado), o puede transferir su energa a la molcula,
produciendo un estado de excitacin de la misma.


La dispersin de la luz es la base fsica de varios mtodos experimentales empleados para
caracterizar macromolculas. Antes del desarrollo de la electroforesis, las tcnicas de dispersin
35
de la luz eran utilizadas para determinar las masas moleculares ("pesos" moleculares) de
macromolculas. Las tcnicas de difraccin de rayos X, microscopa electrnica, dispersin de luz
lser, y dispersin de neutrones dependen en alguna medida del proceso de dispersin de la luz.

El otro proceso mencionado lneas arriba, la transferencia de la energa de un fotn a una
molcula, es la absorcin. Para que un fotn sea absorbido, su energa debe ser igual a la
diferencia de energa entre dos niveles energticos de la molcula.

Las molculas poseen un conjunto de niveles cuantizados de energa. Aunque son
posibles varios estados, para los fines presentes consideraremos slo dos estados electrnicos: un
estado basal (B) y el primer estado excitado (S
1
). Estos dos estados difieren en la distribucin de
los electrones de valencia. Cuando los electrones son promovidos de un orbital en estado basal B
a un orbital de mayor energa (en S
1
), se dice que ocurre una transicin electrnica. La energa
asociada con la luz ultravioleta y la luz visible es suficiente para promover a las molculas de un
estado electrnico a otro, esto es, desplazar electrones de un orbital a otro.

En cada nivel energtico electrnico existe un conjunto de niveles vibracionales. Estos
representan cambios en el estiramiento y doblamiento de los enlaces covalentes. Las transiciones
entre estos niveles son la base de la espectroscopa infrarroja.

La transicin electrnica de una molcula de B a S
1
, tiene una elevada probabilidad de
ocurrir si la energa del fotn se corresponde con la energa necesaria para promover un electrn
del nivel energtico E
1
al nivel energtico E
2
:

E
2
- E
1
= hc/ (3)

Puede ocurrir una transicin desde cualquier nivel vibracional en B a algn otro estado
vibracional en S
1
. Empero, no todas las transiciones tienen la misma probabilidad. La probabilidad
de absorcin es descrita por la mecnica cuntica.

Un espectro UV-visible se obtiene midiendo la luz absorbida por una muestra como funcin
de la longitud de onda. Como las molculas de la muestra slo pueden absorber "paquetes"
discretos de energa (longitudes de onda especficas) tericamente el espectro debe estar formado
por lneas discretas. Sin embargo, los numerosos niveles vibracionales de cada nivel energtico
electrnico incrementa el nmero de transiciones posibles. Esto da como resultado un espectro de
picos amplios.

Un espectro de absorcin puede ayudar en la identificacin de una molcula, ya que la
longitud de onda de absorcin depende de los grupos funcionales o del arreglo de los tomos en la
molcula. A lo largo de un espectro de absorcin pueden encontrarse picos de absorcin mxima o
zonas de mnima absorcin.

Un segundo parmetro evaluado en la espectroscopa de absorcin es la eficiencia o grado
de absorcin a determinadas longitudes de onda. Este parmetro es tradicionalmente llamado
coeficiente de extincin. Es definido por la ley de Beer-Lambert:

A = EBC (4)

donde A = absorbencia = - log I/I
0

I
0
= intensidad de luz que irradia a la muestra
I = intensidad de luz transmitida a travs de la muestra
E = coeficiente de extincin del material absorbente
b = recorrido de la luz a travs de la muestra (espesor de la celdilla)
c = concentracin del material absorbente en la muestra

Como la absorbencia, A, deriva de un cociente (-log I/I
0
), no tiene unidades; por lo tanto,
las unidades de E dependen de las unidades de b y c. E es ms convenientemente utilizado en
forma de coeficiente de extincin molar, , definido como la absorbencia de una solucin 1.0 M de
36
la sustancia absorbente pura en una celdilla de 1 cm bajo condiciones especficas de longitud de
onda y solvente.

B. Instrumentacin para medir la absorcin de luz UV-visible

El espectrofotmetro es utilizado para medir experimentalmente la absorbencia. Este
instrumento produce luz de una longitud de onda preseleccionada, la dirige a travs de la muestra
(usualmente disuelta en un solvente y colocada en una cubeta) y mide la intensidad de la luz
transmitida por la muestra. Sus componentes principales son: una fuente de luz, un monocromador
(que incluye diversos filtros, rejillas y espejos), una cmara para la muestra, un detector y un
registrador.

Fuente luminosa. Para mediciones de absorcin en la regin UV se usa una lmpara de
hidrgeno a alta presin o de deuterio. Estas lmparas producen radiacin en el rango de 200 a
300 nm. La fuente de luz para la regin visible es la lmpara de tungsteno, con un rango de
longitudes de onda de 320 a 800 nm. Los instrumentos con ambos tipos de lmpara tienen mayor
flexibilidad y pueden ser empleados para estudiar la mayora de las molculas biolgicamente
significativas.

Monocromador. Las dos lmparas mencionadas producen emisiones continuas de todas
las longitudes de onda dentro de su rango. Por tanto, un espectrofotmetro debe poseer un
sistema ptico para seleccionar luz monocromtica (luz de una longitud de onda especfica). Los
instrumentos modernos utilizan un prisma o, ms a menudo, rejillas de difraccin para producir la
longitud de onda deseada. Debe notarse que la luz emitida por el monocromador no es
completamente de una sola longitud de onda, sino que es realzada en dicha longitud de onda. Esto
es, la mayor parte de la luz es de una sola longitud de onda, pero estn presentes longitudes de
onda ms cortas y ms largas.

Antes de que la luz monocromtica incida sobre la muestra, pasa a travs de una serie de
hendiduras, lentes, filtros y espejos. Este sistema ptico concentra la luz, aumenta la pureza
espectral y la enfoca hacia la muestra. El operador de un espectrofotmetro tiene poco control
sobre la manipulacin ptica del haz luminoso, excepto en el ajuste de la anchura de la rejilla. La
luz que pasa del monocromador a la muestra encuentra una "ventana" o hendidura. En algunos
instrumentos sta est ajustada para que pase un haz de luz de cierta anchura. Los instrumentos
ms costosos tienen hendiduras variables, lo que permite al operador controlar su anchura. La
anchura de la rejilla determina la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y su pureza
espectral. Al disminuir la anchura de la hendidura, aumenta la pureza espectral de la luz, pero
disminuye la cantidad de luz dirigida hacia la muestra. En este caso, el factor limitante es la
eficiencia o sensibilidad del detector. Establecer la anchura apropiada de la hendidura requiere un
equilibrio entre la pureza espectral y la sensibilidad del detector.

Cmara de la muestra. La luz monocromtica procesada es entonces dirigida hacia una
cmara de muestra, que puede acomodar una amplia variedad de porta muestras. La mayora de
las mediciones UV-visible se hacen en soluciones de las molculas de inters. La muestra es
colocada en un tubo o cubeta de vidrio, cuarzo, u otro material transparente. Las cubetas de vidrio
son las menos costosas, pero, como absorben luz UV, pueden ser usadas slo a longitudes de
onda superiores a 320 nm. El cuarzo o slice fundido debe ser empleado en el rango UV (200-320
nm). La calidad y condiciones de las cubetas son factores crticos en la espectrofotometra. Las
cubetas de alta calidad son muy costosas y deben ser objeto de un mantenimiento cuidadoso.



Los espectrofotmetros ms baratos son instrumentos de "un solo haz" que permiten la
insercin de una sola cubeta a la vez en el porta cubetas. Este es el caso del Coleman Modelo
6/35, del Bausch & Lomb Modelo 20 o del Seqoia-Turner Modelo 340. Los instrumentos ms
sofisticados son de "doble haz" y aceptan dos cubetas a la vez: una que contiene la muestra
disuelta en el solvente y otra que contiene solvente puro.

37
Con frecuencia los espectrofotmetros son usados para monitorear velocidades de
reacciones qumicas. Cuando se efectan estas mediciones la cubeta que contiene la muestra
debe tener una temperatura constante. Muchas cmaras de muestra permiten la circulacin de un
lquido cuya temperatura es constante, alrededor del porta cubetas.

Detector. La intensidad de la luz que pasa a travs de la muestra en estudio depende de la
cantidad de luz que es absorbida por la misma. La intensidad es medida por un detector
fotosensible, generalmente un tubo foto multiplicador (TFM). El TFM detecta una pequea cantidad
de energa luminosa, la amplifica mediante una cascada de electrones acelerados por dnodos, y la
convierte en una seal elctrica que puede ser transferida al registrador.

Registrador. Los instrumentos menos costosos dan una lectura directa de absorbencia y/o
transmitencia en forma anloga o digital. Estos instrumentos son apropiados para mediciones a
una sola longitud de onda; sin embargo, si se desea un "barrido" de absorbencia vs. longitud de
onda, entonces debe utilizarse un registrador. Algunos espectrofotmetros estn equipados con un
registrador de pluma. El rango de absorbencia de la mayora de los registradores es de 0 a 1, pero
los instrumentos ms costosos pueden ser utilizados a niveles superiores de absorbencia (1-2) o
niveles inferiores, de mayor sensibilidad (0-0.1, 0-0.01, etc.).

C. Aplicaciones de la espectrofotometra de absorcin

Ahora que estamos familiarizados con la teora y la instrumentacin de las
espectrofotometra de absorcin, podremos comprender ms fcilmente el funcionamiento y las
aplicaciones tpicas de un espectrofotmetro. Como virtualmente todas las mediciones UV-visible
se hacen en muestras disueltas (en solventes adecuados), slo se mencionarn estas
aplicaciones. Aunque pueden hacerse muchos tipos diferentes de operaciones con un
espectrofotmetro, todas las aplicaciones caen en una de dos categoras: a) medicin de la
absorbencia a una longitud de onda fija; y, b) medicin de la absorbencia en funcin de la longitud
de onda.

Para las mediciones de absorbencia a una longitud de onda fija con un instrumento de "un
haz", se coloca una cubeta que contiene el solvente puro y se ajusta la absorbencia a "cero". Una
cubeta que contenga solvente ms muestra se coloca entonces en la cmara, y su absorbencia es
leda directamente del registrador. El ajuste a cero con el solvente puro ("blanco") permite obtener
la lectura directa de la absorbencia de la muestra.

Un espectro de absorcin de un compuesto puede obtenerse "barriendo" un rango de
longitudes de onda y graficando la absorbencia obtenida a cada longitud de onda. La mayora de
los espectrofotmetros de "doble haz" recorren automticamente el rango deseado de longitudes
de onda y registran la absorbencia como funcin de la longitud de onda. Si el solvente es colocado
en la cmara de referencia y el solvente ms la muestra en la posicin de la muestra, el aparato
restar automticamente a absorbencia del solvente de la absorbencia total (solvente ms
muestra) a cada longitud de onda; de aqu que la grfica del registrador sea realmente un
"espectro diferencial" (absorbencia de la muestra ms solvente menos absorbencia del solvente).

Ambos tipos de mediciones (longitud de onda fija y espectro de absorcin) son comunes en
la bioqumica, y deberamos ser capaces de interpretar los resultados de ambas.


Medicin de la concentracin de una solucin. De acuerdo con la ley de Beer y Lambert, la
absorbencia de un material en solucin depende directamente de la concentracin de dicha
sustancia. Comnmente se usan dos mtodos para medir la concentracin. Si se conoce el
coeficiente de extincin de la especie absorbente, entonces la concentracin puede calcularse tras
la medicin experimental de la absorbencia de la solucin. Sin embargo, esta aplicacin tiene
limitaciones. La mayora de los espectrofotmetros son tiles para medir absorbencias con un valor
mximo de 1, aunque los aparatos ms sofisticados pueden medir absorbencias tan altas como 2.
Asimismo, algunas substancias no obedecen la ley de Beer y Lambert; esto es, la absorbencia no
aumenta de manera lineal con la concentracin. Esto puede ocurrir con substancias que se asocian
o disocian en solucin. La linearidad es fcilmente verificada preparando una serie de
38
concentraciones de la especie absorbente y midiendo la absorbencia correspondiente a cada
concentracin. Si la ley de Beer-Lambert es vlida, la grfica de absorbencia vs. concentracin
debe ser lineal.

Si no se conoce el coeficiente de extincin de una sustancia, su concentracin en solucin
puede ser determinada si se conoce la absorbencia de una solucin patrn (estndar) del
compuesto. Alternativamente, la concentracin de un especie en solucin puede ser determinada
preparando una curva estndar (patrn) de absorbencia vs. concentracin.

Identificacin de biomolculas desconocidas. El espectro UV-visible de una biomolcula
revela mucho acerca de su estructura molecular. Por lo tanto, una de las primeras mediciones
experimentales sobre una biomolcula desconocida debe ser el anlisis espectral. Las molculas
naturales a menudo contienen grupos cromforos que tienen espectros caractersticos. El
procedimiento para obtener un espectro de absorcin UV-visible comienza con la preparacin de
una solucin de la especie en estudio. Una solucin estndar debe prepararse en un solvente
adecuado. Se transfiere una alcuota de la solucin a una cubeta, la cual es colocada en la
posicin de la muestra en la cmara del espectrofotmetro. Otra cubeta con el solvente puro es
colocado en el porta cubetas de referencia. El espectro es recorrido en el intervalo deseado de
longitudes de onda y se calcula el coeficiente de extincin para cada longitud de onda en la que la
absorbencia es mxima.


Cuando un compuesto que contiene dos o ms grupos carbamilo, unidos directamente o
separados por un solo tomo de C o N, es colocado en una solucin alcalina con sales de cobre,
se forma un complejo de color violeta. Esta reaccin constituye la base de un mtodo cuantitativo
de determinacin de protena. esta determinacin debe hacerse en ausencia del in NH
4
, el cual
produce un color que causa interferencia.


REACTIVOS:

1.- Solucin patrn de protena (8 mg de albmina /ml).
2.- Reactivo de Biuret.
3.- Solucin problema.

APARATOS:

1.- Espectrofotmetro Baush & Lomb (Spectronic 20).
2.- Bao Mara.


METODO:

1.- Llene 6 tubos de ensayo de la manera siguiente:

TUBO

1
blanco.
2 3 4 5 6
problema.
Sol.
problema
(ml)
0 0 0 0 0 1.0
Patrn de
protenas
(ml)
0 0.25 0.50 0.75 1.0 0
NaCl 0.9 %
(ml)
3.0 2.75 2.50 2.25 2.0 2.0
Reactivo de
Biuret (ml)
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
39

2.- Caliente los tubos en el bao (50 C) durante 10 minutos.
3.- Enfre los tubos en agua corriente.
4.- Determine en el espectrofotmetro la absorbancia a 540 nm; ajuste a cero con el blanco (tubo
# 1).
5.- Dibuje la curva patrn (absorbencia vs. concentracin de protena).
6.- Determine la concentracin de protena (mg/ml) de la solucin problema interpolando la curva
patrn.

















































40
PRACTICA NO. 11

EXAMEN QUIMICO DE ORINA


OBJETIVOS

1. El alumno comprender la importancia de la valoracin del examen qumico de orina.
2. El alumno ser capaz de entender los fundamentos de las diferentes pruebas con qumica
seca para el examen qumico de orina.

FUNDAMENTO

El rin y su producto de eliminacin, la orina, constituyen el principal sistema en la
homeostacia del organismo humano. El rin filtra, retiene o excreta diversos productos presentes
en la sangre de acuerdo a la necesidad de conservarlos o eliminarlos. Cada producto presente en
la orina tiene un mecanismo individual de eliminacin o de retencin; su identificacin y
cuantificacin en la orina nos permite realizar evaluaciones, constituyndose el examen general de
orina como un examen de rutina en la practica diaria, ya que la presencia o el aumento de estos
compuestos ayudan a l diagnstico o a seguir la evolucin o evalucin de diversos padecimientos.
Son numerosos los compuestos que podemos identificar y cuantificar en la orina. El examen
general de orina es dividido en un examen qumico y otro microscpico de sedimento. Actualmente
el EGO es realizado mediante qumica seca utilizando una tirilla que contiene una serie de
parmetros, que son interpretados mediante una carta de colores y concentraciones o bien es
evaluada en un urinmetro o reflectometro.


MATERIAL

1. Reflectmetro.
2. Escala de colores y concentraciones.
3. Recipiente para colecta de orina.
4. Tubos para anlisis de orina.
5. Tiras reactivas para orina.
6. Gradilla.
7. Papel sanitario.
8. Guantes.


MUESTRA

Muestras de orina adecuadamente colectadas.


METODOLOGA

Ajustarse a la metodologa del fabricante.

Fabricante:
Modelo del reflectmetro:
Carta de colores y concentraciones.







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RESULTADOS.

Identificacin de las muestras: Muestra 1 Muestra 2



Valor de Densidad:
Valor de pH:
Valor de Leucocitos:
Valor de Nitritos:
Valor de Protena:
Valor de Glucosa:
Valor de Cetonas:
Valor de Urobilongeno:
Valor de Bilirrubina:
Valor de Sangre:
Valor de Hemoglobina:


Valores normales:
Densidad: 1.010 1.020
Leucocitos, nitritos, protena, cetonas, bilirrubinas y sangre: Negativo.
pH: 5 6.5
Glucosa y urobilingeno: Negativo



CUESTIONARIO.

1. Cmo influye en el pH, el hecho de que las muestras de orina sean procesadas mucho
tiempo despus (aprox. 4 horas) en el resultado?
2. Por qu razn la tira reactiva debe de ser leda en un tiempo especifico?
3. Cul es el fundamento de la prueba para la determinacin de Cetonas, Bilirrubina y
Urobilingeno?













42
PRACTICA No. 12

DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA EN LIQUIDOS
BIOLOGICOS


OBJETIVO

Determinar cuantitativamente la actividad de amilasa en lquidos biolgicos mediante el
mtodo amiloclstico iodomtrico.

INTRODUCCION

La amilasa producida en el pncreas excrino y en las glndulas salivales, escinde los
enlaces alfa 1-4 glucosdicos de los polisacaridos (almidn y glucgeno).
Se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda, alcanzando los
valores ms elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a
los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. Tambin se ve aumentada en este caso la
excrecin urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 das, luego de que la actividad
srica ha alcanzado los niveles normales. Tambin es posible encontrar valores aumentados en
cualquier caso de abdomen agudo o intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas.



FUNDAMENTO

El sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra, producindose la hidrlisis
enzimtica. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce
color con el remanente de almidn no hidrolizado. La disminucin de color respecto de un sustrato
color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades
Amilolticas (Smith & Roe)/ 100 ml (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarognicas
(Somogyl)/100 ml.




MATERIALES Y REACTIVOS

Bao de agua agua Suero sanguneo u orina
Tubos de ensayo Solucin de almidn 500 mg/l, tamponada a pH 7
Micropipetas con buffer fosfatos 0.1 M en NaCl 0.15 M
Espectrofotmetro Reactivo de Yodo (0.01 eq/l de yodo en cido
Pipetas serolgicas clorhdrico 0.02 M)



PROCEDIMIENTO
1. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y otro como desconocido (d).
2. Agregar 1 ml de sustrato a cada tubo.
3. Dejar 5 min en bao de agua a 37
o
C
4. Agregar 0.02 ml de la muestra al tubo marcado como desconocido
5. Incubar a 37
o
C por 7 minutos y medio
6. Agregar 1 ml del reactivo de yodo a cada uno de los tubos
7. Mezclar y agregar 8 ml de agua destilada a ambos tubos
8. Mezclar por inmersin y leer la absorbancia en el espectrofotometro a 640 nm ajustando a cero
con agua destilada.
Nota: El color de la reaccin es estable durante 1 hr.
Si la temperatura ambiente es superior a 25
o
C, la lectura deber efectuarse dentro de los 20 min

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CALCULO DE LOS RESULTADOS


Amilasa (UA/dl)= (c - d)/c x 1000


Unidades: Una unidas Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra,
que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 min, en las condiciones de la reaccin. En esta
tcnica se incuban 0.02 ml de muestra con 0.5 mg de almidn contenidos en 1 ml de sustrato
durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10.000 mg de almidn
durante 30 min. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra sera de
1000 UA/ dl. Para las unidades de actividad amilsica, la fraccin de almidn digerido se multiplica
por 1000.



VALORES DE REFERENCIA


Condicin clnica Suero (UA/dl) Orina (UA/hora)
Normal
Pancreatitis aguda
Pancreatitis crnica
Parotiditis
Parotiditis c/complicacin
pancretica
Procesos abdominales agudos
(sin pancreatitis)
<120
300 a 12.000
hasta 200
200 a 350

ms de 350

normal
<260
Ms de 900
Ms de 300
350 a 750

ms de 750

normal





CUESTIONARIO

1.- Explique la importancia bioqumica de la cuantificacin de la actividad enzimtica

2.- Que factores afectan el comportamiento enzimtico

3.- Mencione tres enzimas de importancia clnica
















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PRACTICA NO. 13


ANLISIS DE LPIDOS

OBJETIVO:

Realizar pruebas generales para identificar algunas propiedades de un lpido.


INTRODUCCIN.

Los lpidos son molculas orgnicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua
y muy solubles en solventes orgnicos. Esta propiedad fsica refleja la naturaleza hidrofbica de su
estructura hidrocarbonada. En esta prctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para
poner de manifiesto algunas propiedades de los lpidos como son: solubilidad, deteccin de
perxidos y saponificacin.


MATERIALES Y REACTIVOS.
7 Tubos de ensayo Aceite vegetal.
2 Pipetas de 1 ml. Agua.
4 Pipetas de 2 ml. Etanol.
Bao Mara. Eter etlico.
Soporte completo Tetracloruro de carbono
Gradilla Mezcla de Acido actico y Cloroformo.
KI al 5 %.
NaOH 2 N o al 10 %.

PROCEDIMIENTO.

A) PRUEBA DE SOLUBILIDAD.

1. Enumerar cuatro tubos de ensaye y prepararlos de la siguiente forma:

TUBO 1 2 3 4
Aceite Vegetal. 1 ml. 1 ml. 1 ml. 1 ml.
Agua 2 ml.
Etanol 2 ml.
Tetracloruro de
carbono.
2 ml.
Eter etlico. 2 ml.

2.- Observar el grado de solubilidad y anotar los resultados.



B) DETECCIN DE PERXIDOS.

1.- Colocar en un tubo de ensayo 1 ml. de aceite vegetal y 2 ml. de mezcla de ac. Actico l
cloroformo.

2.- Agitar fuerte y agregar 2 gotas de KI, agitar nuevamente.

3.- Esperar 10 minutos y observar cambios.



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C) SAPONIFICACIN.

1.- Colocar 2 ml. de aceite vegetal en un tubo.
2.- Agregar 1 ml. de NaOH.
3.- Agitar para formar una emulsin.
4.- Calentar en Bao Mara durante 5 minutos.
5.- Dejar reposar el tubo y observar cambios.

CUESTIONARIO.

1.- Da una definicin de lpidos.
2.- Explica con reacciones qumicas en que consiste la saponificacin.