Manualmicrofarma 2019

Laboratorio de Microbiología farmacéutica UPIBI-IPN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA
ELABORARON:
Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ

Q.B.P. MARTHA MORALES MARTÍNEZ
SEGUNDA EDICIÓN
Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ
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PROLOGO
El presente manual de laboratorio de Microbiología farmacéutica tiene la finalidad de dar apoyo a la
asignatura con el mismo nombre, en este manual tenemos las practicas que se realizarán a lo largo del
curso, la cual contiene los fundamentos mínimos, los materiales, el procedimiento y la bibliografía para
ampliar los fundamentos.
Se presentan algunas técnicas básicas de microbiología, algunas de ellas basadas en la normatividad
de la secretaria de salud para que el alumno poco a poco se vaya adentrando a la legislación sanitaria
mexicana.
Uno de los principales objetivos es poner en práctica el método científico para despertar el interés y
seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportación a las estructuras didácticas de este manual, colocamos una serie de imágenes de
lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.
NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________
PROFESOR DE TEORÍA: ___________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________
GRUPO: _______________________________________________________
PERIODO LECTIVO: _____________________________________________
CARRERA: _____________________________________________________
ESCUELA: _____________________________________________________
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ÍNDICE
Instrucciones generales ______________________________________________________________3
Practica No. 1 Tinciones y uso del microscopio____________________________________________7
Práctica No. 2 Métodos de esterilización y controles _______________________________________19
Práctica No. 3 Preparación de medios y cultivo de microorganismos___________________________ 26
Práctica No. 4 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios___________________________43
Práctica No. 5 Conservación de microorganismos _________________________________________49
Práctica No. 6 Determinación de organismos coliformes, mesofílicos aerobios, mohos y levaduras en
superficies vivas e inertes ____________________________________________________________ 61
Práctica No. 7 Aislamiento e identificación de patógenos en productos farmacéuticos y cosméticos___70
Práctica No. 8 Pruebas para identificar bacterias (PARTE I) _________________________________ 85
Práctica No. 8 Pruebas para identificar mohos y levaduras (PARTE II) ________________________ 107
Practica No. 9 Cinética de crecimiento _________________________________________________ 118
Practica No. 10 Resistencia microbiana ________________________________________________ 126
Practica No. 11 Autovacunas_________________________________________________________135
Agares___________________________________________________________________________141
Caldos __________________________________________________________________________ 148
Medios semisólidos ________________________________________________________________ 154
Soluciones, reactivos y colorantes _____________________________________________________155
Nefelómetro de McFarland___________________________________________________________ 160
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INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIÓN
1.- El laboratorio representa el 50 % del curso y cada práctica se evalúa de la siguiente forma:
Trabajo laboratorio: 4.0
Actividad previa 1.0
Discusión de la práctica: 2.5
Informe de la práctica: 2.5
Nota. Solo se promedia el laboratorio si se aprueba la teoría.
2.- En el reporte se evalúa:
a) Objetivos 0.125
b) Resultados y cuestionario: 1.0
c) Discusión y análisis de resultados: 1.0
d) Conclusiones: 0.25
e) Bibliografía: 0.125
3.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional, en la portada se colocará una
etiqueta con el título de la asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo,
colocando en primer término el del dueño del cuaderno, de manera remarcada o con letra más grande y
en la parte superior derecha se pondrá una etiqueta de 5 cm con el número de equipo.
4.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,
aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.
5.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la
práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
6.- La calificación final del laboratorio será el promedio de las calificaciones de todas las prácticas.
7.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la
calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
8.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos integrantes del equipo
hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presentó tendrá cero en el reporte y para
acreditar el laboratorio deberá entregar el 80 % de prácticas
9.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la
esterilización y lavado de material limpio o sucio y no lo realice tendrá un punto menos en su evaluación
de trabajo de la práctica correspondiente.
Al final del curso los alumnos limpian y entregan su gaveta, el alumno que no realice esta actividad
tendrá un punto menos en su evaluación del tercer departamental.
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II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

1.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

Manual de laboratorio Colores y marcador indeleble
Bitácora Dos asas bacteriológicas
Encendedor o cerillos Cuaderno de reportes
2.- Por equipo deberá traer:
Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Una caja de portaobjetos Un metro de franela
Una tijera de punta recta Bolsas de plástico grandes
Una pinza de punta roma Una fibra y una esponja
3 botes de lámina Una caja de ligas no.8
Una bolsa de cucharas de plástico
Un kg de bolsas de un kilo nuevas
3.- Por sección:
Un candado con llave Una caja de cubreobjetos

Jabón líquido para trastes Un barniz de uñas transparente
Jabón líquido para manos
4.- Cada sección deberá traer un candado para su gaveta y cada equipo tendrá una llave, donde podrá
guardar exclusivamente material de Microbiología.
5.- Por grupo deberá traer.
Un rollo de gasa hospitalaria Una caja de guantes de látex

4 jeringas de 10 ml estériles Un litro de solución salina estéril
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

1.- Se impartirán dos sesiones por semana de 1.5 horas cada una.
2.- Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.
3.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.
4.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos.
5.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del
profesor, se considerará que no asistió a la práctica.
6.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
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7.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el
alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada con una
tolerancia de 5 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar tarde ya no se le
permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.
8.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que este
cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que alguna fracción este escrita con lápiz, se sugiere
el uso solo de bolígrafo color negro, azul, rojo y en caso de esquemas biológicos lápices de colores.
9.- El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión,
apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo que se
vaya modificando.
10.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo responsable,
para ello tiene como mínimo una semana, de lo contrario el vale se irá al expediente del alumno.
11.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo
práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
12.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio, a la persona encargada del
almacén del laboratorio y debe limpiar la mesa con benzal antes de iniciar y al terminar la práctica.
13.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
14.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.
15.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará acordada
con el profesor responsable de la práctica, deberá traer bata y si va a continuar con su trabajo
experimental, traerá el material que va a necesitar.
16.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se depositará
en una bolsa de plástico para su desecho.
17.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.
IV. BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio.
2.- Uso obligatorio de bata. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas.
3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica.
4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se utilice en
la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar desinfectar la
superficie de trabajo.
5.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos y a profesores.
5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que
evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos u oídos.
6.-No se permitirá el uso de cabellera suelta, flecos, barba, piercings; los alumnos con cabello largo y
fleco se los recogerán, los alumnos con barba se la deberán quitar, aquellos alumnos con piercing
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deberán quitárselos o cubrirlos durante el trabajo de laboratorio ya que todos estos constituyen
fuentes de contaminación. Se trabajará con las uñas cortas y zapato cerrado.
7.- Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica.
8.- Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda y guantes. Entrar al laboratorio con la bata
debidamente abotonada.
9.- No se debe pipetear con la boca. Utilizar pipeteadores o pipetas automáticas.
10.-Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados.
Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar micropartículas que
pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la
flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad.
11.- Evitar desplazarse en el laboratorio.
12.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en los
cultivos.
13.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe
realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola
vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.
14.- Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.
15.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El material de
vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.
16.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el laboratorio
17.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio.
18.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante, este
proceso se hace antes y después de terminar la sesión de laboratorio.
19.- En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se
deberá cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja.
20.- Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias
inflamables, revisar periódicamente las instalaciones y la flama del mechero beberá estar en azul, para
ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla de aire-
gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente.
21.- Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un solvente,
nunca soplar, se deberá emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se extiende,
usar el extintor dirigiéndolo a la base de las llamas.
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Actividades:
I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)
A.NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-
infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
B.NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías
a.Desinfección del área de trabajo
b.Código de colores (instalaciones de gas)
c.Uso del contenedor para punzocortantes
d.Botiquín
e.Extinguidores
II.- Conocimiento del material básico de laboratorio
a.Material de cristalería
b.Uso del mechero
III.- Equipo de laboratorio
a.Cuarto de incubación
b.Cuarto de refrigeración
c.Incubadoras
d.Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica
e.Campana de flujo laminar
f.Campana de extracción
IV.- Material para la gaveta
a.Frasco con benzal
b.Frasco con alcohol
c.Frasco con torundas
d.Frasco con benzal para pipetas
e.Varilla acodada y base de caja de Petri
f.Frasco con benzal para material de desecho
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PRÁCTICA No. 1
TINCIONES Y USO DEL MICROSCOPIO
UNIDAD: II Introducción y técnicas de aplicación en Microbiología
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio compuesto.
1.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas.
1.2.2. El alumno realizará frotis bacterianos para realizar tinciones simples, diferenciales y selectivas.
1.2.3 De las preparaciones realizadas el alumno las observará de manera correcta en el microscopio,
utilizando la iluminación de Köhler.
2.- INTRODUCCIÓN
Los microorganismos no teñidos muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico generalmente se
basa en las diferentes afinidades tintoriales de los microorganismos por lo que para poder observarlos
es necesario teñir la célula proceso que resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicas muy
complejas
Algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo, algunos colorantes que han teñido
en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.
La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están
formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas
(cromóforos) que están asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos
tienen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo
funcional llamado auxócromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la
célula.
Los colorantes se clasifican en ácidos o básicos, términos que no indican necesariamente sus
reacciones de pH en solución, sino más bien, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica. Desde
el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación,
tratamiento con colorantes y observación.
Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida
se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de agua.
Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar
la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de
una flama.
Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos
anteriores. Puede ser de varios tipos como simples, diferenciales y específicas.
Para poder observar estas preparaciones es necesario el uso de un instrumento óptico que amplifica la
imagen de un objeto pequeño, denominado microscopio. Es el instrumento que más se usa en los
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laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación
se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de
miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan
tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y
otras mediante instrumentos.
I.- Microscopio óptico
Es un instrumento, que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los
microorganismos. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de
resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar
como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar
la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del
espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución
que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por
un filtro verde y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el
objetivo, pero no puede aumentar la resolución.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: Sistema de iluminación; Sistema óptico y
Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente
la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el
condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que
permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el
movimiento y cambio de las lentes, así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base,
estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y porta-revolver.
Función básica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecánico
Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato
Brazo o Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la
preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con
los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas
numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar
la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
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Revólver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto
aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que
dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos
tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una
diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala
grabada para poder ajustar la distancia; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema
mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo
micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil.
b.- Sistema de iluminación
Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 12 V,
50-100 W.
Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro
de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad
de luz que atraviesa la preparación.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el
objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco
y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.
c. Sistema óptico
Oculares
El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen
final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es
de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.
Tubo
El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, éste puede ser
monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una
cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija
entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio
es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
Objetivos. - Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen
aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los
objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a
detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1).
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos.
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
4.- El lado inferior la distancia mecánica.
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos.
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6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2).
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que acepta
cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor.
Con el objetivo de 100 X no se debe de utilizar cubreobjetos.
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 1. Correspondencia entre

los aumentos y los anillos de Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en
colores grabados qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo
Aumentos Color anillo Índice de
superior Carácter Sustancia refracció Color del anillo
1.0X Negro n
2.5 X Pardo Oil Aceite 1,515 Negro
4.0 X Rojo W Agua 1,333 Blanco
10 X Amarillo Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado
16 X Verde claro Metileno Yoduro de 1,740 Amarillo
25 X Verde oscuro metileno
40 X Azul claro
100X Blanco
Aumentos totales:
El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número
de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de
aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando.
Distancia mecánica:
Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre la luz por el interior del microscopio desde que
penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular. La distancia mecánica se
mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de
nuestro microscopio es de 160 mm.
Poder de resolución:
El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos
puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µm y el electrónico de
transmisión es de 5 Ángstrom (0,5 nm) y el microscopio electrónico de barrido entre 30 y 200 Ángstrom
Apertura numérica:
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Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del
condensador o del objetivo.
II.- Microscopio de contraste de fase
Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una
célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de
refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de
luz que pasaron la muestra, aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de
anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz
de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las
porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos
densas, por lo tanto, este microscopio se utiliza para observar células vivas y cortes histológicos teñidos.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque
emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo, puede detectar partículas individuales más
pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar
autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum
microorganismo causante de la sífilis.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
5 portaobjetos Lámpara de alcohol o mechero

Asa bacteriológica Microscopio compuesto
3.2 REACTIVOS
Aceite de inmersión Verde de malaquita
Reactivos para tinción de Gram Reactivos para la tinción de Zielh Neelsen
3.3 MATERIAL BIOLÓGICO
Cultivos puro de Staphylococcus sp Cultivo puro de Bacillus subtilis
Cultivo puro de Escherichia coli Cultivo puro de S. cerevisiae
Muestra de lodos Cultivo puro de Micrococcus luteus
3.4 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
Colores Muestra de agua estancada
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Preparación de Frotis:
Método A: Cultivo en tubo en medio sólido inclinado.
4.1.1 Procedimiento
a)Limpiar el portaobjetos con una torunda con alcohol.
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b)Colocar la etiqueta sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente
pegada a la izquierda de la preparación, (si es necesario colocar otra del lado derecho), con la siguiente
información: Nombre del microorganismo, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.
c)En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con dos ml de agua, de ahí tomar con el asa
una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
d)En el mechero, flamear el asa al rojo vivo, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el
asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda
tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo
aproximadamente un cm 2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para
esterilizarla.
e)Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
f)Fijar el frotis con calor, pasarlo rápidamente por la flama, luego colocarlo en el dorso de la mano, si
soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operación una vez más. Dejar enfriar el
portaobjetos antes de teñir.
Método B: A partir de una suspensión microbiana
a.Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.
b. Flamear la boca del tubo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.
c.Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d.Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y
flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
II.- TINCIONES FIJAS
4.3 Tinción simple
a)Tomar la preparación fija de Saccharomyces cerevisiae y colocarla el colorante según el siguiente

cuadro:
Equipo Colorante
1y6 Azul de metileno
2y7 Safranina
3y8 Cristal violeta
4y9 Verde de malaquita
5 y 10 Lugol
b)Tomar el tiempo por 1 minuto
c)Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
d)Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.
4.4 Tinciones diferenciales
4.4.1 Tinción de Gram:
a)Colocar los frotis correspondientes de cada uno de los microorganismos Bacillus atropheus (antes
Bacillus subtilis), Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces
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cerevisiae, en el puente de coloración.

b)Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c)Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d)Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e)Lavar los frotis con agua de la llave.
f)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos.
g)Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h)Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i)Lavar los frotis con agua de la llave.
j)Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)
4.5 Tinción de Gram con exceso de decoloración
Colocar un frotis fijado de Bacillus atropheus y de Escherichia coli en el puente de coloración.
a)Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
b)Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
c)Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
d)Lavar los frotis con agua de la llave.
e)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.
f)Lavar inmediatamente con agua de la llave.
g)Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
h)Lavar los frotis con agua de la llave.
i)Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio a 100 X.
4.6 Tinción de Gram aplicada a una suspensión de microorganismos:
a)Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

b)Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c)Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d)Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante un minuto.
e)Lavar el frotis con agua de la llave.
f)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos.
g)Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h)Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i)Lavar el frotis con agua de la llave.
j)Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite y observar al microscopio con el objetivo de 100 X.
15
4.7 Tinción de Ziehl-Neelsen.
a)Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración

b)Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores,
aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se
enfríe.
c)Enjuagar con agua de la llave.
d)Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.
e)Enjuagar con agua de la llave.
f)Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto
g)Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión
4.8 Tinción específica
4.8.1 Tinción de Shaeffer–Fulton
a)Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta
que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.
b)Dejar que el frotis se enfríe y lavar con agua de la llave.
c)Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión
Diferentes tipos de posición de las esporas

En la realización de las tinciones podemos tener ciertos errores como son:
Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo de un cultivo joven presenta una pared celular sin
alteración. El mismo microorganismo, si sufre daño en la pared por alguna causa puede teñirse y
observarse como una bacteria Gram negativa. Esto indica la importancia de la pared para la retención o
salida del colorante.
Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el
alcohol-acetona, entonces la preparación resultará Gram negativa, debido al tiempo prolongado de
exposición con el decolorante.
III.- Observación microscópica

a) Transportar el microscopio en forma vertical tomándolo del brazo con una mano y con la otra, en la
base.
b) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso
16
de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)

c) Con una brocha de cerdas suaves retirar el polvo de la parte mecánica y con una perilla de la parte
óptica.
d) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una franela húmeda.
e) Limpiar la parte óptica (lentes) del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.
f) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación.
g) Conectar el microscopio a la toma de corriente.
h) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler.
IV.- Observación de una muestra en fresco

a) Desengrasar un portaobjetos, limpiándolo con una torunda de algodón impregnada de alcohol.
b) Colocar una gota de la muestra de agua estancada.
c) Colocar sobre la muestra un cubreobjetos con mucho cuidado, tratando de no capturar burbujas
d) Observar la preparación a 10 y 40 X
Observaciones de preparaciones fijas
a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X.
b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X.
c) Observar la preparación que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biológico.
d) Ahora mover la preparación para enfocar la preparación con poca cantidad de muestra y comparar.
Cuidado y limpieza del microscopio
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
1)Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de
aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
2)Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento
de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
3)Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas.
Algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio son:
a) Espuma de jabón suave: Solo para remover lo sucio de la superficie del instrumento.
b) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos: Para un pre limpiado de la óptica.
c) Solución para limpiar la óptica: Etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o
remover residuos de aceite de inmersión.
17
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 realiza un esquema biológico, indicado lo que observaste en la preparación en fresco.
5.2 Resumen de las tinciones simple.
Equipo/ S. cerevisiae Colorante a utilizar Color adquirido Agrupación
1y6 Azul de metileno
2 y7 Safranina
3y8 Cristal violeta
4y9 Verde de malaquita
5 y 10 Lugol
Resumen de tinciones
Microorganismo Tinción Color Forma Agrupación Resultado
1 Simple (colorante usado)
2. de Gram
3. de Shaeffer y Fulton
4. de Gram decolorado
5 Zielh-Neelsen
5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Tipo de microscopio Aplicaciones
Compuesto
Contraste de fase
Electrónico
Estereoscópico
Fluorescencia
5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio Función
Condensador
Diafragma
Filtro azul
Lámpara
Objetivo
Ocular
Platina
Revolver
Tornillo macrométrico
y micrométrico
18
5.5 Realiza los esquemas correspondientes anotando de manera correcta el nombre de la cepa, la forma
y agrupación que presenta.
5.6 Que problemas se tienen al realizar una preparación muy gruesa y otra muy delgada?
5.7 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS (tercera sesión)
Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler, el uso del microscopio óptico, la
manera que influye una preparación muy gruesa. Analiza las diferencias de las tinciones utilizadas y sus
aplicaciones.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos
y la bibliografía consultada.
8.- BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
8.1. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté mexicana, S.A. de C.V. 1991.
8.2 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por
la Asociación de Químicos del INN.
19
PRÁCTICA No. 2
ESTERILIZACIÓN Y CONTROLES
UNIDAD I: Introducción y técnicas de aplicación en microbiología
1. OBJETIVOS
El alumno preparará material de uso común en un laboratorio de microbiología para su esterilización y
analizará los diferentes métodos para seleccionar el más adecuado acorde a la naturaleza del material
1.2 Objetivo específicos
1.2.1 Preparará el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor húmedo.
1.2.2 Esterilizará el material e preparado, por calor seco y calor húmedo, haciendo uso de controles de
esterilización.
1.2.3 Realizará el proceso de filtración a través de membrana.
2. INTRODUCCIÓN
La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismos de una superficie,
existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es
necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de
esterilización.
1 Métodos físicos
Calor húmedo:
La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que
no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas, pero no
las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de
presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas,
generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se
encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en
todas las partes del recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que
circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una
temperatura de 160 –170 °C durante una h.
El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la
célula y fragmentando las membranas celulares.
Flameo:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para
esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de
ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar”
diseminándose partículas infectantes.
20
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización
completa. El método es rápido, pero produce carbonización y pérdida del filo.
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre
pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos,
las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.
Filtración a través de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco
pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna
propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de
membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer
las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro
adecuado (diámetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,
asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como
bioindicador a Brevundimonas diminuta (antes Pseudomonas diminuta) para filtros con un diámetro de
poro de 0,45 µm
2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y  propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la
industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y
además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 %
de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad
de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C,
cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es
de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno
residual porque es muy tóxico.
La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva
después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más
rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser
cancerígena.
3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).
En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que
manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,
para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y
posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
21
Método de la tira de papel

Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan
en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado
(testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca (problema
y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras
se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 °C en caldo de soya y
tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización no fue la
correcta habrá desarrollo en la tira testigo.
Método de la ampolleta:
Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo. La
temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C; dentro del
medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar
la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el
material, después de terminar la esterilización, las ampolletas (sin
abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el enturbiamiento y
la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa,
en cambio si el color permanece igual durante varios días de
incubación el equipo está funcionando bien. Debe llevarse el control
constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo,
incubada en las mismas condiciones, debe mostrar desarrollo
bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
Métodos físicos para esterilizar:
A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización
completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo.
Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las
células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas
en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Autoclave a 121°C  Incubadora a 35°C

Autoclave a 110 °C  Baño María a 55°C
Horno a 170 °C  Termómetros de 150° y 200°C
3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección)
Dos botes de lámina  Una jeringa de 5 ml
Un cilindro pipetero  Una pinza de disección
Un cilindro para cajas de Petri  Una tijera de disección
Dos filtros estériles swinnex con empaque  Un matraz con 50 ml de suspensión de
22
Tres matraces de 125 ml con 50 ml de Escherichia coli (suspensión turbia)

Caldo nutritivo (CN) estéril  Frasco con benzal
  Un contenedor para punzocortantes
Material por equipo
 Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm  Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con
para tapón de tubo esporas de Geobacillus stearothermophilus
 Tres cuadros de papel aluminio de 20X20  Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón.
cm para envolver pinza o tijera
 Cuatro cajas de Petri limpias
 Tres cuadros de papel aluminio de 12X12
 Tres pipetas de 10 ml limpias
cm para tapón de matraz
 Un clip o aguja de disección
 Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm
para gorro de matraz  Cuatro matraces de 125 ml y uno de 250 ml
 Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm  Algodón suficiente para tapones de matraces
para gorro de matraz
 Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin
 Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm tapón
para cubrir un bote de lámina.
 Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón
 Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm
para envoltura de pipeta de 10 ml.  Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo
nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la
 Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm práctica)
para caja de Petri
 Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo
 Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm nutritivo estéril
para envoltura de pinza o tijera.
 Un frasco con alcohol
 Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm
para tapón de matraz.  Cuatro matraces con 50 ml de caldo nutritivo
estéril
 Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm
para tapón de matraz.  Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para
tapón de tubo
3.3 MEDIOS DE CULTIVO

 Caldo nutritivo
3.4 CEPAS MICROBIANAS
 Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con esporas.
 Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN
4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a)Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el
material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de preferencia
extrán.
23
b)Enjuagar suficientemente con agua de la llave

c)Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a.Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor
b.Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar
fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
4.2.2 CAJAS DE PETRI
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel,
la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.
4.2.3 PIPETAS
a.Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b.Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón
c.Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con
masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo
de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a.Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b.Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c.En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No
anotar los datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS
a.Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.
b.Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
4.3.1 TUBOS DE ENSAYE
a.Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.
b.Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
c.Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
4.3.2 CAJAS DE PETRI
a.Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición
invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL
CONTAMINADO)
24
b.Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la
fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
4.3.3 PIPETAS
a.Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado.
b.Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón.
c.Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
d.Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la
tira entre la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo
con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR
CALOR HUMEDO)
a.En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con la
siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de
Geobacillus stearothermophilus.
b.Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos.
c.Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC  2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente
durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparición de turbidez.
4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo
b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus
stearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.
c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC  2°C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la
bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
Pasos para realizar una buena esterilización:
-Tener cuidado de eliminar todo el aire de la autoclave.
-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical
- -Observar que el manómetro registre la presión
-Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.
-Al terminar de esterilizar dejar la autoclave sin agua
25
4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

a)Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la
temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada.
b)En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de
Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar.
Esterilizar a 170 oC/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.
c)Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro
indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.
d)Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira de
papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de caldo
nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55  2oC durante 5 días. Observar diario y anotar cualquier
cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO
a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus
stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.
b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).
4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA
Sistema de filtración Swinnex marca Millipore

a)Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del
empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.
b)Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro
colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35  2 oC de 48 a 72 h.
c)Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición
de turbidez durante 3 días.
d)El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Brevundimonas diminuta (antes
Pseudomonas diminuta), para membranas con un diámetro de poro de 0,2 m.
Esterilización de material de desecho

-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,
nunca se esterilizan por calor seco
-5. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?
5.2. ¿Por qué utilizamos el papel Kraft para envolver el material?
5.3 Explicar ¿por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye?
26
5.4 Completa el siguiente cuadro, anotando si hubo no turbidez en los tubos
Tratamiento Calor húmedo Calor seco Filtración a través Control Control

Método
110°C/10´/6lb 121°C/15´/15lb 170°C/2 h de membrana positivo negativo
Resultado
(turbidez)
5.5 ¿Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay
crecimiento después de la incubación?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir ¿cuáles son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel
Kraft para su esterilización por calor seco y húmedo?
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así
como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.
8.2 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice
Hall, España. 956 pág.
27
PRÁCTICA No. 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS
UNIDAD II: Cultivo de microorganismos.
1 OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
Identificará los diferentes medios de cultivo según la NOM-065-SSA-1993, que establece las
especificaciones sanitarias de los medios de cultivo o nuestras necesidades.
1.2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y
sintéticos de acuerdo a la NOM-065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo,
los esterilizará y vaciará para su uso.
2.- INTRODUCCIÓN
Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones
inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas
grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.
La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera
preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas
interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.
Nutrición.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo
se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.
b.- Nutrientes útiles, pero no indispensables, que se emplean si están presentes, pero no son
esenciales. Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las
macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de
energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente
puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y
micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente
y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar
cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción.
Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible
determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté
presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del
medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las
rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos
adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos
medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.
28
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo,
formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:
a) Fuente de carbono
b) Fuente de nitrógeno
c) Fuente de azufre
d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o
vitaminas que no pueden sintetizar)
e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o
metales pesados.
g) Indicadores de potencial oxido-reducción.
h) Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de
los medios de cultivo. Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la
reproducción de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el
medio o en las características típicas de las colonias.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de
microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el
crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del
medio de la membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que
tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser
más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;
para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se
llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de
bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.
29
En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los
medios de cultivo como son:
a.La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b.Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza
c.Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización,
caramelización o pérdida de actividad nutricional.
d.pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante
e.Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación
comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras
ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se
encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un
cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de
microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.
Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo
gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas, pero todas se centran en la formación de
estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura
(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo
proveniente de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a)Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio
por la superficie inclinada del agar.
b)Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada
y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en
el medio líquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos
con agar inclinado
b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un
sedimento, una película superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede
hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario.
Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para
completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la identificación de
microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras
pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.
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Agar bacteriológico
El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados, sales
insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,
particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar
es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como
polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable,
con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El
agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua
hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas,
que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que, al enfriarse, ya no
cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la
solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.
Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios
de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:
a) Su estructura les confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias
marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.
c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se
incuban hasta temperaturas de 65 °C.
d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.
e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al 1,5
% (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.
f) Sus empleos en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los
cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.
Clasificación de medios de cultivo
I.- Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos
a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.
b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.
c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.
II.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos. - Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos o
grupo de microorganismos de interés.
b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún microorganismo.
c) Medios selectivos de enriquecimiento. - Son medios que estimulan la multiplicación de algún
germen determinado e impiden la reproducción de otros.
d) Medios diferenciales. - Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para detectar
cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.
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e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. - Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que
requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo
tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.
III.- Por su composición
a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético como
el caldo glucosa sales.
b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo
como el agar base sangre.
Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios
semisólidos y en placa medios sólidos.
IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).
Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias desinfectantes
o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar Mueller Hinton, agar
cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.
Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo, para el Agar de papa y
dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.
Microorganismo Cepa Resultado
Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno
Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno
Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:
Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metálico
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes
Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa pálido.
Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado,
además es parte del control de calidad de los medios de cultivo.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO
●Balanza granataria ●Potenciómetro
●Autoclave ●Algodón
●Horno 170° C ● Gasa
Papel Kraf Refrigerador
Incubadora a 28° C  Incubadora a 37° C
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3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I)

●Un mechero Fisher ●Una pipeta de 10 ml
●Una espátula ●Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm
●Seis matraces de 250 ml ●Una probeta de 100 ml
●Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm ●Un termómetro
●Dos matraces de 125 ml  Seis cajas Petri
Sesión II
 Tres tubos con 3 ml de medio SIM Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales
 Tres cajas con agar EMB Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo
 Tres tubos con agar PDA Tres tubos con agar nutritivo
Tres cajas con agar nutritivo Tres cajas con un medio enriquecido
Tres tubos con 3 ml de caldo glucosa sales Tres tubos de caldo nutritivo
3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
●Agar nutritivo (AN) ●(NH4) 2SO4
●Agar eosina azul de metileno (EMB) ●K2HPO4
●Agar de papa y dextrosa (PDA) ●MgSO4 7H2O
●Medio SIM ●MnSO4 4H2O
●Glucosa ●Agar bacteriológico
Agar base sangre Agar rosa de bengala
 Escherichia coli Penicillum sp.
 Bacillus sp. Aspergillus sp.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.
a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su empleo.
b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.
e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la
proyección en el momento de la ebullición.
f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen.
g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que
se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.
h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25° C.
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i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de
materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.
j)Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y
protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de
color o de consistencia etc.
k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido tartárico
no puede ser esterilizado una segunda ocasión.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar)
a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.
b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:
Reactivo Cantidad
Glucosa 5.0 g
(NH4) 2SO4 2.0 g
KH2PO4 0.05 g
K2HPO4 0.05 g
MgSO4 7H2O 0.25 g
MnSO4 4H2O 0.001 g
Agua destilada 1000 ml
c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer
lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2 si
fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro.
d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, colocarle el
tapón de algodón su gorro de papel Kraft y colocarlo en el autoclave.
e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de lámina
f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la
concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio.
g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente.
h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de
lámina para su esterilización.
i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave.
j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110°C durante 15 minutos. Una vez que se ha
llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar.
k) Enfriar el matraz hasta 45°C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.
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m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en
refrigeración para su uso.
4.3. MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
4.4 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta
y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas y en el refrigerador.
4.5 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.
c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.
d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro
e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,
taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.
f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.
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4.6 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.
b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa.
d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida y en el
refrigerador.
4.7 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
4.8 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta
y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
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4.9 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)
h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.
i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.
j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
m) Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será
necesario fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10%
estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.
4.10 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfuro Indol Movilidad).
a) Pesar la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase
e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.
4.11 MEDIO COMPLEJO Y ENRIQUECIDO (Agar Baird-Parker, medio que se utilizará en
aislamiento)
Este medio de cultivo contiene cloruro de litio y telurio para la inhibición de la flora acompañante, en
tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de Estafilococos.
Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de Estafilococos
muestran dos características diagnosticas por la lipólisis y proteolisis, se producen halos y
características y, debido a la reducción del telurio a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción
con la yema de huevo y la reducción del telurio se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-
positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última.
Formula
Ingredientes Cantidad
Medio base 95 ml
Solución de telurito de potasio 1.0 ml
Emulsión de yema de huevo 5.0 ml
Preparación
a.- Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.
b.- Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar.
c.- Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.
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Preparación del medio base de Baird-Parker

a.- Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1
min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45ºC.
Preparación de la solución de telurito
a.- Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios
meses a temperatura de 0 a 5ºC.
Preparación Emulsión de yema de huevo
a.- Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de
tintura de yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000).
Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril.
b.- En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador
de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con
solución salina isotónica.
c.- Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para
formar la emulsión y filtrar a través de gasa.
d.- En tanto que el medio de cultivo basal puede aguardarse de 1 a 2 meses a 4 º C, el medio de cultivo
completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparación.
4.12 MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C.
e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada.
f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.
g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.13 AGAR ROSA DE BENGALA

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C y vaciar en placas estériles
e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.14 CONTROL DE ESTERILIDAD

a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e
incubarlos a 35 °C durante 3 a 5 días.
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b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación.
NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARÁN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
SESIÓN II
4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon
4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA)
Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.
a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el
esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.
f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.
4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA

a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el
inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del
mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se
indica en el esquema
f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 h.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.
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4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)
a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que

corresponden una para cada alumno y testigo
b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.
c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la
boca del tubo por la flama del mechero.
d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo.
e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.
g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28° C, de 3 a 5 días.
h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento.
4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA
a) Tomar un hisopo estéril.

b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y
pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión.
d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se
indica en el esquema
f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 °C/24 h, y
observar el crecimiento.
4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO
a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS
b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la
superficie del medio inclinado de agar nutritivo.
c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en “S” la superficie del
medio inclinado de agar de papa y dextrosa.
d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37° C para bacterias y
a 28° C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.
40
4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)
a) Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste

“agitándolo” en las paredes del tubo o matraz, evitar la
formación de grumos.
b) Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y
sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas
y micelio para disgregarlo en el medio.
c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35° C/24 h, y el matraz con hongos a 28° C/ 5 días en
agitación a 120 rpm
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas.
f) Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación.
4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)
a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.

b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo
y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de
que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio).
Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
c) Incubar los tubos a 37° C/ 24 h.
d) Observar los cultivos a las 24 h y anotar las características del cultivo.
4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL
Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras

Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:
a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al
tiempo de incubación.
b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:
c.- Elevación: Que puede ser:
d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser:
41
e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.

f. Aspecto: Húmedo o seco
g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.
Morfología colonial en placa para mohos:
a. Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de ø y va de 3 a 5 días.
b. Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.
c. Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo,
verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.
5.1 completa el siguiente cuadro.
Condiciones de Clasificación por su Clasificación por su Presentación del

Medio de cultivo
esterilización consistencia composición medio
Caldo Glucosa sales Ejemplo 110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
SIM
Agar sangre o ABP
Agar rosa de bengala
5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?
5.3 De los siguientes medios, mencionar ¿en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué
tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.
5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por qué?
5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe ¿cómo es el crecimiento con y sin agitación?
5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar?
5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de la
morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.
42
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la
bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª
Edición. Interamericana. México. 140 p.
8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2
8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los
medios de cultivo. Generalidades.
8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.
43
PRÁCTICA No. 4
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS
UNIDAD II: Cultivo de microorganismos
1. OBJETIVOS:
El alumno aislará microorganismos para obtener un cultivo puro y cuantificará las bacterias mesofilicas
aerobias en un producto farmacéutico.
1.2.1 El alumno aislará microorganismos utilizando diferentes medios de cultivo para describir la
morfología colonial.
1.2.2 El alumno cultivara algunos microorganismos previamente aislados.
1.2.3 El alumno realizará el recuento de microorganismos haciendo uso de la NOM 089-SSSA-1994,
Bienes y servicios. Método para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza o de
la Farmacopea de Los Estados Unidos Mexicanos.
2. INTRODUCCIÓN
El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro o axénico se realiza en un medio
sólido y líquido. Se inicia por la separación de una sola célula a partir de una población y requiere
también que la colonia que surja de esta célula se mantenga separada de otras células o colonias.
El aislamiento en medios líquidos, se realiza siempre que el microorganismo predomine en el material de
partida. Se realiza una serie de diluciones con la finalidad de reducir el número de células, que al ser
sembradas en placa se pueden separar fácilmente.
En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se
establecen interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato común, la técnica utilizada
y el tipo de medio seleccionado dependen de la naturaleza de la investigación, en general podemos
tener:
a) se puede necesitar tener una cosecha de células;
b) puede ser necesario determinar el número y tipos de microorganismos presentes en una muestra o
c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural.
Siguiendo con una serie de condiciones la siembra en placa de una muestra permitirá producir colonias
a un grupo seleccionado de formas, pero hará que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta
razón es costumbre sembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de
incubación diferentes como sea posible.
El sembrado en placa en un medio sólido nos proporciona células inmóviles o dentro del medio, las
cuales estarán separadas y de ahí se pueden transferir a tubo con agar inclinado para su conservación.
Cultivo puro
Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola célula, generalmente se realiza para
poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas, es decir “caracterizar” una cepa.
a.- Aislamiento por estría simple
Esta técnica se aplica principalmente para muestras que poseen poca carga microbiana
44
b.- Aislamiento por estría cruzada

Inocular con el asa la placa y realizar las estrías tal y como se muestra en el siguiente esquema
c.- Aislamiento por extensión con varilla
d.- Aislamiento por la técnica de vaciado en placa
Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribución homogénea del inoculo, las diluciones se
realizarán para que en un ml se obtengan de 25 a 250 UFC (unidades formadoras de colonias) de
bacterias y de 15 a 150 UFC de, mohos y levaduras. Las placas a contar se seleccionan entre estos
límites, según la recomendaciones de la NOM-092-SSA-1994; Método para la cuenta de bacterias
aerobias en placa.
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que
deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos
productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.
Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibición,
producción de amilasas o producción de hidrólisis.
El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna
característica como hidrólisis o hemólisis.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 EQUIPO

 Balanza digital Incubadora a 37oC y 20°C
 Autoclave  Horno a 170°C
 Cuenta colonias  Bolsas de plástico estériles
3.2 MATERIAL
 Cuatro cajas de Petri estériles  Una varilla de vidrio acodada

 Una gradilla metálica  Algodón y gasa
 Un cilindro con pipetas estériles de 10 y2 ml  Cinco tubos de 16 X 150 mm con 9 ml de CLM
45
 Cuatro placas con medio EMB  Un matraz con 100 ml de ACS o ALM
 Cuatro placas con medio ALM o ACS  Cuatro placas de agar Baird Parker, cetrimida o
sangre
 Cuatro frascos de dilución con 90 ml de CLM
3.4 REACTIVOS
 Un Frasco con alcohol  50 ml de Tween 80 estéril

Muestra de producto (Gel para el pelo, desodorante, crema para la piel, champú, loción para afeitarse,
agua de tocador, maquillaje, talco o esmalte)
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
4.1 Cuenta total de hongos, levaduras y mesofílicos aerobios Los equipos pares realizarán la
determinación de mohos y levaduras y los nones la cuenta total aerobica.
Toma de muestra (del producto)
a) Analizar la muestra tan pronto como sea posible. Si es necesario almacenar, debe hacerse a la
temperatura ambiente.
b) No incube, refrigere o congele las muestras antes o después del análisis.
c) Inspeccionar las muestras cuidadosamente antes de abrirlas y anotar cualquier irregularidad del
contenedor de dichas muestras.
d) Desinfectar la superficie del contenedor con un algodón estéril impregnado una solución de etanol al
70% con 4% de yodo o benzal al 0,001%
4.2 Antes de abrir y tomar la muestra o contenido; secar la superficie con gasa estéril.
a)Homogeneizar el producto al tomar la muestra necesaria de acuerdo a su estado físico. Para líquidos,
agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos, mezclar el contenido con una espátula estéril;
para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y tomar una muestra representativa; y para
aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente, expeler apropiadamente la cantidad de
producto previa agitación.
b)Preparación preliminar de las muestras
c)Para las muestras que sean miscibles en Caldo Letthen Modicado (CLM) y Caldo Dextrosa Saboraud
(CDS), adicionar 1 g o ml en 90 ml de CLM y 1 g o ml en 90 ml de CDS en condiciones asépticas.
d)Para las muestras que no sean miscibles en CLM y CDS (ejemplo, cremas, labiales, etc.), en 2 frascos
estériles o bolsas de polietileno estériles debidamente etiquetados; uno para CLM y otro para CDS,
adicionar 1 g o 1 ml de la muestra y agregar 0,5 ml de tween 80 estéril a cada uno de los frascos o
bolsas previamente marcados y homogeneizar la muestra.
e)En caso de usar los frascos poner en baño maría a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el
tiempo de exposición en el baño no debe exceder de 15 minutos).
f)Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 90 ml de CLM y 90 ml de CDS
respectivamente y agitar perfectamente.
46
4.3 Procedimiento
a)Incubar a 30ºC ± 2 durante 7 días los medios de cultivo inoculados. Marcar los frascos o bolsas que se
enturbien al agregar la muestra.
b)Confirmar si existe crecimiento a los 2 y 7 días de incubación.
c)Cuando el crecimiento sea evidente o se tenga duda de desarrollo microbiano, hacer una resiembra en
Agar Letthen Modicado ALM y Agar Extracto de Malta (AEM), inoculando 0,5 ml de cultivo del CLM y CDS
respectivamente, empleando el método de vaciado en placa o de dispersión con codos de vidrio
esterilizado.
d)Incubar durante 4 días a 30ºC ± 2.
Interpretación de resultados
Observar si hay crecimiento en los medios inoculados:
Si no hay crecimiento reportar: menos de 10 UFC/ml o g de muestra. Concluyendo el ensayo.
Si se presenta crecimiento, continuar con la prueba definitiva que se describe a continuación.
4.4 Cuenta total de mesofílicos aerobios, mohos y levaduras.
Procedimiento
a)Agregar por separado 10 ml o g de muestra a 90 ml de medio CDS y CLM (Dilución 10-1) cuando las
muestras sean miscibles en éstos.
b)Para las muestras que no son miscibles; en dos frascos o bolsas estériles debidamente etiquetados:
uno para CLM y otro para CDS, adicionar 10 g o ml de muestra y colocar 5 ml de tween 80 estéril a cada
uno de los frascos o bolsas previamente marcados. En caso de usar los frascos poner en baño de agua
a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo de exposición en el baño de agua no debe
exceder de 15 minutos).
c)Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 85 ml de CLM y 85 ml de CDS
respectivamente y agitar perfectamente. (Dilución 10-1)
d)A partir de la dilución 10-1, realizar diluciones seriadas según el crecimiento esperado de la siguiente
manera:
FRASCO DILUCIÓN VOLUMEN AGREGADO CLM o CDS ml
-2 -1
1 10 o 1:100 10ml de dilución 10 90
-3 -2
2 10 o 1:1000 10ml de dilución 10 90
3 10-4 o 1:10 000 10 ml de dilución 10-3 90
Para la cuenta estándar total, realizar las diluciones en CLM; y para la cuenta de hongos y levaduras,
realizar las diluciones utilizando el CDS. Mezclar hasta homogeneizar. Colocar 1 ml de cada dilución en
cajas de Petri estériles previamente marcadas con la dilución, registro y fecha, agregar de 18 a 20 ml de
medio de cultivo cuidando que la temperatura no sea mayor de 45ºC; para cuenta estándar total, utilizar
ALM; y para cuenta de hongos y levaduras, emplear AEM o PDA. Homogeneizar el inóculo en el medio
de cultivo, rotando la caja sembrada de izquierda a derecha, vertical y horizontalmente 6 veces en cada
ocasión. Dejar solidificar el medio de cultivo en las cajas. Si se emplea el método de dispersión con
47
codos de vidrio, utilizar 0,5 ml de inóculo por cada dilución y colocarlo en cajas de Petri conteniendo
ALM y AEM para cuenta estándar total y cuenta de hongos y levaduras respectivamente. Dispersar el
inóculo con codos de vidrio estériles. Dejar que se absorba el inóculo. Invertir las cajas e incubar: a 30°C
± 2 durante 48 horas para la cuenta estándar total; a 22ºC durante 5 días para la cuenta de hongos y a
35ºC por 48 horas para la cuenta de levaduras.
Cuenta total de mohos y levaduras
Contar el número de mohos y levaduras que se encuentren.
Reportar el número de colonias /ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada.
En el caso de utilizar el método por dispersión de codo de vidrio, el resultado se multiplicará por 2.
Concluyendo la prueba.
Cuenta total de mesofílicos aerobios
Contar las cajas en donde se encuentren de 25 a 250 UFC.
Reportar las UFC/ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada. En el caso de
utilizar el método por dispersión con varilla de vidrio, el resultado obtenido se multiplicará por 2.
4.5 Aislamiento por la técnica de estría cruzada
a)Sembrar por estría cruzada las placas de EMB, Agar nutritivo, Bair Parker o cetrimida con la
suspensión proporcionada
b)Obtener la morfología colonial
48
Conservación de la cepa
En un tubo de ensaye con agar de soya y tripticaseína inclinado, sembrar cada una de las colonias
aisladas y si es posible realizar una tinción de Gram para conocer la forma, agrupación y pureza.
En un tubo de ensaye con agar de papa y dextrosa inclinado, sembrar cada una de las colonias aisladas
de mohos y levaduras para su identificación.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Anotar los resultados en las tablas siguientes sobre la morfología colonial y microscópica de la bacteria,
moho o levadura.
CARACTERÍSTICAS Medio de Cultivo:_________________
Tamaño
Forma
Aspecto
Consistencia
Gram
Morfología microscópica
Con los resultados obtenidos por la técnica de vaciado en placa anota los resultados en la siguiente
tabla:
DILUCIÓN MEDIO DE CULTIVO UFC/ ml
Con los resultados obtenidos por la técnica de extensión con varilla anota lo que se pide en la tabla
siguiente:
DILUCIÓN MEDIO DE CULTIVO UFC/ml
49
5.3.1 ¿La técnica de estría cruzada permite cuantificar el número de microorganismos presentes en una
muestra?
5.3.2 ¿Para que se hacen las diluciones? ¿Podría sembrarse una muestra en forma directa?
5.3.3 Menciona 3 ventajas y desventajas al efectuar las diluciones:
Con una misma pipeta y usarla para sembrar.
Con una pipeta para cada dilución y utilizar otra para sembrar.
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS (Tercera sesión)
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas realizadas para el recuento de
microorganismos, así como los resultados obtenidos.
7. CONCLUSIONES
8.1 Atlas, R. W. Microbiology. 2ª. Edition. Mc. Millan Public. Co. 1988. 807 p.
8.2 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica
Panamericana. 2001. México. 1432 p.
8.3 Norma oficial mexicana 089-SSA1-1994.Bienes y Servicios. Métodos para la determinación del
contenido microbiano en productos de belleza
8.4 NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
Publicada en el diario oficial de la federación el día 12 de diciembre de 1995.
8.5 NOM-110-SSA1–1994, Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
50
PRÁCTICA No. 5
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD II: Cultivo de microorganismos.
1. OBJETIVOS:
1.1 El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a las
características de este.
1.2.1 El alumno conocerá los métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas de interés
eligiendo el método más adecuado.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana.
2. INTRODUCCIÓN
En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, teniéndose
varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las características del
microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues
sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños como la deshidratación,
cambios genéticos o perdida de la viabilidad.
Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un
laboratorio son:
 Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación;
 Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y
 Que estas células permanezcan genéticamente estables.
Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados,
que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos
restringidos.
A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han
muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones
sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los métodos de
conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células
de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde
51
todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro
factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la
edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y
empleo de agentes crioprotectores.
Conservación por liofilización.
Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el
agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a
veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de
las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla
mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la
viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores.
Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de
la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la
congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el
almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden
almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil.
Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que
influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la
deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en
nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de
microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de
evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es
conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del
agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como
crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y
actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores,
como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de glucosa con caldo
hígado (sin carne) para bacterias anaerobias.
Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de
conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación
alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.
B.- Métodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los
equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por
estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que
se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a).- Conservación por transferencia periódica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin
embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir
activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y
muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el
52
peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una
alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán
descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus
características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con
esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que
podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los
microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en
tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es
que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo
y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.
b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender
en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos, en este
caso la concentración celular no debe ser superior a 10 4-105 células /ml en el caso de bacterias y
levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de
agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en
agua de mar diluida.
C.- Métodos restringidos.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a
la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o
la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
a).- Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se
deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se
llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación
previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un
vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es
barato y de fácil conservación.
c).- Desecación en bolitas de alginato.
Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del
agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta
que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos
cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC
debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.
Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.
53
Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el

porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,
bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.
3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 ° C Autoclave
Congelador Horno
Refrigerador Balanza digital
3.2. MATERIAL
Cajas de Petri Gasa y algodón para un tapón

Portaobjetos Un tubo eppendorff de dos ml
Pipetas de un ml Una espátula de acero inoxidable
3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
 Dos tubos de 13 X 100 con TSA inclinado  Un matraz con 30 ml de caldo BHI
con tapón de baquelita
 Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado
 Un tubo con 4 g de arena en tubos con tapón de baquelita (de esporas)
 Un matraz con 80 ml de ACS  Dos tubos de 13 X 100 con PDA.
 Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base  Un tubo de 13 X 100 con PDA.
sangre con tapón de algodón
 Un matraz con 80 ml de PDA
 Cinco tubos con 9 ml de solución salina
 Un tubo de 13 X 100 mm estéril.
 Un matraz con 30 ml de BHI
3.4. REACTIVOS:
 Glicerol al 60 % estéril Aceite mineral

 Acido tartárico Colorantes para tinción de Gram
 Colorantes para tinción de esporas Azul de algodón lactofenol
3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL

Escherichia coli Agar eosina azul de Rhizopus sp Agar de papa y
metileno dextrosa
Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y
dextrosa
Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y
dextrosa
Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa Agar cetrimida
Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS
54
Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente:
Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar
1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae
2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger
3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii
PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DÍA 1
1)Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo
esporulado, realizar la tinción de esporas.
2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del
microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 °C durante toda la noche
en agitación a 150 rpm.
DÍA 2
3)A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a 35
°C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con
tapón de algodón.
4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de
conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.
DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a
temperatura de refrigeración de 4 °C
Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te La suspensión es para obtener el número de células / ml
ha tocado
Del matraz realizar lo siguiente:

4)Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.
5)Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
6)Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas
55
diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre Fecha de Fecha de Fecha de Determinación Determinación % de

de la siembra del siembra de conservación de viabilidad de viabilidad Viabilidad
cepa matraz los tubos (1era. vez) (2da.da vez)
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del
microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha
conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
Conservación a Conservación
Medio de Conservación con
Cepa a conservar temperatura
cultivo a 4 °C aceite mineral y a 4 °C
ambiente
Escherichia coli EMB
Bacillus subtilis AN
Micrococcus luteus AN
S. aureus ASM
S. cerevisiae ACS
P. aeruginosa Agar cetrimida
L. delbrueckii Medio MRS

Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
Al tubo con arena
2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas
56
PARA MOHOS: DÍA 1

1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un microcultivo,
pero en este momento aún no conoces la técnica).
2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón
3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita
4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita
5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C
DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de Se conservará a temperatura ambiente

algodón
Tubo No. 2 que tiene el tapón de Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C

baquelita
Tubo No. 3 que tiene el tapón de Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de
baquelita refrigeración de 4 °C
Tubo de 16 X 150 mm con tapón Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3
de baquelita ml de solución salina y con la ayuda del asa resuspender para
tener la cosecha de esporas y poder obtener el No de células / ml
Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente:

1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo
2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.
3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas
diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre de Fecha de siembra Fecha de siembra Fecha de Determinación de Determinación de % de

la cepa del matraz de los tubos conservación viabilidad (1era. vez) viabilidad (2da.da vez) Viabilidad
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el
agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
57
Cepa a conservar Medio de Conservación a temperatura Conservación a 4 Conservación con aceite

cultivo ambiente °C mineral y a 4 °C
Rhizopus sp PDA
Aspergillus niger PDA
Penicillium sp PDA
Al tubo (eppendorff)
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
Al tubo con arena

2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Congelación Arena
ambiente Crecimiento + Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento +
Escherichia
coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus
niger
Penicillium sp
+ Solo indicar si hay abundante o no.
58
Después de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Congelación Arena
ambiente Crecimiento Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM)
% de RBMA= Microorganismos iniciales (No) – Microorganismos finales (Nf) X 100

Microorganismos iniciales
5.1 Según el microorganismo que conservaste ¿Cuál es el mejor método para consérvalo?
5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.
5.2 ¿Cual el papel del crioprotector?
5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica
5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio que
utilizaste
Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación
7. CONCLUSIONES
Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 10ª. Edición. Prentice-Hall.
España.
8.2 Prescott, H, Microbiología, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p.
8.3 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª
Edición. Interamericana. México. 140 p.
59
8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios
que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico
60
61
PRACTICA No. 6
DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES, MESOFÍLICOS AEROBIOS, MOHOS Y
LEVADURAS, EN SUPERFICIES VIVAS E INERTES.
UNIDAD III: Ecología de los microorganismos
1. OBJETIVOS:
El alumno determinara la presencia de microorganismos indicadores de la calidad sanitaria en una
superficie.
1.2.1 El alumno explicará que son los microorganismos indicadores y realizará la determinación de ellos.
1.2.2 Utilizará las normas oficiales mexicanas para el recuento de estos microorganismos y determinará
si la superficie esta bien higienizada.
2. INTRODUCCIÓN.
Evitar la contaminación por microorganismos en el lugar donde se preparan medicamentos en diferentes
presentaciones es una de las actividades más importantes para toda empresa farmacéutica, sobre todo
porque al prepararse este tipo de sustancias en el ambiente y suelo pueden existir residuos que hacen la
selección de resistentes a estos medicamentos. La eliminación adecuada de los microorganismos
constituye una fase importante en la higiene de las plantas.
Así ocurre con el agua, la tierra, la fauna, los manipuladores, o el equipo y envase que finalmente
habrán de contenerlos.
Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo mal higienizado, constituyen una fuente
importante de microorganismos patógenos o saprofitos.
Mucho dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar equipo
costoso puede perderse si la limpieza y desinfección en general, o específicamente en los puntos
críticos, no se realiza o evalúa su eficacia correctamente.
Las bacterias mesofílicas aerobias son las que crecen a 35 ± 2°C, de 24 a 48 ± 2 horas, en agar cuenta
estándar o en agar triptona extracto de levadura, este grupo esta formado por cocos o bacilos Gram
positivos y negativos, así como un amplio grupo de especies como: cromógenos, proteolíticos,
fermentativos, lipolíticos, psicrotróficos, patógenos, saprófitos, etcétera.
En muchos productos, este grupo de microorganismos arroja los máximos recuentos, aunque
dependiendo de la naturaleza de los ingredientes, así como de las condiciones higiénicas en las que se
prepararon y conservaron se puede predecir la vida de anaquel.
También llamadas bacterias indicadoras ya que se utilizan como indicadores de la calidad sanitaria, del
valor nutricional de alimentos perecederos, del agua potable, equipo y otros productos, así como
indicadores de la posible presencia de microorganismos patógenos.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables, la técnica comúnmente utilizada
es la cuenta por vaciado en placa (NOM-092-SSA1-1994 y NOM-089-SSA1-1994), donde la técnica no
pretende poner en evidencia a todos los microorganismos, pues tenemos una gran variedad de especies
y tipos diferentes por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno
62
disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra
realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.
El recuento de mohos y levaduras tiene importancia como recurso para apreciar algunos aspectos de la
higiene aplicada durante el procesamiento, para seguir la eficacia de su tratamiento germicida y en
determinadas circunstancias para los riesgos que pueden resultar en la formación de toxinas al
incrementar su número.
En general, simultáneamente con el recuento de mohos puede realizarse el de las levaduras, ya que el
medio de cultivo les proporciona también buenas condiciones para su desarrollo. Sin embargo, cuando
se presenta un desarrollo excesivo de mohos, difícilmente puede efectuarse el recuento de las colonias
de las levaduras.
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo
específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos, es decir seguimos el
procedimiento de la NOM-111-SSA1-1994.
Al contar las colonias de hongos en las placas hay que cuidar de individualizar cada una debido a la
confluencia ocasional en el desarrollo de colonias cuyo centro no existe o es difícilmente perceptible,
puede haber cierta dificultad en el recuento; ésta se elimina o disminuye cuando éste se realiza en las
primeras 72 horas de incubación.
Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios microorganismos. Existe
poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico.
La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos
recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es que
Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen
gas de la lactosa o lo hacen después de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta
técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes
localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos entre
otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser
recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha demostrado su
efectividad.
El número de organismos presentes en un alimento se establece mediante la cuenta de unidades
formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994). Método para la cuenta de microorganismos coliformes
totales en placa) o el uso de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica
de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con
base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.
Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos, que a 35 °C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones de la NOM-
112-SSA1-1994.
Las placas con medio deshidratado aún cuando no están normalizado en todos los productos elevan la
eficiencia de un laboratorio debido a que disminuyen grandemente el espacio, los medios de cultivo, el
tiempo de preparación, materiales y costos. Contrariamente a los métodos tradicionales están listas para
63
recibir la muestra y también se pueden utilizar en forma directa para muestras de tipo ambiental. Existen
diversas placas para el recuento de los microorganismos
Las placas están recubiertas con nutrientes gelatinosos e indicadores especiales que colorean la colonia
dándoles contraste para su fácil identificación; en forma general, la placa Petrifilm consta de:
3. MEDIOS DE CULTIVO, MATERIAL, REACTIVOS, EQUIPO Y MUESTRAS POR EQUIPO.

MEDIOS DE CULTIVO
Tres frascos con 100 ml de CLM o agua  Dos placas con medio deshidratado para
peptonada OMA
Un matraz con 100 ml de ABRV  Dos placas con medio deshidratado para
OC
Un matraz con 100 ml de ACS
 Dos placas con medio deshidratado para
Un matraz con 100 ml de PDA
Mohos y levaduras
 Cuatro placas con agar nutritivo
MATERIAL
 Doce cajas Petri  Cuatro bolsas de plástico transparente

 Cuatro pipetas de 2 ml y 4 de 10 ml  Dos esponjas estériles
REACTIVOS
 Un Frasco con alcohol  1 frasco con 50 ml de ácido tartárico al 10 %

estéril
EQUIPO
 Autoclave  Horno para esterilizar de 170 °C.

 Incubadora con termómetro  Potenciómetro
 Baño de agua a la temperatura de 45.  Balanza digital
SUPERFICIES A MUESTREAR
 Manos sucias  Mesa sucia

 Manos limpias  Mesa limpia
64
4.-DESARROLLO EXPERIMENTAL.
A.- Técnica normalizada de vaciado en placa
4.1 SUPERFICIES VIVAS: MANOS SUCIAS
a) Vaciar 100 ml de caldo Letheen o agua peptonada al 0.1 %. En una bolsa de plástico nueva.
b) Introducir y enjuagar sin frotar bruscamente las manos de la persona en la bolsa.
c) Regresar el diluyente al frasco de dilución, siendo esta dilución 10 -¹ después realizar la dilución 10-² en
un tubo que contiene 9 ml del diluyente utilizado.
d) Sembrar por duplicado la dilución 10-² para organismos mesofílicos aerobios y organismos coliformes
totales, para mohos y levaduras sembrar la dilución 10 -1.
e) Determinar los organismos coliformes, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².
f) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores,
depositando un ml de la dilución.
4.2 SUPERFICIES VIVAS: MANOS LIMPIAS
a) La misma persona ahora se lava las manos con jabón y agua de la llave, después se vuelve a
enjuagar las manos en la bolsa de plástico que contiene 100 ml del diluyente.
b) Regresar el diluyente al frasco, siendo esta la dilución 10 -¹.
c) Sembrar por duplicado la dilución 10 -¹ para organismos mesofílicos, coliformes totales y mohos y
levaduras.
d) Determinar los organismos coliformes, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².
e) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores,
4.3 SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES SUCIAS
a) Medir 25 x 25 cm² de la superficie de la mesa.

b) Limpiar con una esponja estéril humedecida con el diluyente.
c) Lavar la esponja dentro de la bolsa que contiene los 100 ml del diluyente y regresar al frasco, esta
dilución es 10-¹, si la superficie esta muy sucia realizar la dilución 10 -²
d) Sembrar por duplicado la dilución 10 -² para organismos mesofílicos y organismos coliformes totales,
para mohos y levaduras sembrar la dilución 10 -1.
e) Determinar coliformes, organismos mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².
f) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores,
depositando un de la dilución.
4.4 SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES LIMPIAS
a) Limpiar el área seleccionada con benzal o el higienizante que normalmente se utiliza, después limpiar
con una esponja estéril y lavarla dentro de la bolsa que contiene 100ml del diluyente.
65
b) Regresar el diluyente al frasco siendo esta la dilución 10 -1.

c) Sembrar por duplicado la dilución 10-1 para los organismos mesofílicos, coliformes totales y mohos y
levaduras.
d) Determinar los organismos coliformes totales, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/cm 2.
e) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los organismos indicadores,
4.5.- TÉCNICA DE EXTENSIÓN CON VARILLA
a) Practicar esta técnica de aislamiento y recuento con una de las diluciones para la determinación de
organismos mesofílicos aerobios.
b) En una placa que contenga agar cuenta estándar o agar Letheen modificado, colocar 0.5 ml de la
dilución correspondiente, realizar el sembrado por duplicado.
c) Colocar en una base de una caja de Petri un poco de alcohol (retirado de la flama del mechero) y
humedecer una varilla de vidrio acodada, flamearla en la flama del mechero, realizar esta operación una
vez más y dejar enfriar.
d) Extender con la varilla el inóculo en la superficie de la placa.
e) Incubar las placas a 35 °C por 24 – 48 h.
f) Contar las colonias que crecieron en la placa y realizar los cálculos necesarios para repórtale número
de UFC/ ml, siguiendo las sugerencias de la NOM 092-SSA…
4.6- PLACAS CON MEDIO DESHIDRATADO PARA ORGANISMOS COLIFORMES, MOHOS Y
LEVADURAS Y ORGANISMOS MESOFILICOS AEROBIOS
a) La preparación de la muestra se realiza tal y como se indica en la técnica y las diluciones son las que
elija el analista según el tipo de muestra.
b) Para la inoculación levantar la superficie superior con mucho cuidado y con la pipeta inocular 1 ml de
la dilución en el circulo delimitado.
c) Con mucho cuidado dejar caer la superficie superior evitando la formación de burbujas.
d) Con el difusor extender la muestra por toda la superficie delimitada presionando con cuidado.
e) Dejar que la muestra se difunda por un minuto e incubar a 35  2 ºC.
f) Leer las placas con el contador de colonias o en forma visual.
g) En el caso de muestras ambientales o de superficie, hidratar la placa con un mililitro de solución
salina fisiológica y dejar que se hidrate le medio por tres minutos.
h) Levantar la superficie superior con mucho cuidado y colocar los dedos de la persona a la cual se le
quiere determinar el con la pipeta inocular 1 ml de la dilución en el circulo delimitado.
PLACAS PARA RECUENTO AERÓBICO
Se presentan colonias rojas en la superficie de la placa, en ocasiones el número es mayor de 250 UFC,
en tal caso contar las colonias en 1 cm 2 y multiplicar por 20 para obtener el número total, esto es porque
el área total de una placa es de 20 cm 2.
66
PLACAS PARA RECUENTO DE COLIFORMES

El indicador rojo en la placa colorea las colonias, la película superior atrapa el gas producido por los
microorganismos coliformes.
PLACAS PARA RECUENTO DE Escherichia coli
Tiene el indicador β-glucoronidasa para la detección de coliformes.
Las colonias de E. coli producen la enzima glucoronidasa reaccionando con el indicador lo que da como
consecuencia un precipitado azul alrededor de la colonia, muchas colonias producen gas quedando
atrapado en la película. Las colonias que no son E. coli muestran un color rojo.
PLACAS PARA RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
MOHOS LEVADURAS
Colonias más largas Colonias pequeñas
Colonias difusas Colonias bien definidas
El color es variable por los pigmentos Colores tenues
En el caso de tener muchas colonias contar un cm 2 y multiplicar por 30.

El tiempo de incubación y la temperatura es similar a los métodos convencionales en placa.
INFORME DE LA PRUEBA
Reportar como: Unidades formadoras de colonias,_________ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en

placa en agar cuenta estándar, incubadas a _________ horas a _______ ° C.
67
Reportar como: Unidades formadoras de colonias,_________ UFC/g o ml, de organismos coliformes

totales en placa en agar de bilis rojo violeta, incubadas a _________ horas a _______ ° C.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 3-5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
5.1 Cuando realizo tres diluciones (10-2, 10-3 y 10-4 ) y no hay crecimiento ¿cómo se debe de reportar?
5.2 ¿Cuál es la importancia de determinar organismos coliformes, organismos mesofílicos y mohos y
levaduras en superficies vivas y en superficies inertes?
5.3 ¿Qué problemas causan el elevado número de estos indicadores sanitarios?
5.4 ¿Cómo se lleva a cabo la sanitización de equipos, instrumentos, que son requeridos para el
procesamiento de medicamentos a nivel industrial?
En la siguiente tabla anota los resultados obtenidos en el grupo.
Equipo Superficie No. de bacterias mesofílicas aerobias No. de bacterias coliformes

2 2
/cm totales / cm
1 Manos sucias
2 Manos limpias
3 Mesa sucia
4 Mesa limpia
Valor permitido por la NOM 093 Superficies vivas < 3 000 UFC/cm2 < 10 UFC/cm2
Valor permitido por la NOM 093 .-- Superficies
< 400 UFC/cm2 < 200 UFC/cm2
inertes.
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Analiza la presencia o ausencia de organismos mesofílicos aerobios y organismos coliformes totales en

las superficies el método de análisis y la norma utilizada. Busca el intervalo de organismos mesofilicos
aerobios y el de organismos coniformes totales de la misma superficie en otro país y compara los datos.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica.
8.- BIBLIOGRAFÍA
8.1 NOM-089-SSA1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano
en productos de belleza.
8.2 NOM-092- SSA1-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
8.3 NOM-093-SSA1-1994, Bienes y servicios. Practicas de higiene y sanidad en la preparación de
alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.
8.4 NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
68
8.5 NOM-113- SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes
totales en placa.
8.6 Fernández, E. Microbiología e inocuidad alimentaria, Ed. Universidad de Querétaro. 2000. México.
69
PRÁCTICA No. 7
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE PATÓGENOS EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Y
COSMÉTICOS.
UNIDAD IV: El alumno identificará los principales grupos bacterianos por medio de pruebas bioquímicas.
1. OBJETIVOS:
El alumno aislará e identificará patógenos específicos en productos farmacéuticos o cosméticos, de
acuerdo a sus características morfológicas y metabólicas.
1.2.1 El alumno realizará la técnica de estría cruzada para aislar en medios selectivos y/o diferenciales,
los microorganismos de interés.
1.2.2 El alumno determinará si un producto farmacéutico o cosmético es apto para el uso humano, de
acuerdo a sus especificaciones microbiológicas.
1.2.3 El alumno identificará las bacterias patógenas mediante características morfológicas y metabólicas.
2. INTRODUCCIÓN
Los fármacos o cosméticos, pueden contaminarse durante su producción a través de materias primas,
por operaciones no adecuadas durante la fabricación o el almacenamiento, por el material de empaque y
por el personal que manipula el producto, la contaminación microbiana provoca alteraciones del
producto que afectarían su calidad y podrían ocasionar grandes pérdidas económicas.
En los productos farmacéuticos y cosméticos a fin de que se mantengan preservados de una
contaminación se les adicionan conservadores (inhibidores) para asegurar su estabilidad y seguridad;
sin embargo, la principal prevención es trabajar bajo Buenas Prácticas de Fabricación y no utilizar
compuestos inhibidores para corregir errores durante la elaboración, ya que esto sería una actividad de
riesgo que podría ocasionar daño tanto al producto como a los usuarios.
Las Normas y la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos establecen límites para la presencia de
microorganismos en los fármacos y cosméticos, los cuales varía dependiendo del producto y su uso.
El aislamiento y la identificación de patógenos en productos farmacéuticos y cosméticos, consiste, en
recuperar los microorganismos patógenos que pueden estar o no presentes en una muestra, tomando
en cuenta los medios y condiciones de incubación apropiadas para su desarrollo y la presencia de
inhibidores en los productos, que impiden el desarrollo de los microorganismos. Por lo cual es importante
para su recuperación neutralizar el agente antimicrobiano previo a la evaluación. Existen diferentes tipos
de neutralizantes, un ejemplo es la combinación de lecitina con el polisorbato, éste actúa como
neutralizante inespecífico y en aquellos casos en los que el inhibidor es liposoluble.
Los principales patógenos que se buscan en los productos farmacéuticos son: Salmonella, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, bacterias Gram negativas bilis tolerantes,
clostridios y Candida albicans.
En cosméticos se buscan: Salmonella, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa.
70
No todos los patógenos se buscan en un producto, el patógeno a identificar dependerá del producto y su
uso.
Salmonella es una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa, en forma de bacilo, que no forma
endosporas, suele ser móvil, produce abundante ácido sulfhídrico, utilizan el citrato como fuente de
carbono y fermenta la glucosa produciendo ácido y gas, es un microorganismo patógeno perteneciente a
la familia Enterobacteriaceae, su hábitat normal es el tracto intestinal del hombre y de animales, todas
las salmonelas se consideran patógenas en algún grado, siendo causa de salmonelosis, fiebre entérica
o gastroenteritis en el hombre.
Escherichia coli es un microorganismo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, tiene forma de
bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, no esporulado, catalasa positivo, oxidasa negativo, reduce
nitratos a nitritos, puede ser móvil e inmóvil, capaz de fermentar glucosa con o sin producción de gas,
no utiliza el malonato ni el citrato como fuente de carbono; se encuentra presente en el intetino del
hombre y animales de sangre caliente como parte de la biota normal. Aunque la mayoría de las cepas
de E. coli no son patógenas algunas pueden producir infecciones en el intestino o fuera de él y éstas
cepas son capaces de producir varios factores de virulencia, tales como toxinas, factores de adherencia
y cápsulas. Basado en sus mecanismos patógenos, las cepas de E coli que causan enfermedades
pueden clasificarse en 6 categorías: EPEC( E. coli enteropatógena), EIEC (E. coli enteroinvasiva),
EAEC (E. coli enteroagregativa), ETEC (E. coli enterotoxigénica), EHEC (E. coli enterohemorrágica) y
DAEC (E. coli adherente difusa); en humanos, estos grupos están asociados con enfermedades como
diarrea, disentería, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico.
Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, en forma de coco, inmóvil, anaerobia facultativa,
crece con facilidad en diferentes medios de cultivo, desde el punto de vista metabólico fermentan
carbohidratos y producen pigmentos, pueden crecer en medios con alta concentración de sal, coagula el
plasma y produce una gran cantidad de productos extracelulares, como hemolisinas, hialuronidasa,
estafilocinasa, coagulasa, desoxirribonucleasa y fibrinolisina que contribuyen a la patogenicidad y
virulencia de la bacteria. Algunas cepas pueden producir toxinas, como la toxina exfoliativa F y
enterotoxinas.
La presencia de S. aureus se interpreta en forma general como indicador de contaminación a partir de:
piel, boca, fosas nasales y heridas de los manipuladores. Es conveniente señalar que el material y
equipos sucios, así como la materia prima de origen animal pueden ser la fuente de contaminación.
La elevada incidencia de las intoxicaciones estafilocócicas y la ubicuidad del microorganismo
comprometen a todo laboratorio de análisis microbiológico a contar con técnicas validadas para el
recuento y aislamiento de S. aureus coagulasa y termonucleasa positivos.
El género Pseudomonas, contiene bacilos rectos ligeramente curvados, no esporulados, Gram
negativos, de una longitud de 0,5 a 1,0 µm por 1,5 a 5.0 µm, que se desplazan mediante uno o varios
flagelos polares, son aerobias, llevan a cabo un metabolismo respiratorio, utilizando O 2 y a veces nitrato
como aceptor final de electrones; pueden producir pequeñas cantidades de ácido a partir de la glucosa
pero no producen gas y son oxidasa positiva, estas dos últimas pruebas ayudan a diferenciar a las
pseudomonas de las enterobacterias.
La especie patógena más importante es Pseudomonas aeruginosa
71
Los clostridios son bacilos Gram positivos, con capacidad de esporular, la mayoría móviles por flagelos
perítricos, algunas especies son sacarolíticas, otras proteolíticas y hay cepas que poseen las dos
propiedades. Fermentan azúcares, polialcoholes, aminoácidos, ácidos orgánicos, purinas y otros
compuestos orgánicos. La mayoría de las especies son anaerobias estrictas. Generalmente son catalasa
negativa. Se encuentran comúnmente en el agua, suelo y forman parte de la biota intestinal del hombre
y animales. Existen muchas especies que se identifican de acuerdo a su requerimiento de oxígeno,
posición de la espora, capacidad de fermentar azúcares, polialcoholes, aminoácidos, ácidos orgánicos y
de secretar enzimas proteolíticas y/o lipasas. Muchas especies de clostridios son capaces de producir
enfermedades como intoxicaciones alimentarias (Clostridium botulinum), gangrena gaseosa (Clostridium
perfringens), tétanos (Clostridium tetani). Todos estos sintetizan toxinas muy potentes.
Candida albicans es una levadura unicelular comensal del tracto gastrointestinal y genitourinario del
hombre y de otros animales de sangre caliente, causa infecciones oportunistas en personas que
presentan una enfermedad que compromete su sistema inmunológico o que llevan tratamientos con
fármacos inmunosupresores. Las infecciones pueden ser agudas, crónicas, superficiales o profundas y
afectan mucosa vaginal, oral y pulmonar. Su aislamiento e identificación se basa en la observación de la
morfología colonial, microscópica, su capacidad de fermentar o asimilar azúcares, formación de tubo
germinativo, producción de clamidoconidios, pseudohifas y resistencia a cicloheximida.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

3.1. EQUIPO
 Estufa a 28° y 35° ± 2ºC  Microscopio

 Balanzas analítica y granataria  Lámpara de luz UV
 Potenciómetro  Baño María
 Autoclave  Horno para esterilizar
3.2 MATERIAL
 Mechero Fisher  Termómetros graduación de -10 a 200ºC

 Cajas de Petri estériles  Cilindro de acero inoxidable para
cajas Petri
 Portaobjetos
 Campanas de fermentación
 Pipetas de 10 ml, 5 y 1 ml
 Jarra anaeróbica
 Tubos de 13 X 100 mm
 Sistema Gas Pak
 Frasco de dilución de 125 ml con tapón de
rosca
 Caldo Letthen modificado  Agar yema de huevo

 Caldo de Soya Tripticaseína  Caldo base tioglicolato
 Agar eosina azul de metileno (EMB)  Agar DNA- azul de toluidina
72
 Caldo Mac Conkey  Caldo infusión de cerebro corazón (BHI)

 Agar Mac Conkey  TSI
 Agar rojo violeta bilis  LIA
 Caldo Mossel  Medio base de caldo rojo de fenol
azúcares
 Caldo tetrationato
 MR-VP
 Caldo Rappaport Vassiliadis
 MIO
 Agar verde brillante
 SIM
 Agar sulfito de bismuto
 Metabolismo oxidativo-fermentativo de
 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
azúcares
 Agar sal y manitol
 Citrato de Simmons
 Agar Vogel Johnson
 Caldo malonato
 Agar cetrimida
 Caldo urea
 Agar Pseudomonas F
 Caldo indol
 Agar Pseudomonas P
 Medio tiogel
 Agar Columbia
 Caldo esculina
 Medio de enriquecimiento para
 Leche fierro
clostridios
 Licuefacción de la gelatina
 Agar de soya tripticaseína
 Plasma de conejo o cobayo
 Agar Dextrosa Sabouraud
3.4 REACTIVOS
 Colorantes para la tinción de Gram  Reactivo ácido sulfanílico

 Solución de etanol 70% y HCl al  Reactivo de -naftilamina
1% v/v
 Aceite mineral estéril
 Solución de polisorbato 80%
 Solución de yodo-yoduro
 Solución de agua oxigenada al 3%
v/v
 NNNN-tetrametil-p-fenilendiamina
 Reactivo de Kovac´s o Ehrlich
 Reactivo Rojo de metilo
 Solución de KOH al 40%
 Reactivo -naftol

Productos de belleza: Gel para el pelo, desodorante, crema para la piel, champú, loción para afeitarse,
agua de tocador, maquillaje, labiales, talco o esmalte.
73
Productos farmacéuticos: jarabes, pomadas, cremas, polvos, tabletas, cápsulas, emulsiones, etc.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL PARA PRODUCTOS FARMACÉUTICOS:
4.1 MANEJO DE LAS MUESTRAS:
a) Tomar la muestra y transportarla al laboratorio, desinfectar la superficie del contenedor con un
algodón estéril impregnado de solución de etanol al 70% (v/v) y HCl 1% (v/v) (alcohol ácido). Antes de
abrir y tomar la muestra; secar la superficie con gasa estéril.
b) Homogenizar el producto; para líquidos, agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos,
mezclar el contenido con una espátula estéril; para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y
tomar una muestra representativa; y para aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente,
expeler apropiadamente la cantidad de producto previa agitación.
c) Productos solubles en agua: Diluir el producto de prueba (usualmente una proporción de 1 en 10)
en caldo de soya tripticaseína. Si es necesario ajustar el pH de 6 a 8.
d) Para productos insolubles en agua: Suspender el producto en una proporción de 1 a 10, en caldo
soya tripticaseína. Para este tipo de productos puede adicionarse un agente tensoactivo como el
polisorbato 80 en una concentración de 1g/L. Si en necesario ajustar el pH de 6 a 8.
e) Para líqudos viscosos: Para muestras viscosas que no puedan medirse con pipeta en la dilución
1:10, efectuar diluciones 1:50 ó 1:100 .
f) Productos grasos: Disolver el producto en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclar
con la cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro agente tensoactivo no inhibitorio estéril,
calentar si es necesario a no más de 40°C, en casos excepcionales a no más de 45°C. Mezclar
cuidadosamente, mantener la muestra en baño el tiempo necesario para formar una emulsión, añadir la
cantidad necesaria del diluyente seleccionado precalentado para obtener una dilución 1 en 10 del
producto, mezclar cuidadosamente.
g) Líquidos o sólidos en aerosol: Transferir asépticamente el producto de prueba dentro de una
unidad de filtración con membrana o a un contenedor estéril. Usar el contenido total o un número
definido de dosis de cada contenedor.
h) Parches transdérmicos: Sobre una superficie estéril, remover la cubierta protectora de los parches y
colocarlos, con el adhesivo hacia arriba. Cubrir el adhesivo con gasa estéril, para evitar que los parches
se adhieran, y transferidos a un volumen adecuado del diluyente seleccionado conteniendo
inactivadores como el polisorbato 80 y/ (o) lecitina. Agitar la preparación vigorosamente al menos
durante 30 minutos..
4.2 Para Escherichia coli
a) Preparación de la muestra: preparar una dilución 1:10 del producto de prueba (no menos de 1g ó
1mL), en 10mL o la cantidad de caldo soya tripticaseína determinado, mezclar e incubar de 30 a 35°C
durante 18 a 24h.
b) Selección y subcultivo: agitar la mezcla, transferir 1mL del cultivo anterior a 100mL de caldo
MacConkey e incubar de 42 a 44°C durante 24-48h. Resembrar en una placa de agar Mac Conkey e
incubar de 30 a 35°C durante 18 a 72h.
c) El crecimiento de colonias bien desarrolladas fermentadoras de la lactosa indica la posible presencia
de Escherichia coli. (ver Tabla No. 2)
d) Sembrar una colonia sospechosa en agar de soya tripticaseína, incubar a 30-35°C 24h.
74
e)Realizar pruebas bioquímicas de identificación . El producto cumple la prueba, si no hay crecimiento

en el medio o si las pruebas bioquímicas de identificación son negativas (ver anexo Tabla No. 6).
4.3 Para identificación de bacterias Gram negativas bilis tolerantes

a) Preparación de la muestra: preparar una dilución 1:10 del producto de prueba (no menos de 1g o
1mL), en caldo soya tripticaseína determinado, mezclar e incubar de 20 a 25°C por un periodo de 2 a 5 h
para permitir la recuperación de las bacterias lesionadas debido al proceso de fabricación o el
conservador del producto.
b) Prueba cualitativa: usar un volumen correspondiente a 1g ó 1mL del producto para inocular en caldo
Mossel de enriquecimiento de enterobacterias, incubar de 30 a 35°C durante 24-48h. Resembrar en una
placa de agar rojo violeta bilis. Incubar de 30 a 35°C durante 18 a 24h.
c) El producto cumple la prueba de ausencia si no se observa crecimiento. (ver Tabla No 2)
d) Prueba cuantitativa: inocular el volumen de caldo Mossel de enriquecimiento de enterobacterias, con
diluciones 0.1, 0.01 y 0.001 g ó mL del producto de prueba. Incubar de 30 a 35°C durante 24-48h.
Resembrar cada tubo en una placa de agar rojo violeta bilis. Incubar de 30 a 35°C durante 18 a 24h.
La presencia de crecimiento constituye un resultado positivo, que se interpreta en la Tabla No. 1. del
Número Más Probable (NMP) para enterobacterias.
Tabla No. 1
Resultados de cada cantidad de producto Número Más Probable (de
0.1g ó 0.01g ó 0.001g ó bacterias por gramo o mL
0.1mL 0.01mL 0.001mL de producto
(NMP/ g ó mL)
+ + + >103
+ + - <10 y > 102
3
+ - - <102 y > 10
- - - <10
4.4 Para Salmonella spp.

a) Preparación de la muestra: utilizar no menos de 10g ó 10mL de muestra para inocular la cantidad de
caldo soya tripticaseína, mezclar e incubar de 30 a 35°C durante 18 a 24h.
b) Selección y subcultivo: transferir 0.1mL del cultivo anterior, a 10mL de caldo Rappaport Vassiliadis
de enriquecimiento para Salmonella, mezclar e incubar de 30 a 35°C durante 18 a 24h.
c) Transferir una asada en placas de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) e incubar de 30 a 35°C
durante 18 a 48h. El crecimiento de colonias bien desarrolladas rojas, con o sin centro negro indica la
posible presencia de Salmonella spp. (ver Tabla No. 2)
d) Sembrar una colonia sospechosa en agar de soya tripticaseína, incubar a 30-35°C 24h.
e) Realizar pruebas bioquímicas de identificación . El producto cumple la prueba, si no hay crecimiento
en el medio o si las pruebas bioquímicas de identificación son negativas (ver Anexo Tabla No. 4 y 5).
4.5 Para Pseudomonas aeruginosa

a) Preparación de la muestra: preparar una dilución 1:10 del producto de prueba (no menos de 1g ó
durante 18 a 24h.
75
b) Selección y subcultivo: resembrar en una placa de agar cetrimida e incubar de 30 a 35°C durante
18 a 72h. El crecimiento de colonias características de color verde indica la posible presencia de P.
aeruginosa. (ver Tabla No. 2)
c) Sembrar una colonia sospechosa en agar de soya tripticaseína, incubar a 30-35°C 24h.
d) Realizar pruebas bioquímicas de identificación . El producto cumple la prueba, si no hay crecimiento
en el medio o si las pruebas bioquímicas de identificación son negativas (ver Anexo Tabla No. 2 y 3).
4.6 Para Staphylococcus aureus

a) Preparación de la muestra: preparar una dilución 1:10 del producto de prueba (no menos de 1g o
durante 18 a 24h.
b) Selección y subcultivo: resembrar en una placa de agar sal y manitol e incubar de 30 a 35°C
durante 18 a 72h. El crecimiento de colonias amarillas/blancas rodeadas por una zona amarilla indica la
posible presencia de S. aureus. (ver Tabla No. 2)
c) Sembrar una colonia sospechosa en agar de soya tripticaseína, incubar a 30-35°C 24h.
en el medio o si las pruebas bioquímicas de identificación son negativas (ver Anexo Tabla No. 1).
4.7 Para clostridios

a) Preparación de la muestra y tratamiento térmico: preparar una muestra utilizando una dilución 1:10
de al menos 1g ó 1mL del producto a examinar. Dividir la muestra en dos porciones de al menos 10mL.
Calentar una porción a 80°C durante 10 minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción.
b) Selección y subcultivo: mezclar y transferir 10mL de cada una de las porciones a dos envases que
contengan 100mL del medio de enriquecimiento para clostridios. Incubar en condiciones anaerobias de
30 a 35°C durante 48h.
c) Después de la incubación, transferir una asada de cada envase en agar Columbia e incubar en
condiciones anaerobias de 30 a 35°C durante 48 a 72h.
El crecimiento anaerobio de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reacción negativa a la catalasa
indica la presencia de clostridios (ver Tabla No. 2).
d) Propagar una colonia aislada en un tubo que contenga caldo tioglicolato enriquecido, sin glucosa e
indicador con sello de aceite en la parte superior e incubar a 37°C por 24h.
e) Confirmar mediante pruebas bioquímicas de identificación. (ver Anexo Tabla No. 7)
El producto cumple los requisitos de la prueba si no se observan colonias del tipo descrito o si son
negativos los ensayos de identificación.
4.8 Para Candida albicans

a) Preparación de la muestra: usar 10mL o la cantidad correspondiente a no menos de 1g ó 1mL para
sembrar en 100mL o la cantidad de caldo dextrosa Sabouraud y mezclar. Incubar de 30 a 35°C durante
3 a 5 días.
b) Selección y subcultivo: resembrar en una placa de agar dextrosa Sabouraud e incubar de 30 a
35°C durante 28 a 48h. El crecimiento de colonias blancas sugiere la posible presencia de Candida
albicans. (ver Tabla No 2)
c) Sembrar una colonia sospechosa en agar dextrosa Sabouraud, incubar a 30-35°C 24-48h.
en el medio o si las pruebas bioquímicas de identificación son negativas.
76
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL PARA PRODUCTOS DE BELLEZA:

5.1 Preparación de las muestras
a) Tomar la muestra y transportarla al laboratorio, desinfectar la superficie del contenedor con un
algodón estéril impregnado de solución de etanol al 70% (v/v) y HCl 1% (v/v) (alcohol ácido). Antes de
abrir y tomar la muestra; secar la superficie con gasa estéril.
b) Homogenizar el producto; para líquidos, agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos,
mezclar el contenido con una espátula estéril; para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y
tomar una muestra representativa; y para aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente,
expeler apropiadamente la cantidad de producto previa agitación.
c) Para las muestras que sean miscibles en Caldo Letthen Modicado (CLM) adicionar 10 g ó 10 mL a un
frasco que contenga 90 mL de CLM.
d) Para las muestras que no sean miscibles en CLM (ejemplo, cremas, labiales, etc.), en un frasco o
bolsa estéril debidamente etiquetado(a), adicionar 10 g ó 10 mL de la muestra y agregar 5 mL de
polisorbato 80. Poner en baño maría a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo de
exposición en el baño no debe exceder de 15 minutos) y posteriormente agregar 85 ml de Caldo Letthen
Modificado.
e) Incubar las muestras a 30 ± 2 °C durante 7 días.
5.2 Procedimiento
f) A partir del frasco inoculado sembrar por estria cruzada en los siguientes medios de cultivo
diferenciales: agar cetrimida, EMB (eosina azul de metileno), Agar Mac Conkey (AMC) y Agar Vogel
Johnson (AVJ).
g) Incubar de 35 a 37ºC durante 24 horas los medios de EMB y AMC, y 48 horas el agar cetrimida y
AVJ.
h) Observar las cajas inoculadas para búsqueda de E. coli, Salmonella, S. aureus y Pseudomonas
aeruginosa. en los medios respectivos (ver Tabla No. 2)
5.3Interpretación de resultados
i) Describir la morfología colonial característica de los organismos de interés y la morfología
microscópica, para ésta última, realizar una tinción de Gram a las colonias sospechosas de E. coli,
Salmonella, S. aureus y Pseudomonas aeruginosa. en los medios respectivos (ver Tabla 2).
j) De una colonia sospechosa y pura, transferirla a un tubo con agar soya tripticaseína e incubarla a
35°C 24-48h, esta cepa será utilizada para la identificación mediante pruebas bioquímicas.
k) En caso de que se tengan colonias sospechosas de Salmonella, sembrarlas en medio de
enriquecimiento selectivo caldo tetrationato e incubar 12-24h a 43°C.
NOTA: cada alumno tendra una cepa para que la identifique en la siguiente práctica:
“Pruebas para identificar bacterias”Los fundamentos de las pruebas se encuentran en el
Anexo Tabla No. 8
77
Tabla No. 2 Características coloniales de los microorganismos patógenos en los diferentes medios de
cultivo
Medio de cultivo Microorganismo Carácteristicas coloniales
Colonias pequeñas azul negro en la parte central con brillo metálico
E. coli
Agar eosina azul de verdoso a la luz reflejada
metileno Salmonella sp. Transparentes, color ámbar
Staphylococcus coagulasa (+) Colonias incoloras, en punta de alfiler
Salmonella sp., Shigella sp. y otros Incoloros, transparentes
Grandes, rojas, que pueden estar rodeadas de una zona de
E. coli
Agar MacConkey precipitación de bilis
Enterobacter sp, Klebsiella sp Grandes, rosadas, mucosas
Enterococos, Staphylococcus Diminutas, de crecimiento aislados, opacas
Salmonella Colonias rojas que pueden o no presentar un centro negro
Agar Xilosa Lisina
Shigella Colonias rojas
Desoxicolato (XLD)
Escherichia coli Inhibición de parcial a completa, colonias amarillas a rojo amarillentas
Agar rojo violeta bilis Bacterias Gram negativas bilis
Colonias rojo púrpuras rodeadas de un halo de precipitación rojizo
tolerantes
Pseudomonas sp. Colonias grandes blancas o verdes cremosas
Agar cetrimida E. coli Crece poco, sin pigmento
Staphylococcus aureus No crece
Staphylococcus aureus Colonias pequeñas, negras, con halo amarillo
Staphylococcus epidermidis y otros Pequeñas, negro-grisáceas, sin halo
Agar Vogel Johnson
Escherichia coli No crece
Pseudomonas aeruginosa No crece
Staphylococcus aureus Colonias amarillas de tamaño mediano con zonas amarillas
Agar Sal y Manitol Staphylococcus epidermidis Colonias blancas de tamaño pequeño a mediano
Escherichia coli No crece
Agar Columbia
Clostridios Colonias convexas, semiopacas
Agar Dextrosa Colonias húmedas, suaves, cremosas de color blanco o ligeramente
Candida albicans
Sabouraud amarillentas
Realizar un cuadro en el cual se indiquen la morfología microscópica y colonial de los patógenos que
aislaron a partir de la muestra.
6.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de unos microorganismos patógenos.
6.2. Explicar ¿qué daño producen los patógenos al producto y a los consumidores del producto?
7.1. Discutir las características morfológicas y metabólicas específicas de los patógenos de interés y la
importancia del aislamiento e identificación de estos organismos en productos farmacéuticos y
cosméticos.
8. CONCLUSIONES
8.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos y a
los objetivos de la práctica.
8.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las características morfológicas y
metabólicas en los medios de cultivo trabajados.
78

8.1 Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición. Médica
Panamericana. 2003, 850. p.
8.2 NOM 089-SSSA-1995, Bienes y servicios. Método para la determinación del contenido microbiano en
productos de belleza.
8.3 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, Décimo primera edición
ANEXO
LA SIGUIENTE INFORMACIÓN TE SERVIRA PARA LA IDENTIFICACIÓN MEDIANTE PRUEBAS
BIOQUÍMICAS DEL MICROORGANISMO AISLADO.
1. Identificación de Staphylococcus aureus
En caso de encontrar cocos en racimo Gram positivos en agar sal manitol y/o en agar Vogel Johnson, transferir la
colonia a un tubo que contenga AST, incubar 24-48h y continuar con las siguientes pruebas para identificación de
S. aureus.
A partir del tubo de AST realizar:

a)Prueba de catalasa: en un portaobjetos adicionar una gota de solución de agua oxigenada al 3% y dispersar
una porción de la colonia sospechosa. La reacción es positiva si se observan burbujas efervescentes del
oxígeno desprendido, utilizar controles positivos y negativos.
b)Resembrar en caldo MR-VP, caldo rojo de fenol manitol, caldo nitratos y medio de oxidación-fermentación
con dextrosa, incubar a 33-37ºC durante 18-24 horas, y observar si hay desarrollo microbiano.
c)Inocular dos tubos con caldo infusión cerebro corazón (BHI), uno destinado para la técnica de coagulasa y
otro para la técnica de termonucleasa, incubar a 33-37ºC de 18-24 horas.
Prueba de coagulasa
a)Adicionar a un tubo 0,5 mL de caldo infusión de cerebro corazón (BHI) + 0.5 mL de plasma de conejo.
Incubar a 35ºC en baño de agua y observar la formación del coágulo en intervalos de una hora hasta
cumplir 6 horas.Si no hay formación de éste observar a las 24h. Considerar la prueba positiva si hay
formación de coágulo.
b)Si al transcurrir el tiempo no se observa coágulo, la prueba se considera negativa.
Prueba de termonucleasa
a)Con el otro tubo de BHI realizar la prueba de termonucleasa, inactivar el cultivo en baño maría a ebullición
durante 15 minutos.
b) En un portaobjetos con 3 ó 4 mL de agar azul de toluidina-DNA, se efectúan orificios de 2mm de diámetro.
Colocar una gota del cultivo en cada uno de los pozos e incubar durante 24h de 35-37°C.
c)Transcurrido el tiempo de incubación, observar, es positiva la prueba cuando se presenta un halo rosa
alrededor de los orificios, que indican la hidrólisis del DNA.
d)Reportar de acuerdo a la Tabla No. 1
79
Tabla No. 1. Características diferenciales de Staphylococcus aureus

Determinación S.aureus S.epidermidis Micrococcus sp.
Prueba de catalasa + - -
Fermentación de manitol + - -
Crecimiento en O/F Fermentativo
Prueba de coagulasa + - -
Termonucleasa +
Voges Proskauer + -
Oxidasa - -
Reducción de nitratos + d
d= variable
2. Identificación de bacterias Gram negativas
2.1 Pruebas para identificación de Pseudomonas sp.
Procedimiento: En caso de que en el medio agar cetrimida se encuentren colonias sospechosas de Pseudomonas
sp. y al microscopio se observen bacilos Gram negativos, transferir la colonia a un tubo que contenga AST, incubar
24-48h y continuar con las siguientes pruebas para identificación Tabla No. 2.

a).Prueba de oxidasa: Impregnar una tira de papel filtro con NNNN-tetrametil p-fenilendiamina, y sobre ella
colocar una porción del cultivo. La prueba es positiva si se produce un color púrpura intenso.
b) Resembrar en agar Pseudomonas F y Pseudomonas P, incubar 48h a 37°C.
c)Observar con luz ultravioleta las colonias desarrolladas y comparar la morfología colonial conforme a la Tabla
No. 2.
d)La presencia de Pseudomonas sp. puede confirmarse, si es necesario; inoculando las pruebas bioquímicas
especificadas en la Tabla No. 2 y comparar.
Tabla No. 2 Características de Pseudomonas sp.
Medio de cultivo Morfología colonial Tinción de Prueba de
Gram oxidasa
Agar cetrimida a 37°C ó 42°C Colonias grandes blancas o verdes cremosas Bacilos - +
Agar Pseudomonas F para Colonias incoloras o. amarillentas, con luz
Bacilos - +
obtención de fluoresceína ultravioleta se observan de color amarillento.
Agar Pseudomonas para Colonias verde azulosas. Con luz ultravioleta
Bacilos - +
detección de piocianina se observan de color azul
Tabla No. 3 Pseudomonas sp.

Prueba bioquímica Resultado Prueba bioquímica Resultado += Positivo
H2S (formación) - Citrato + -= Negativo
Movilidad + Manitol d d= Variable
Indol - Glucosa (gas) d
Urea d Sorbitol -
Lisina - Inositol -
descarboixilasa
Lactosa - OF/f -
VP d OF/O +
80
2.2 Pruebas para identificación de Salmonella sp.

En caso de que en los medios de agar eosina azul de metileno o Agar MacConkey se encuentren colonias
sospechosas de Salmonella sp, sembrarlas en caldo tetrationato, incubar durante 12-24 horas a 43ºC.
2.2. 1. Pruebas selectivas para Salmonella sp.
a) A partir del medio de enriquecimiento selectivo, tomar una asada y realizar estría cruzada en los siguientes
medios: agar verde brillante, agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) y agar sulfito de bismuto.
b) Incubar 24h a 35°C y observar morfología colonial microscópica (Ver Tabla No. 4).
c) Si son bacilos Gram negativos, correspondiendo a la morfología de Salmonella sp., sembrar por estría y punción
en el medio agar triple azúcar-hierro (TSI) y agar de hierro lisina (LIA) e incubar de 18 a 24 horas a 35ºC.
Observar las morfologías coloniales y microscópicas y compararlas con las descritas en la Tabla No.4.
Tabla No. 4 Características morfológicas de Salmonella sp.
Medio de cultivo Características morfológicas Tinción de Gram
Colonias pequeñas transparentes, incoloras, rosas o
Agar verde brillante blancas opacas, frecuentemente rodeadas de una Bacilos -
zona rosa o roja
Agar xilosa-lisina desoxicolato Colonias rojas con o sin centro negro. Bacilos -
Agar sulfito de bismuto Colonias negras o verdes Bacilos -
Superficie alcalina (roja) punción ácida (amarilla),
Agar hierro triple azúcar (TSI) Bacilos -
con o sin producción de ácido sulfhídrico (negro)
Superficie alcalina (morada) punción alcalina
Ahar de hierro lisina (LIA) Bacilos -
(morada) sin producción de gas
2.2.2 .Para confirmación de Salmonella realizar las pruebas bioquímicas que se mencionan en la Tabla
No. 5.
Tabla No. 5 Salmonella typhi
Pruebas bioquimicas Resultado Prueba bioquimica Resultado K= Alcalino
TSI Superficie K VP - A= Acido
punción A Citrato - += Positivo
Gas - Manitol + -= Negativo
H2S + Glucosa (gas) - d= Variable
LIA Superficie K Sorbitol +
Punción K Ornitina descarboxilasa -
Gas - Dulcitol d
H2S + (-) Inositol -
MIO Movilidad + (-) Triolosa +
Indol - Arabinosa -
Ornitina - Ramnosa -
Urea - Celobiosa d
Lisina descarboxilasa + Eritritol -
Malonato - Acetato de sodio -
Lactosa - mucato -
81
2.3 Pruebas selectivas para Escherichia coli.

2.3.1 Procedimiento
En caso de que en el medio agar Mac Conkey o EMB se encuentren colonias sospechosas de Escherichia coli y al
microscopio se observen bacilos Gram negativos, transferir la colonia a un tubo que contenga AST, incubar 24-48h
y continuar con las pruebas para identificación Tabla No. 6.

a) Prueba de oxidasa: Impregnar una tira de papel filtro con NNNN-tetrametil p-fenilendiamina, y sobre ella colocar
una porción del cultivo. La prueba es positiva si se produce un color púrpura intenso.
b) Prueba de catalasa: en un portaobjetos adicionar una gota de solución de agua oxigenada al 3% y dispersar una
porción de la colonia sospechosa. La reacción es positiva si se observan burbujas efervescentes del oxígeno
desprendido, utilizar controles positivos y negativos.
c) Confirmar la presencia utilizando las pruebas bioquímicas mencionadas en la Tabla No.6
Tabla No. 6 Escherichia coli
K=Alcalino Pruebas bioquimicas Resultado Prueba bioquimica Resultado
A= Acido TSI Superficie A VP -
+= Positivo Punción A Citrato -
-= Negativo Gas + Manitol +
H2S - Glucosa (gas) A
d= Variable
LIA Superficie K Sorbitol +
Punción A Ornitina d
descarboxilasa
Gas + Dulcitol d
H2S - Inositol -
MIO Movilidad +(-) Triolosa +
Indol + Arabinosa +
Urea - Ramnosa d
Lisina descarboxilasa + Eritritol -
Malonato - OF/F y OF/O +
Lactosa + mucato +
3. Pruebas de identificación para clostridios.

A partitr del tubo de caldo tioglicolato enriquecido, realizar la pruebas bioquímicas que se especifican en la Tabla
No. 7.
Tabla No. 7. Características diferenciales de los clostridios
Prueba bioquímica C.perfringens C.sporogenes C. botulinum C. tetani

Requerimiento de oxígeno AN, MA AN AN AN
Posición de la espora O, ST O,S O, S R, T
Movilidad - + + +
Indol - - - +
Hidrólisis de la Esculina V + - -
Lecitinasa + - - -
Lipasa - + + -
Hidrólisis de la gelatina + + + +
Peptonización de la leche + + + +/-
Fermentación de glucosa + - + -
82
Fermentación de lactosa + - - -
Fermentación de manitol - - - -
Fermentación de ramnosa - - + -
Fermentación de sacarosa + - - -
Salicina + - - -
Ureasa - - - -
AN=anaerobio obligado, MA=anaerobio microaerotolerante, O= espora oval, R= espora redonda,
ST= espora subterminal, T=espora terminal, V= variable
83
Tabla No. 8. Fundamentos de las pruebas bioquímicas de identificación
84
PRACTICA No. 8.
PRUEBAS PARA IDENTIFICAR BACTERIAS (PARTE I).
UNIDAD IV: Identificación bacteriana

1. OBJETIVOS:
El alumno identificará bacterias de interés farmacéutico, a través de su metabolismo microbiano.
1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y
sales orgánicas como principales fuentes de carbono.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad
enzimática.
1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-
reducción.
2. INTRODUCCIÓN
El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de
compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar
reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a
este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según su
origen:
a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).
b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).
c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).
d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
Las identificaciones bacterianas preliminares pueden efectuarse observando las características de las
colonias y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano
desconocido en género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos
exclusivos de cada especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una
serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan
los cambios de pH o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los
microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y
observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo
en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de
crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y
saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además, en la morfología microscópica permite conocer la forma
y agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)
85
Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológico. Las pruebas de
identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y
económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, aunque la
formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un
momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.
Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microrganismo (género y especie) son:
Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema
VITEK, Identificación por PCR, etc
En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera
tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el
fundamento.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
 Fermentación de carbohidratos (glc lac,  Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, la gelatina), en el medio gelatina
sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base
 Crecimiento en caldo nutritivo
CRF.
 Utilización de la esculina, medio de bilis
 Fermentación de la glucosa, producción
y esculina
de ácido sulfhídrico, producción de gas,
en el medio TSI  Utilización del gluconato (oxidación),
medio caldo gluconato peptona
 Descarboxilación de la lisina, en el
medio LIA  Requerimientos de oxígeno, condiciones
aerobias y anaerobias
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina
y la producción de indo, en el medio MIO  Producción de Catalasa y oxidasa
 Movilidad, producción H2S, producción de  Reducción de nitratos, en caldo nitrato.
indol, en el medio SIM  Detección del metabolismo oxidativo
 Prueba cuantitativa para la producción /Fermentativo, en el medio OF con
de ácidos. Prueba de Rojo de metilo, sacarosa
medio RM/VP  Utilización del citrato, en citrato de Sodio
 Producción de ureasa, en caldo urea  Utilización de Malonato, en malonato
 Producción de acetil metil carbinol.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac,  Crecimiento en bilis al 40 %

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
 Coagulasa
raf, ram, xilosa, etc.)
 Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la
Fermentación de la glucosa, producción de
gelatina), en el medio gelatina
ácido sulfhídrico, producción de gas, medio
86
de TSI  Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina

Descarboxilación de la lisina, medio de LIA  Producción de acetil metil carbinol, prueba
Voges – Proskauer, medio VP/RM
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la
producción de indol, medio de MIO  Producción de la fosfatasa, medio PDP
Movilidad, producción de indol y producción  Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN

de ácido sulfhídrico, medio SIM  Crecimiento a 10 y 45 ª C
Producción Catalasa y oxidasa  Reducción con azul de metileno en leche
Reducción de nitratos  Hidrólisis en caldo hipurato de sodio
Producción de hemólisis, en agar sangre  Formación de cápsula
Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %  Hidrólisis de almidón,
Sensibilidad a optoquina y bacitracina
Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin
pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos
realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.
FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN
Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de
almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.
2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene
rojo de fenol.
3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)
Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar
hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de
la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro
férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de
los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.
La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de
glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2
cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su
superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamada “fondo” está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de
flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin
de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el
pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego
87
se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de fenol y un
pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.
4. PRUEBA DE ROJO DE METILO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es
cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácido láctico,
acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos
microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos
que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema
estabilizador de pH del medio.
Controles
Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Klebsiella sp. Escherichia coli
5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en
diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O 2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol
actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo.
Controles

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp.
UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS
6. PRUEBA DE CITRATO
Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de
ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende
una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los
productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce
más acetato y formato con una disminución del lactato y CO 2. Por encima del pH de 7 no hay producción
de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético.
Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del
citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,
un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales
de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de
citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono
como fuente de carbono.
Controles

Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes
88
7. PRUEBA DE MALONATO
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido
fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso de
inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos de
manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona
un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.
Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la
oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto
ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma
otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como
el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto, la célula bacteriana, recurre al ciclo
del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Controles

Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis
8. PRUEBA DE UREASA
La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de
amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la
urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco
reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un
aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.
Controles
Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:
9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son
detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son
demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a
componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por ciertas
bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El
catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y
posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.
89
Controles

Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H 2S E INDOL).
El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del
tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).
La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además, la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina
putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar
si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para
determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido
triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en
conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.
Control
Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp
Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp
12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)
En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.
La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
90
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además, la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina
cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se
deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3
cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de
bromocresol.
Controles:
Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada
para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos
biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.
Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar
nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo  -
naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo -  -
naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los
reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es
necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn
reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la
presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus
14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO
DE HUGH Y LEIFSON
Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos
de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de
fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa es
91
sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,
como el medio OF.
Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:
a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.
b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.
c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.
La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden
neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La
concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción
de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se
difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es
también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden
no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas
pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación
final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se
inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm
desde el fondo del tubo, cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el
otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o
más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Interpretación.
Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto
Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde
Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo
No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde
Controles
Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp
15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga KCN.
La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de
la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación
– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo
trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final
de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie
bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo oxidasa a nivel
92
del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con el O 2 y actúa como aceptor final de electrones,
bloqueando la respiración.
Controles

KCN Klebsiella Escherichia coli
16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena
respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema
citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la
prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser
enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de
Pseudomonas o Neisseria (positivas).
**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de
electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en
presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:
1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias
aisladas que se han desarrollado en la placa.
2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se
recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la
superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.
Controles:

Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA
Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias
y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en
peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura
similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de
hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno en agua.
Controles
93

Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp
18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.
Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.
aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida
por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una
proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.
19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran
variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración
final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio
está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El
tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está
asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la  hemólisis se asocia con una
hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.
20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %
Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentraciones de sales y se les
denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en
condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal
hace que la célula se deshidrate debido al ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a
diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.
3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 ° C Autoclave
Microscopio Horno
3.2. MATERIAL
 Portaobjetos  Asas bacteriológicas

 Pipetas Pasteur  Colorantes para tinción de esporas
 Gradilla metálica  Colorantes para tinción de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
Pruebas de cada uno para Gram positivos Pruebas de cada uno para Gram negativos
 Tinción de esporas  Hidrólisis de almidón.
 Hidrólisis de almidón  Crecimiento en MacConkey.
94
 Hemólisis en agar sangre  Prueba de TSI.

 Resistencia a polimixina de 300  Prueba de LIA
 Prueba de TSI  Prueba de citrato.
 Prueba de SIM  Prueba de MIO
 Prueba de MIO  Prueba de SIM.
 Licuefacción de la gelatina a 22 °C  Licuefacción de la gelatina
 Utilización del citrato  Prueba de oxidación-
 Prueba de oxidación –fermentación fermentación.
 Prueba de Voges Proskauer  Prueba de ureasa.
 Prueba de ureasa  Prueba de reducción de nitratos.
 Fermentación de glucosa  Fermentación de glucosa.
 Fermentación de manitol  Fermentación de lactosa.
 Fermentación de arabinosa  Fermentación de sacarosa
 Fermentación de Xilosa  Fermentación de manitol.
 Fermentación de lactosa  Fermentación Xilosa.
 Crecimiento en NaCl al 6.5 %  Rojo de metilo.
 Prueba de reducción de nitratos  Prueba de Vogues Proakauer
 Prueba de catalasa  Crecimiento en caldo KCN.
 Prueba de oxidasa  Prueba de malonato.
 Prueba de coagulasa  Prueba de catalasa y catalasa
3.4. REACTIVOS:
 Solución de rojo de metilo  Aceite mineral
 Solución de alfa-naftol  Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %
 Solución de KOH  N,N,N,N-tetrametil-p-
 Reactivo de Kovac o Erlich fenilendiamina
 Solución de ácido sulfanílico  Reactivos para tinción de Gram
 Solución de alfa naftilamina  Reactivos para tinción de esporas
 Plasma de conejo  Oxidasa
 Tween 80 estéril  Catalasa
 Plasma de conejo  Jeringas de 10 ml
3.5. BACTERIAS:
 Escherichia coli  Micrococcus luteus
 Salmonella typhi  Staphylococcus aureus
 Proteus mirabilis  Lactobacillus acidophilus
 Pseudomonas aeruginosa  Bacillus subtilis
 Shigella sp  Corynebacterium glutamicum
A. Preparación del inoculo
a) Tomar un inoculo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la
morfología y determinar pureza, si es así continuar con la identificación.
95
b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y
homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.
c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)
d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores
Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)
Picadura y estría (TSI, LIA)
Picadura (SIM, MIO, gelatina, OF)
Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO 3 ,KCN..)
e) De la suspensión sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa o con una
pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad de inoculo.
f)Colocar una batería de bioquímicas como testigo e incubar los tubos 24 horas y leer
g)La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para
un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.
B LECTURA DE PRUEBAS
96
LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PRUEBA RESULTADO
FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Agregar lugol sobre la estría
Hidrólisis de + Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.
almidón
- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.
+Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la
Fermentación de campana está llena de gas
manitol - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la
Fermentación de campana está llena de gas
lactosa - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.
Fermentación de Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
TSI Fermentación
de glucosa, lactosa Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción
y sacarosa con de H2S positivo: Coloración negra en el medio.
producción de H2S Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado
del tubo ó desplazamiento del medio.
Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.
Producción de H2S ( - ): sin coloración.
Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.
Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo
metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo
(Producción de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
agregar 6 gotas de  naftol y 2 gotas de KOH
Prueba de Voges- +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
Proskauer
- Negativa: El cultivo no cambia de color
97

PRUEBA RESULTADO
UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS

Utilización de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul
de sodio
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilización de Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).
malonato de sodio
Negativa: No hay desarrollo (medio de
Hidrólisis de urea + Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
Producción de
- Negativa: Sin cambio de color en el medio
ureasa
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS
Licuefacción de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco
gelatina minutos.
+ Positivo: licuefacción de la gelatina.
- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar,
descartar la prueba negativa hasta los 14 días.
MIO (movilidad, indol Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.
y ornitina)
Descarboxilación de la ornitina:
+ Positiva: Color púrpura del medio.
- Negativa: Color amarillo del medio.
Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de
kovacs y se observa:
- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.
- Negativo: No se forma el anillo.
SIM (producción de Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro
H2S, indol y alrededor de la picadura o en todo el tubo
movilidad)
Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la
superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido
sulfhídrico el medio se torna completamente negro.
LIA (Desaminación y Desaminación de aminoácidos:
descarboxilación de
+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
aminoácidos)
- Negativa: La superficie no tiene cambios.
Descarboxilación de aminoácidos
+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.
- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.
98

PRUEBA RESULTADO
METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de Agregar 3 gotas de  naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.
nitratos a nitritos
+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos
- Negativa: Sin cambio de color.
Prueba del cianuro + Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)
de potasio
- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Prueba de citocromo Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel
oxidasa filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
+ Positiva: aparición de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Determinación de TUBO SIN SELLO DE ACEITE
metabolismo
Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
oxidativo y/o
fermentativo de la Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin
glucosa (OF) cambios
Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios
Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios.
Prueba de la Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que
catalasa contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxígeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxígeno.
99

PRUEBA RESULTADO
Prueba de la a)-Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo con

coagulasa (Solo 0.5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC
para cocos Gram durante 24 h.
positivos)
b)Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus y
S. epidermidis como testigos positivo y negativo.
c)-En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior, 0.2
ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con
solución salina estéril.
d)-Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6
h a intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar
a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de
coágulo.
e)Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se
añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma
reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 s.
f)En caso de utilizar plasma de humano citratado o heparina.
Positiva: Coagulación del plasma.
Negativa: El plasma esta líquido.
Hemólisis en a)-En una placa con agar sangre estriar con la cepa presuntiva
agar sangre (solo de Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el asa en el
para cocos Gram medio, para crear un ambiente de microaerofilia.
positivos)
b)Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de
hemólisis que presenta.
Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.
Positiva: Hemólisis  color verde tenue alrededor de la colonia.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
Crecimiento en Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo
NaCl AL 7.5 % registrar la turbidez.
Positiva: Turbidez del medio.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
100
Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el
desarrollo de la práctica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.
Nombre del microorganismo: ______________________________________________________
5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las
pruebas de hidrólisis del almidón.
5.2. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se
emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.
5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?
5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál
es su intervalo de sensibilidad?
5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos
microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?
Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,
la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de
los microorganismos.
7. CONCLUSIONES
7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.
8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.
Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p.
101
Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos
Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R
Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +
Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -
Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -
Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +
Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x
Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -
Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +
O/F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT
Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·
Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·
Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·
Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Arachnia ⁪ · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·
Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·
Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·
Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +
Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +
102
Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R
Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -
Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* -⁪ +
Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +
Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -
Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -
Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +
Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F
Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·
Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·
Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·
Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·
Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·
Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·
Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·
Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·
Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·
Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·
Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +
Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +
Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +
Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +
Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +
103
Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.
Símbolo Significado
Tabla No. 1
* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)
⁪ También Actinomyces odontolyticus
D Reacciones diferentes en distintas especies del género
d Reacciones diferentes en distintas cepas
F Fermentación
O Oxidación
w Reacción débil
x No se conoce
<> Variantes no esporágenas
Formas típicas
Presentan algunas características comunes
S Cocos
R Bacilos
NT No probada
Tabla No. 2
* Crecimiento en aire + CO2
⁪ Crecimiento en oxígeno 5-6%
‡ También Shigela dysenteriae
Forma típica
x No se conoce
Presentan algunas características comunes
NT No probada por métodos comunes
Para ambas tablas
+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)
d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)
- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)
() Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío
(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas
(w) Reacción débil y tardía
w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas
D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)
· No se conoce
Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University
1974. pp167.
104
MÉTODOS RÁPIDOS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA

Recientes avances biotecnológicos son usados para la identificación de microorganismos por medio de pruebas de
identificación bioquímica de manera miniaturizada y automatizada haciéndose la identificación más rápida y
económica.
Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello se han
desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como el sistema API
El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram
negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.
Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos
deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana
Reactivos complementarios: API OF
Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API 20 E y el API
STAPH.
INSTRUCCIONES
1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un caldo
nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.
2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA,
IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.
3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml
de agua destilada en los alveolos para crear una atmosfera húmeda. Etiquetar en la lengüeta lateral.
4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación
5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y a una
turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.
6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de una
pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.
7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con aceite de
parafina.
9) Cerrar la cámara de incubación
10)Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+
Lectura de interpretación:
11)Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)
12)Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la cúpula indica
una reacción (+)
13)Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una débil
coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).
14)Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3, como la
galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que corresponden a las
reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.
105
15)Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de identificación.

16)En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de Nitratos a
nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de 2 a 5 minutos y una
coloración roja indica una reacción (+)
17)Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli
ONPG ADH LCD ODC H2s URE TDA IND GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2
- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -
+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -
Tabla de lectura
Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo
ONPG 2 nitro fenilβD- 0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil Incoloro Amarillo (1)
galactopiranosido βD galactopiranosido
ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)
LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado
ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)
CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l
H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro
URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)
TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo
IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa
VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)
GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro
GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación- Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo
fermentación
MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación- Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
INOsitol
SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SORbitol
RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
RHAmnosa
SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SACarosa
MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación Azul-azul verdoso amarillo
MELobiosa
AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación – Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa
3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)
4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula
5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa
106
PRACTICA No. 8.
IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS (PARTE II)
1. OBJETIVOS
El alumno identificará mohos filamentosos y levaduras de una muestra.
1.2 Objetivo específicos
1.2.1 El alumno identificará un moho por medio de la técnica Ridell (microcultivo).
2.-INTRODUCCIÓN
Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría vive en el suelo
como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies
causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura. En
la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a
partir del género Penicillium.
En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para
elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos, etc.
Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de
derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.
También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.
MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS
Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos.
Los mohos mi8croscópicos pueden ser:
1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.
2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células.
Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples,
membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular.
Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de
quitina o mananas. Además, la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta
esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos.
El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama
hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto
que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas
coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas
pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en:
1) Mohos con micelio cenocítico: son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.
107
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones más delgadas o anchas. El
diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta
varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar
cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o
macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo
microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.
En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen
estructuras de reproducción.
Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura
o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37º C en el cuerpo humano,
se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25º C
presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.
REPRODUCCIÓN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas
para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio
ambiente, sin embargo, son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas
fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A
continuación, se muestran la clasificación de estas esporas:
Esporas asexuales:
I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares
con doble pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez
que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía
unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células
aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que
les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas,
llamadas conidioforos.
108
a)Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaños, formas y colores.
Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.
b)Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden
dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La
forma de estas estructuras varía, según el género.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos
unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos,
desarrollándose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las
ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho
ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusión de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las
basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de
estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio
(gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.
FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila
lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general
tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de biosíntesis
los llevan a cabo por las vías más comunes. Por lo tanto, pueden vivir en condiciones más severas que
otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada,
frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad, pero también resisten la
falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30º C.
Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0º C
(mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o
celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno
inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas
cuando poseen con color café oscuro
109

3.1 MATERIAL
 Pipetas de 1 ml  Caja de Petri con Varilla en forma de “V” con
porta y cubreobjetos estériles.
 Bisturí
 Asa micológica
 Mechero
3.2 EQUIPO
 Autoclave  Horno a 170°C
 Incubadora a 28°C y 35 °C  Microscopio
 Tubos con PDA inclinado  Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de
Durham con los azucares siguientes
 Caja de Petri con PDA (para microcultivo)
 Glucosa 10 %
 Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estéril
 Lactosa al 10 %
 Matraz con 50 ml de formaldehído al 10 %
 Maltosa al 10 %
3.4 CEPAS DE MOHOS Placas con cultivo de:

 Penicillium sp  Aspergillus Níger
 Rhizopus sp  S. cerevisiae
4.1 MORFOLOGÍA COLONIAL DE MOHOS
Observar la morfología colonial de los mohos que están en la placa y reportar tamaño, forma, aspecto,
además de observar si hay pigmento difusible.
4.2 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (microcultivo)
a)De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 5 mm de espesor con un bisturí estéril.
b)Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de
“V” en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).
c)Tomar con el asa el inóculo del moho al cual se quiere identificar.
d)Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
e)Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.
f)Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %
g)Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 °C.
h) Realizar observaciones mínimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructíferos.
i)Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de reproducción,
quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.
j)Adicionar 10 ml de formaldehído al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.
110
k)Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre
un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodón lactofenol, sellar la preparación con barniz de
uñas transparente.
l)Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de azul
de algodón lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos
m)Si re requiere la preparación con barniz
n)Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.
o)Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras
reproductivas e identificar el moho.
4.3 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS
a. De la suspensión proporcionada realizar un frotis, fijarlo con calor y realizar una tinción simple.
b. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X
c. Dibujar la levadura que se observó.
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR ASIMILACIÓN O FERMENTACIÓN DE AZUCARES.
Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas
bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en sus capacidades de fermentar azúcares.
a.De la suspensión a la que se le hizo la tinción simple y si resulto ser una levadura
b.Inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares.
c.Incubar de 24 – 48 h y observar la fermentación o asimilación del carbohidrato y comparar los
resultados que se buscarán en la bibliografía como la siguiente tabla.
d.Identificación de levaduras del género Candida.
Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa
C. albicans + + - + - +
C. tropicales + - + + - +
C. glabrata + - - - - +
C. guilliermondi + - + + - +
C. parapsilosis + - - + - +
C. krusei + - - - - -
C. kefyr + - + + + +
C. lipolitica + - - - - -
C. zeylanoides +* - - - - -
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Dibujar la levadura observada al microscopio
5.2 Dibujar las estructuras de reproducción del moho
5.5 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________
111
5.6 Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar
rosa de bengala
5.7 ¿Por qué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?
5.8 ¿Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?
5.9 ¿Cómo identificarías un moho contaminante en un producto biotecnológico?
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la
naturaleza.
7 CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados
obtenidos y la bibliografía consultada.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana
1991.
8.2Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993
Esquemas de mohos y levaduras
RPS
112
113
114
115
116
117
PRACTICA No. 9
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento Microbiano
5.2 Crecimiento microbiano, factores que lo afectan y productos de interés farmacéutico.
5.3 Curva de crecimiento
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué
ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno realizará un cultivo de Escherichia coli por lote en caldo glucosa sales al 5 %, para
determinar la fase lag y log.
1.2.2 El alumno realizara dos métodos indirectos para la cuantificación de microorganismos, que son la
turbidimetría con un espectrofotómetro y el conteo directo en cámara de Neubauer.
1.2.3 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables por medio de la técnica normalizada
de vaciado en placa, auxiliándose del conteo directo en cámara de Neubauer.
1.2.3 El alumno graficará los resultados obtenidos para identificar por lo menos dos fases de crecimiento
y obtendrá la tasa especifica de crecimiento para este sustrato y el tiempo de generación de E.
coli.
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están
aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de
microorganismos o poblaciones de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que
crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos
requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la
presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno,
las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células,
la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.
El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique,
es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos
unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los
diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres
horas.
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.
Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy
pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.
118
Los métodos recomendados para medir la población son:

Recuento en placa Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa. Siembra por extensión con varilla
Filtración Método del número más probable
Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).
Hay otros 3 métodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetría.
2.- Actividad metabólica.
3.- Peso seco.
Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara
de conteo celular, por ejemplo, la cámara de Neubauer, y un microscopio.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con
azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan
roturas en la membrana.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones
de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y
generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del
número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a
producir algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH,
concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo,
en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
Parámetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos
interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.
La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = X -X
max 0
La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad
específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del crecimiento.
Se calcula a partir de las densidades bacterianas X y X en los tiempos t y t, en la fase de crecimiento
0 t 0
exponencial según
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.
119
Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por
la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y por
turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en
algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL
Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril  Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta
(matraz semilla) estándar (para el vaciado en placa)
Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria  120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución
estéril y/o caldo glucosa sales salina (para las diluciones)
Dos celdas y un portaceldas  40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa)
• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles  Una pizeta con benzal
3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
 NaCI ó peptona  Agar cuenta estándar
 Caldo Luria  Caldo glucosa sales al 5 %
3.3.- EQUIPO
 Espectrofotómetro  • Incubadora a 37° C
 • Autoclave  • Contador de colonias
 • Horno  • Cámaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Suspensión de Escherichia coli Suspensión de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN)
4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de
esterilidad
De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el
espectrofotómetro.
a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz
b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540
nm) y la región visible
c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco.
120
d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer

e)Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en
el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.
f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer,
previamente limpiada con papel sanitario.
g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura.
h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar la
celda dos o tres veces con benzal. Una vez leída la muestra, apagar el espectro.
4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER
a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el
cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.
b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el
cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.
c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el
portaobjetos, Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro,
en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3
mm., con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así
pues, el área sombreada y marcada le corresponde a un mm 2. La
depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada
0.1 mm, y el volumen es de 0.1 mm 3, es decir 0.1 µl.
d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X
e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A, B.C y D, sumar los valores
obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.
f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de en
medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y
obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de células/ml.
4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA
a)La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en un
-1
tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución 10 . Mezclar el tubo según las
recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina para
-2
obtener la dilución 10 y así sucesivamente.
b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría o en
6 -6 -7
el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x10 , entonces realiza hasta las diluciones 10 y 10 .
Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que
debemos tener un intervalo de conteo
4.4 CUENTA VIABLE
a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
121
SESIÓN II
Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes
consideraciones
Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D
Equipos 1,2 y dos Equipos 3 y 4 y un Equipos 6,7 y dos Equipos 8 y 9 y un
alumnos del equipo 5 alumno del equipo 5 alumnos del equipo 10 alumno del equipo 10
150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%
Volumen del inóculo 10 ml 10 ml 10ml
Si la As es de 0.8-0.9
4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor)

a)Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5 ml de
una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.
b)Incubar a 35° C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.
4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)
Trabajo para el profesor

a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este
valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética
b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza.
4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA
Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla
con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de cinética y
colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el
espectro y poder leer cada lectura).
2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el
profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el matraz
con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t0)
3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para
que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en
este orden:
a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las
diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la NOM
110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las
122
recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.
Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero
b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda
en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que
realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)
d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al
compañero que va a realizar el conteo en el microscopio.
e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y
desechar la pipeta en el benzal.
f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra
g.- Incubar las placar a 35°/ 24 h y realizar el conteo
123
5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________
Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.
Tiempo Conteo Promedio Resultado
To Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T1 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas?

5.3.4 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes
zonas de crecimiento.
5.3.5 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas).
124
5.3.6. Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia.
5.3.7 Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.
5.3.8 Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.
5.3.9 Define el término velocidad específica de crecimiento
5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.3.11 ¿Por qué es importante la cinética microbiana?
6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los
resultados obtenidos en esta práctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de turbidimetría
y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué podrá servir.
7. CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la
8. BIBLIOGRÁFIA
8.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág.
8.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss,
USA. 715 pág.
8.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición.
Prentice Hall, España. 956 pág.
8.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second
edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs.
8.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de células: cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular.
Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de 2003.
125
PRÁCTICA No. 10
RESISTENCIA MICROBIANA
UNIDAD VI: Resistencia bacteriana a antibióticos
1. OBJETIVOS:
1.1 El alumno determinará la resistencia de bacterias a los antibióticos
1.2.1. El alumno evaluará la resistencia de bacterias Gram positivas y Gram negativas a diversos
antibióticos de alto espectro.
1.2.2 El alumno realizará la técnica de Kirby- Bauer para medir la resistencia a antibióticos.
1.2.3 El alumno realizará a técnica de diluciones seriadas en tubo y determinará la CMI (concentración
mínima inhibitoria) y la CMB (concentración mínima bactericida).
2. INTRODUCCIÓN
Actualmente el tratamiento de las enfermedades depende de los agentes quimioterapéuticos, que son
productos químicos que destruyen microorganismos patógenos o frenan su crecimiento a
concentraciones lo suficientemente bajas para evitar un daño en el huésped. La mayoría de estos
agentes son los antibióticos, aunque también se encuentran los antimicóticos, antiprotozoarios y los
antivirales. Estos compuestos son muy importantes en medicina clínica, veterinaria y en la agricultura.
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por ciertos microorganismos, que en bajas
concentraciones tienen la capacidad de inhibir el crecimiento o matar a otros microorganismos, es decir
pueden ser bactericidas, que matan al patógeno (su actividad depende de la concentración) o
bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento de forma reversible. Son metabolitos secundarios no
esenciales que se sintetizan cuando el microorganismo productor se encuentra en la fase estacionaria.
La mayoría de los antibióticos son producidos por bacterias que se encuentran en el suelo, por ejemplo,
los géneros Streptomyces y Bacillus, entre los hongos están los géneros Penicillium, Cephalosporium y
Aspergillus.
Los antibióticos son agentes quimioterapéuticos naturales, aunque actualmente existen antibióticos
semi-sintéticos que tienen modificaciones en la molécula original y antibióticos sintéticos, obtenidos
mediante procedimientos químicos. Los antibióticos se producen a nivel industrial en procesos de
fermentación con cepas sobre-productoras mejoradas genéticamente. Por otra parte, la modificación
química o por ingeniería genética utilizadas en la búsqueda de nuevos antibióticos más eficaces
continúa, debido a que constantemente aparecen cepas de microorganismos con resistencia inherente o
adquirida a los antibióticos de uso común en la agricultura, ganadería y medicina, este hecho se debe a
la utilización indiscriminada e irresponsable de los antibióticos.
Al conjunto de grupos bacterianos, que un antibiótico en particular afecta, se le conoce como espectro
de acción, así tenemos que algunos fármacos sólo son eficaces contra una gama pequeña de
patógenos, son antibióticos de espectro reducido, otros son fármacos de amplio espectro y atacan a
muchas clases de patógenos. Las bacterias Gram positivas son más sensibles que las Gram negativas,
los antibióticos de amplio espectro actúan sobre ambos grupos.
Los antibióticos se clasifican en base a su estructura química y en su mecanismo de acción. Se agrupan
en dos categorías principales, los agentes sintéticos y los antibióticos. Los sintéticos son las sulfamidas y
las quinolonas.
126
SULFAMIDAS: fueron los primeros antimetabolitos empleados con éxito como quimioterapéuticos. La
sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p-aminobenzoico, cuando la sulfanilamida entra en la
célula bacteriana, compite con el acido p-aminobenzoico por el sitio activo de una enzima que participa
en la síntesis de fólico y disminuye su concentración, esto es dañino para la bacteria porque el ácido
fólico es esencial para la síntesis purinas y pirimidinas. Ejemplos son el sulfametoxazol y el sulfisoxazol.
La eficacia de las sulfamidas está limitada por el aumento de la resistencia de muchas bacterias, y tiene
efectos secundarios adversos como reacciones alérgicas (fiebre, ronchas y exantemas).
QUINOLONAS: las quinolonas son fármacos sintéticos que contienen el anillo de 4-quinolona, la primera
quinolona que se sintetizó fue el ácido nalidíxico, actualmente se utilizan ciprofloxacino y norfloxacino y
ofloxacino y se está trabajando en otras. Las quinolonas son eficaces cuando se administran por vía
oral. Y pueden causar efectos secundarios adversos, principalmente irritación gastrointestinal. Las
quinolonas actúan inhibiendo la DNA girasa bacteriana o topoisomerasa II, probablemente ligándose al
complejo DNA girasa, esta inhibición interrumpe la replicación y reparación del DNA, lo que resulta letal
para la bacteria. Las quinolonas son fármacos de amplio espectro. Resultan eficaces contra las bacterias
entéricas como Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, también son activas contra Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Micobacterium tuberculosis, actualmente se emplean en el tratamiento
de infecciones urinarias y de trasmisión sexual causadas por Neisseria y Chlamydia.
Los principales grupos de antibióticos son:
PENICILINAS: la penicilina G o bencilpenicilina, el primer antibiótico empleado ampliamente en
medicina, todas son derivadas del ácido 6-aminopenicilánico y difieren en su cadena lateral unida al
grupo amino. La característica principal es el anillo β-lactámico, el cual es esencial para su actividad. La
penicinilasa, la enzima sintetizada por muchas bacterias resistentes a la penicilina, destruye la actividad
de la penicilina hidrolizando un enlace de este anillo. Ejemplos: penicilina G, penicilina V, ampicilina,
carbenicilina, meticilina y ticarcilina. La estructura de las penicilinas es similar a la D-alanil-D-alanina
terminal que se encuentra en la cadena lateral peptítica del peptidoglucano, y se ha propuesto que la
penicilina inhibe la enzima responsable de la reacción de transpeptidación por su similitud estructural, y
que bloquea la síntesis de peptidoglicano. Las penicilinas son eficaces contra gonococos,
meningococos, y patógenos Gram positivos. Aunque las penicilinas son los antibióticos menos tóxicos,
va en aumento el número de personas alérgicas, una persona puede morir de una reacción alérgica
violenta.
CEFALOSPORINAS. Las cefalosporinas son una familia de antibióticos cuya estructura es muy similar a
las penicilinas en el anillo β-lactámico. Son fármacos de amplio espectro, que se administran a pacientes
con alergias a la penicilina. Existen tres grupos o generaciones de estos fármacos, en particular la
cefoperazona es resistente a la destrucción por β-lactamasas y resulta eficaz contra muchas bacterias
Gram negativas, incluida Pseudomonas aeruginosa, otros ejemplos son cefalotina, cefoxitina y
ceftriaxona. Debido a su analogía estructural con las penicilinas, las cefalosporinas inhiben la reacción
de transpeptidación durante la síntesis de peptidoglicano, son fármacos de amplio espectro que a
menudo se administran a pacientes con alergias a la penicilina.
TETRACICLINA: esta familia de antibióticos tiene una estructura de cuatro anillos a los que están unidas
diversas cadenas laterales, la oxitetraciclina y la clortetraciclina son producidas por especies del género
Streptomyces, otras son semisintéticas. Es un grupo de amplio espectro, pero de actividad
bacteriostática. Estos antibióticos inhiben la síntesis proteica uniéndose a la subunidad 30S del
ribosoma e inhibiendo la unión de moléculas de aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma. Son de amplio
espectro contra bacterias Gram negativas y Gran positivas, Rickettsias, clamidias y micoplasmas. Las
dosis elevadas pueden causar náuseas, diarrea, lesiones hepáticas y renales, dientes amarillos en los
niños.
AMINOGLUCÓSIDOS: aunque sus estructuras son diferentes entre si, todos ellos contienen un anillo
ciclohexano y aminoazúcares, son bactericidas y son más activos contra los Gram negativos, entre los
127
más importantes están: la estreptomicina, kanamicina, gentamicina, neomicina y tobramicina. Los

aminoglucósidos se unen a la subunidad 30S del ribosoma e interfieren en la síntesis proteica
inhibiéndola directamente o también causando error en la lectura del mensaje genético transportado por
el m RNA. La utilidad de la estreptomicina ha disminuido por la alta resistencia a ella, aunque sigue
siendo eficaz contra la tuberculosis y peste. La gentamicina se emplea para tratar las infecciones por
Proteus, Escherichia, Klebsiella y Serratia, los aminoglucósidos son muy tóxicos y pueden causar
sordera, daño renal, pérdida del equilibrio, náusea y reacciones alérgicas.
MACRÓLIDOS: contienen grandes anillos de lactona de 12 a 22 átomos de carbono, ligado a uno o más
azúcares. El más representativo es la eritromicina, es de amplio espectro eficaz contra Gram positivas,
micoplasmas y algunas Gram negativas, es bacteriostática y se une al r RNA 23S de la subunidad 50S
del ribosoma para inhibir la elongación de la cadena peptídica durante la síntesis proteica. Se emplea en
pacientes alérgicos a la penicilina y en el tratamiento de la tos ferina, la difteria y diarrea causada por
Campylobacter, y la neumonía causada por Legionella. Otros ejemplos son la clindamicina, espiramicina
y la azitromicina, esta última es eficaz contra Chlamydia trachomatis.
CLORANFENICOL: su estructura consta de un grupo propanol unido a un radical nitrobenceno, aunque
fue producido inicialmente a partir de cultivos de Streptomyces venezuelae, en la actualidad se produce
por síntesis química, es de amplio espectro, pero muy tóxico, afecta a la médula ósea, que lleva a una
anemia y a una disminución de glóbulos blancos. El cloranfenicol solo se emplea en situaciones que
amenazan la vida en las que no es adecuado otro fármaco. Este antibiótico se une al rRNA 23S de la
subunidad 50S del ribosoma, e inhibe la peptidil transferasa.
En base a su mecanismo de acción tenemos:
INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE LA PARED CELULAR. Inhiben las enzimas de transpeptidación que
participan en los enlaces de las cadenas de polisacáridos de la peptidoglicana de la pared celular
bacteriana. Ejemplos penicilina, ampicilina, carbenicilina, meticilina cefalosporinas, vancomicina y
bacitracina.
INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS PROTEICA: se ligan a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano para
inhibir la síntesis proteica y causan errores de la lectura del mRNA, por ejemplo estreptomicina y
gentamicina. Otro mecanismo es que se ligan a la subunidad 50S del ribosoma e inhiben la elongación
de la cadena peptídica, por ejemplo la eritromicina y clindamicina. Otros antibióticos son el cloranfeniciol,
tetraciclinas, el ácido fusídico.
INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Inhiben la DNA girasa bacteriana, por ejemplo
el ciprofloxacino y otras quinolonas. Otro mecanismo es bloquear la síntesis de RNA uniéndose e
inhibiendo la RNA polimerasa dependiente de DNA, por ejemplo la rifampicina.
ALTERACIÓN DE LA MEMBRANA CELULAR. Se liga a la membrana plasmática y altera su estructura y
sus propiedades de permeabilidad. Por ejemplo la polimixina B.
ANTAGONISMO METABÓLICO. Las sulfamidas inhiben la síntesis de ácido fólico, el trimetoprima
bloquea la síntesis de tetrahidrofolato por inhibición de la dihidrofolato reductasa.
RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS.
La resistencia a los antibióticos es la capacidad adquirida de un organismo para resistir los efectos del
mismo, al que es sensible habitualmente. La mayor parte de la resistencia a los antimicrobianos es
debida a genes de resistencia que se transfieren por intercambio genético.
Los genes de resistencia a los antibióticos están presentes tanto en el cromosoma bacteriano como en
plásmidos, pequeñas moléculas de DNA circular que pueden existir independientes del cromosoma o
integrarse en él. Las mutaciones espontáneas del cromosoma bacteriano no son muy frecuentes, pero
pueden hacer a la bacteria resistente a un antibiótico, estos mutantes pueden ser destruidos por el
huésped por sus mecanismos de defensa natural. Sin embargo cuando se trata ampliamente a un
128
paciente con antibióticos, algunos mutantes resistentes pueden sobrevivir y proliferar por su ventaja
competitiva sobre los gérmenes no resistentes. Frecuentemente, un patógeno bacteriano es resistente a
fármacos porque posee un plásmido portador de uno o más genes de resistencia; estos plásmidos se
denominan plásmidos R (plásmidos de resistencia). Los genes de los plásmidos de resistencia, en
general, codifican enzimas que destruyen o modifican a los antibióticos, por ejemplo, la hidrólisis de la
penicilina o la acetilación del cloranfenicol y los aminoglucósidos. Se han involucrado genes asociados a
plásmidos de resistencia a aminoglucósidos, cloranfenicol, penicilinas, cefalosporinas, eritromicina,
tetraciclinas, sulfamidas entre otros. Este plásmido R, puede transferirse a otras células a través de los
mecanismos de intercambio de material genético, como la conjugación, transducción y la transformación.
El tratamiento prolongado con antibióticos favorece el desarrollo y la propagación de las cepas
resistentes, porque el antibiótico destruye las bacterias sensibles normales que competirían en
condiciones habituales con las cepas resistentes. El resultado es la aparición de patógenos resistentes a
fármacos que llevan a la sobre-infección, por ejemplo Candida albicans produce sobre infecciones
cuando la competencia bacteriana es eliminada con antibióticos.
Otro aspecto importante es que muchos pacientes que son tratados con antibióticos interrumpen su
tratamiento al sentirse mejor, y dan tiempo a que las cepas resistentes expresen sus genes de
resistencia o que muten, estas proliferan al no tener competencia y surgen las cepas resistentes.
En general, el uso indiscriminado de los antibióticos ha generado el aumento de cepas resistentes, las
cuales van un paso adelante en comparación con la producción de nuevos antimicrobianos eficaces, la
industria farmacéutica trabaja en el diseño de nuevos compuestos o en la modificación de los ya
existentes para cubrir las necesidades de antibióticos mas eficaces.
Las bacterias pueden presentan resistencia a un antibiótico debido a:
1.- La estructura blanco (receptor) sobre la que el antibiótico actúa se encuentra modificada o no
existe, por lo que el antibiótico no puede unirse e inhibir, por ejemplo las modificaciones del r RNA 23S
(de la bacteria) pueden disminuir la afinidad de los ribosomas a los que se unen la eritromicina y el
cloranfenicol. Otro ejemplo es la modificación de la proteína receptora de la estreptomicina en los
ribosomas bacterianos, lo que impide que la estreptomicina actúe.
2.- Poseen una barrera de permeabilidad al antibiótico (no permite el paso del antibiótico a la célula).
Muchas bacterias Gram negativas no resultan afectadas por la bencilpenicilina porque ésta no puede
atravesar la membrana externa de la envoltura. Las micobacterias son resistentes a muchos antibióticos
por su elevado contenido de lípidos (ácidos micólicos) en la pared celular, lo que la hace impermeable a
muchos fármacos.
3.- Modifican enzimáticamente el antibiótico inactivándolo. El ejemplo mejor conocido es la hidrólisis
del anillo β-lactámico de muchas penicilinas por la enzima penicilinasa. También son inactivados por la
adición de grupos químicos, los microorganismos resistentes pueden fosforilar o acetilar los
aminoglucósidos y acetilar el cloranfenicol.
4.- Han desarrollado mutaciones genéticas que alteran la vía metabólica sobre la que actúa el
antibiótico. Por ejemplo algunas bacterias son resistentes a las sulfamidas porque emplean el ácido
fólico del medio en lugar de sintetizarlo, otras cepas aumentan su producción y contrarrestan la
inhibición por sulfamidas.
5.- Los microorganismos son capaces de bombear hacia el exterior el antibiótico que haya
penetrado a la célula. Algunos patógenos poseen translocasas en la membrana plasmática que
expulsa a los fármacos. Estas proteínas son inespecíficas, pueden bombear a muchos fármacos
diferentes, y se les denomina “bombas de multirresistencia”, utilizan el sistema antiporte fármaco/protón.
Este sistema existe en Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium smegmatis y
Staphylococcus aureus.
129
6.- El microorganismo carece de la estructura que inhibe el antibiótico, por ejemplo, algunas
bacterias como los micoplasmas carecen de pared celular, por lo que son resistentes a la penicilina.
DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.
Resumiendo, la transferencia genética y la aparición de mutantes en las bacterias han dado lugar a la
aparición de cepas resistentes a uno o varios antimicrobianos, tanto en la población en general como en
el ámbito hospitalario. Esto ha llevado a la necesidad de conocer el patrón de sensibilidad de cepas
aisladas de casos clínicos frente a los microbianos disponibles, teniendo en consideración que tal patrón
puede variar dependiendo del género y especie, incluso el lugar de donde es aislado.
La determinación del patrón de sensibilidad de los aislamientos bacteriano hacia agentes
antimicrobianos es una de las tareas más importantes en la microbiología clínica y farmacéutica. Hay
dos pruebas para mostrar que antibióticos son más eficaces contra un patógeno, estas son:
Pruebas de sensibilidad por dilución.
Estas pruebas se pueden emplear para determinar la CMI (concentración mínima inhibitoria), que es la
concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento de un determinado patógeno y la CMB
(concentración mínima bactericida) que es la concentración más baja de un fármaco que mata al
patógeno. La prueba de dilución en tubo se puede hacer en tubo, en placa o en microplaca. En la de
tubo, se prepara una serie de tubos con caldo de cultivo (Mueller-Hinton) que contiene concentraciones
de antibióticos entre 0.1 y 128 μg/mL y se inocula con cantidades estándar del microorganismo objeto de
la prueba. La concentración mínima de antibiótico a la que no se produce crecimiento del
microorganismo tras 20-24 horas de incubación es la CMI, la CMB se puede determinar después de
subcultivar los tubos no muestran crecimiento en un medio nuevo sin antibiótico, la concentración más
baja del antibiótico a partir de la cual los microorganismos no se recuperan y no crecen cuando son
transferidos a un medio nuevo es la CMB. La prueba en placa es muy similar a la de tubo, pero en esta
se utilizan placas de agar de Mueller-Hinton. Actualmente se han desarrollado varios sistemas
automatizados para realizar pruebas de sensibilidad y determinación de CMI.
Pruebas de sensibilidad por difusión en agar.
Esta prueba se utiliza con bacterias de crecimiento rápido para ahorrar tiempo y medios de cultivo. Se
basa en colocar un disco impregnado de un antibiótico sobre una placa de medio de cultivo (Mueller-
Hinton) previamente sembrada con la bacteria de prueba, el disco capta humedad y el antibiótico difunde
radialmente hacia fuera a través del agar, produciendo un gradiente de concentración de antibiótico, este
está presente a una concentración alta cerca del disco y afecta incluso a gérmenes poco sensibles (los
microorganismos resistentes crecen hasta en el disco). A medida que aumenta la distancia desde el
disco, disminuye la concentración del antibiótico y solo los patógenos más sensibles resultan dañados.
Si el antibiótico inhibe el crecimiento bacteriano, en torno al disco se forma un anillo claro y cuanto mas
amplio más sensible es el microorganismo. Influye también la concentración inicial del antibiótico, su
solubilidad y tasa de difusión a través del agar. En la actualidad, la prueba de difusión en agar más
empleada es el método de Kirby-Bauer, que fue desarrollado a principios de 1960 por William Kirby,
A.W. Bauer y colaboradores. Este procedimiento es recomendado por la Food and Drug Administration
(FDA) de los Estados Unidos. Esta técnica permite asignar a un microorganismo en las categorías de
sensible, resistente o intermedio y brinda al médico la posibilidad de elegir el antibiótico más apropiado,
y a la industria farmacéutica hacer un seguimiento y realizar estadísticas en cuanto a la sensibilidad de
los antibióticos que esta produciendo.
3.2 EQUIPO
 Incubadora a 37oC
130
3.2 MATERIAL
 Pinzas estériles  Sensidiscos Gram negativos

 Hisopos estériles  Mechero
 Tubos de ensaye estériles  Asa microbiológica
 Sensidiscos Gram positivos  Gradilla
2 placas de gelosa Müeller  REACTIVOS

Hinton
 Solución salina estéril
 11 tubos de 13 x100mm con 4.5 ml de
caldo Müeller-Hinton
 Klebsiella pneumoniae  Staphylococcus aureus (en gelosa

Müeller-Hinton) en “slant”
 Escherichia coli
A) Método de difusión del antibiótico en agar empleando multidisco (método de Kirby-Bauer).
1.- Realizar tinción de Gram a la cepa problema y tomar 2 ó 3 asadas de la cepa proporcionada y
suspender en 3 ml de solución salina estéril, se ajusta la turbidez de la suspensión hasta tener una
densidad comparable con un estándar que corresponde al tubo No. 0.5 del nefelómetro de Mac Farland
(equivale a 108 microorganismos/ml). La suspensión ajustada no debe permanecer más de 20 minutos
antes de sembrarla.
2.- Introducir un hisopo estéril a la suspensión bacteriana y humedecerlo, quitar el exceso de caldo
presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo. Se estría masivamente la placa de
Müeller-Hinton en tres direcciones sobre la totalidad de la superficie de agar, para obtener un inóculo
uniforme, se efectúa el último barrido del hisopo sobre el reborde de la caja de Petri, cuando el inóculo
se ha secado (3-5 minutos) se procede a colocar los discos.
3.- Colocar con las pinzas flameadas, un multidisco (Gram + ó Gram -) o discos individuales sobre la
placa sembrada. Presionar ligeramente cada disco para asegurar un contacto completo con el cultivo.
4.- Después de haber 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petri e incubar a 35 o C.
el tiempo de incubación es de 18-24 horas.
5.- Medir los diámetros (en milímetros) de los halos de inhibición con ayuda de una regla.
Las colonias grandes que aparecen entre la zona clara de inhibición pueden ser variantes resistentes o
bien un inoculo mezclado, por lo que se recomienda verificar la pureza de éste.
131
El swarming que produce Proteus sp se descarta.

Las cepas se clasificarán en Resistentes (R), Intermedias (I) o Susceptibles (S), dependiendo del
diámetro del halo de inhibición (incluyendo los 6 mm del disco), empleando la tabla 1, que relaciona el
diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia microbiana. Los valores de la tabla, se han
obtenido empleando los valores de CMI y los diámetros de la zona de inhibición de muchas cepas
diferentes de microorganismos.
TABLA 1
ANTIBIÓTICO CONCENTRACIÓN Resistente Intermedio Sensible
Amikacina 30 μg < 14 15-16 > 17
AmpicilinaFrente a Enterobacteriaceae 10 μg < 11 12-13 > 14
Ampicilina Frente a Staphylococcus sp 10 μg < 28 > 29
Carbenicilina Frente a
100 μg < 17 17-22 > 23
Enterobacteriaceae
Carbenicilina Frente a Pseudomonas sp 100 μg < 13 14-16 > 17
Cefalotina 30 μg < 14 15-17 > 18
Cefotaxima 30 μg < 14 15-17 > 23
Ceftazidima 30 μg < 14 15-17 > 18
Ceftriaxona 30 μg < 13 15-17 > 21
Cefuroxima 30 μg < 14 15-17 > 18
Cloranfenicol 30 μg < 12 13-17 > 18
Dicloxacilina 1 μg < 10 11-12 > 13
Enoxacina 10 μg < 14 15-17 > 18
Eritromicina 15 μg < 13 15-16 > 18
Gentamicina 10 μg < 12 13-14 > 15
Netilmicina 30 μg < 12 13-14 > 15
Nitrofurantoina 300 μg < 14 15-16 > 17
Pefloxacina 5 μg < 14 15-22 > 23
Penicilina Frente a Staphylococcus sp 10 U < 28 > 29
Penicilina Frente a Neisseria
10 U < 19 > 20
gonorrhoeae
Penicilina Frente a Enterococos 10 U < 14 > 20
Penicilina Frente a otros estreptococos 10 U < 19 > 28
Tetraciclina 30 μg < 14 15-18 > 19
Trimetroprim-Sulfametoxazol 25 μg < 10 11-15 > 16
La técnica de Kirby-Bauer está diseñada para probar la sensibilidad antimicrobiana para
microorganismos aerobios no exigentes y de crecimiento rápido.
Control de calidad. Las cepas control utilizadas para medir la reproducibilidad de esta técnica son
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) que deberá incluirse en la prueba
diaria. La FDA recomienda el uso de la cepa Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) susceptible a
Gentamicina y Carbenicilina; deben emplearse siempre en las mismas condiciones que las cepas
problema.
B) Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima
bactericida (CMB) de un antibiótico, por el método de diluciones seriadas en tubo.
1.- Colocar en una gradilla once tubos de ensaye con caldo de Mueller-Hinton y marcar los tubos del 1 al
11.
132
2.- Tomar 0.5 ml de la solución de ampicilina (10,000 μg/ml) y hacer diluciones en serie 1:10 del tubo 1 al
10, el tubo 11 será testigo de la viabilidad de la cepa, por lo que no lleva antibiótico.
3.- Adicionar a todos los tubos 0.1 ml de la suspensión bacteriana problema que puede ser de
Staphylococcus aureus, E. coli ó Klebsiella sp.
4.- Incubar a 37° C durante 24 horas.
5.- Observar el crecimiento como turbidez en los tubos, anotar hasta que concentración hay turbidez, el
tubo en donde no exista crecimiento se toma como la CMI y ese es el punto critico.
6.- Del punto crítico tomar dos tubos que muestren turbidez y dos en donde no haya crecimiento.
7.- Tomar una placa de agar Muller Hinton y dividirla en cuatro cuadrantes y sembrar en cada una de
ellas por estría simple, anotar la concentración que corresponda.
8.- Observar si existe aparición de crecimiento y si no lo hay, entonces esa concentración corresponde a
la CMB.
A) Anotar los resultados en las tablas siguientes sobre la morfología colonial y microscópica:
Diámetro del halo de inhibición (mm)
ANTIBIÓTICO Staphylococcus aureus Klebsiella sp. Escherichia coli
5.1 ¿Qué utilidad tiene un estudio como éste en la práctica bacteriológica de rutina?
B) Anota en la siguiente tabla la información sobre las diluciones y concentraciones utilizadas en el
método de las diluciones seriadas del antibiótico en tubo.
Prueba de tubo. Antibiótico_______________________ Microorganismo:
________________________________
Tubo Dilución Concentración.
1
2
3
4
5
6
7
133
8
9
10
Anota los resultados de crecimiento de S. aureus, obtenidos en los tubos con diferente concentración de
antibiótico.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Crecimiento
Anotar el crecimiento con un signo + y en donde hay ausencia con un signo -

¿Cuál fue la concentración mínima inhibitoria (CMI) del antibiótico sobre el microorganismos ?__μg / ml
¿Con los datos obtenidos, determina cual fue la concentración mínima bactericida (CMB) ______μg / ml
5.2 Explica las diferencias entre un fármaco, agente quimioterapéutico, antimicrobiano y antibiótico.
5.3 ¿Cuáles son las causas del incremento de resistencia a los antibióticos? (explica)
5.4 ¿Qué técnica utilizarías para hacer un estudio sobre resistencia a antibióticos de una cepa
multirresistente aislada de un caso clínico? Explica el porqué.
5.5 ¿Cuáles son los errores más comunes que se presentarse al realizar la técnica de Kirby-Bauer?
5.6 De los antibióticos que utilizaste elige dos y llena el siguiente cuadro.
I. Antibiótico y clave de identificación: II. Antibiótico y clave de identificación:
Concentración Concentración
Grupo al que pertenece Grupo al que pertenece
Mecanismo de acción Mecanismo de acción
Diámetro del halo inhibición Diámetro del halo inhibición
Valores de Referencia Valores de Referencia
Interpretación Interpretación
5.7 ¿Cuáles son las características generales de un antibiótico?

6.1 Discutir los resultados de la práctica.
7. CONCLUSIONES
8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall.
España. 956 p.
8.2 Giono Cerezo Silvia: prueba de Bauer-Kirby para sensibilidad a os antimicrobianos. Infectología III
(7): 325, 1983.
8.4 Prescott, H. K. Microbiología. 4ª. Edición. Mc Graw Hill. 1999, 1005 p.
134
PRÁCTICA No. 11
AUTOVACUNAS
UNIDAD VIII: Aspectos básicos en la producción de productos inmunológicos
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivos generales
4.9.1El alumno identificará el principio básico de la elaboración de una vacuna.
I.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno obtendrá muestras biológicas para la elaboración de una vacuna
1.2.2. El alumno preparará una autovacuna a partir de una muestra biológica.
2. INTRODUCCIÓN
Las vacunas, según la definición tradicional son preparaciones inmunogénicas inocuas, obtenidas
generalmente a partir de agentes infecciosos o tóxicos que, al ser inoculadas a individuos
inmunocompetentes, inducen un estado específico de protección contra los efectos nocivos del agente
de donde provienen.
La vacunación consiste en la inducción y producción de la respuesta inmune específica y protectora
(humoral y celular) de un individuo sano como consecuencia de la administración de un producto
biológico, la vacuna, y se basa en la respuesta del sistema inmune a cualquier elemento extraño
(antígeno) y en la memoria inmunológica. Las vacunas, desde su aparición, han sido el primer recurso
en la prevención de enfermedades infecciosas y constituyen uno de los avances más importantes de la
inmunología y de la medicina preventiva.
La vacunación es el medio más eficaz para prevenir enfermedades infecciosas en humanos y animales,
ya que permite evitarlas, controlar el número de infectados e incluso erradicar a los microorganismos
patógenos causantes de ellas, como es el caso de la extinción del virus de la viruela, que sin duda fue
uno de los agentes infecciosos más peligrosos que se conocieron, en este tiempo, existen también
vacunas terapéuticas que evitan el progreso de enfermedades infecciosas crónicas.
Las características ideales de una vacuna son: reproducir una respuesta inmunológica similar a la
infección natural; que sea efectiva (más del 90% de protección); que tenga mínimos efectos secundarios
y que sea completamente segura; que confiera inmunidad a largo plazo; que sea de dosis única y
compatible con otras vacunas; que su administración sea en los primeros meses de vida y de
preferencia por vía oral; que sea estable a temperatura ambiente, de fácil producción y económicamente
accesible. Obviamente que muchas de ellas no cumplen con todas
La utilización de las vacunas se remonta desde 1798 cuando Edward Jenner, médico inglés inicia la
inoculación de personas con material obtenido de lesiones de vaccinia (viruela de las vacas), para
proteger las contra la viruela, pronto utilizó lesiones de la viruela humana con lo que se obtuvo una alta
eficiencia protectora. Entre 1880 y 1885 Louis Pasteur científico francés logra descubrir varias formas de
disminuir la virulencia de la bacteria que causa el cólera de las aves (Pasteruella avisepticum) pero sin
perder su capacidad inmunizante, esto se logra también con el microorganismo causante del ántrax o
carbunco en ovinos (Bacillus anthracis), siendo capaz de inducir protección contra el ántrax, cuando se
inocula en animales sanos. Sin embargo, el descubrimiento más famoso de Pasteur, fue obtener un
extracto atenuado de tejido nervioso de animales infectados con rabia, que mantenían su capacidad
inmunizante, la vacuna de la rabia. En 1908 se empleó el bacilo de Calmette y Guerin, BCG (una cepa
atenuada de Mycobacterium ovis), para proteger a la población contra la tuberculosis.
Actualmente la preparación de vacunas ha sido optimizada, de tal manera que se obtiene una mejor
respuesta inmune con un mínimo riesgo para el individuo. La Secretaria de Salud es la que se encarga
135
de la elaboración y distribución de las vacunas, así como de la vacunación de la población en' general.
Las vacunas de mayor aplicación son las de poliomielitis (vacuna anti-poliomielitis tipo Sabin), la
tuberculosis (vacuna BCG anti-tuberculosis), difteria y tétanos (toxoides diftérico y tetánico), entre otras.
La industria farmacéutica ha elaborado vacunas polivalentes con cepas de referencia que usualmente
ocasionan procesos infecciosos en el humano. Por ejemplo, la Paspat (inyectable) y Luivac
(comprimidos) que contiene una mezcla de antígenos bacterianos de los gérmenes que con mayor
frecuencia son responsables de las infecciones de vías respiratorias altas y bajas.
Otras son más específicas y contienen sólo la parte antigénica de la bacteria, por ejemplo, la vacuna de
Haemophilus influenzae contiene un conjugado de oligosacáridos del antígeno capsular. Lo importante
es preparar una forma inocua del microorganismo infeccioso o de sus toxinas los cuales presentan los
antígenos responsables de establecer la inmunidad protectora, a la que llamamos vacuna.
PRINCIPIO
Las autovacunas o vacunas autógenas han sido utilizadas desde hace muchos años, su dificultad radica
en que la elaboración se hace de manera individual, lo que implica estudios adicionales, tiempo y costo
elevado. Sin embargo, el hecho de que la vacuna se elabore de las bacterias que están provocando el
proceso infeccioso nos da una garantía de efectividad.
Por lo anterior podemos decir que una autovacuna es un producto biológico elaborado con antígenos
procedente de un lisado de bacterias aisladas de la lesión del mismo paciente.
Para que se produzca una respuesta inmune efectiva deben ocurrir una serie de complejos procesos
celulares. Los tres elementos clave de la respuesta inmunológica son: las células presentadoras de
antígenos (CPA), los linfocitos T (Th0, Th1, Th2, Tc) y los linfocitos B. Las células CPA más importantes
son las células dendríticas, que se localizan en todos los órganos, pero son más abundantes en el
sistema linfoide. En los ganglios linfáticos se concentran en las áreas ricas en células T para facilitar su
activación. Otras células presentadoras de antígenos son los macrófagos y las células B. Cuando el
antígeno es captado por las células dendríticas circulantes, éstas emigran a los órganos linfáticos o al
bazo y después de procesarlo en el citoplasma, lo presentan a los linfocitos CD4, en la hendidura que
forman las dos cadenas de HLA (del inglés Human Leukocity Antigens) de clase II, el reconocimiento del
antígeno por el linfocito CD4 es totalmente específico, ya que las cadenas a y b del receptor del linfocito
T (receptores para antígeno RTC), posee una región variable similar a las inmunoglobulinas.
La respuesta inmune se realiza dentro del tejido linfoide periférico que incluye a los ganglios linfáticos,
bazo y tejido que recubre el tracto respiratorio, digestivo y genitourinario.
La autovacuna se aplica por vía intradérmica y es absorbida por el torrente linfático o circulatorio, estos
se mantienen en comunicación constante por medio de linfocitos que pasan de la sangre a los ganglios
linfáticos y vuelve a la sangre por las principales vías linfáticas como el conducto torácico, esto permite
que las células sensibles al antígeno se unan y establezcan en los sitios donde se produce la respuesta
inmune.
Por lo tanto su efecto se basa en la estimulación del sistema inmunológico, incrementando la actividad
fagocítica, la producción de inmunoglobulinas y la formación de linfocitos de memoria.
En las infecciones de vías respiratorias las vacunas estimulan la síntesis de anticuerpos secretados por
la mucosa del tracto respiratorio, elevando significativamente los niveles séricos de inmunoglobulina tipo
A (IgA).
CANDIDATOS PARA ELABORAR UNA AUTOVACUNA
Se utiliza principalmente en pacientes a quienes la terapia con antibióticos ha resultado inefectiva,
contraindicada o que presenten alta resistencia a los antibióticos, también como auxiliar en el
tratamiento de infecciones repetitivas de las vías respiratorias altas y bajas como: faringoamigdalitis,
136
sinusitis, rinitis, otitis y bronquitis, en infecciones de vías urinarias con recidivas causadas principalmente
por Escherichia coli y Staphylococcus saprophyticus, en infecciones de la piel (dermatitis por contacto,
psoriasis, entre otras) causadas por bacterias principalmente por Staphylococcus aureus coagulasa
positiva (infecta los folículos pilosos y glándulas sebáceas por la producción de lipasas), problemas de
acné que formen cicatriz queloide donde se aísla comúnmente Staphylococcus epidermidis. En
problemas gastrointestinales en que se aísla el género Salmonella principalmente.
3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1. MATERIAL
 Abatelenguas  Frasco vial de vidrio (ámbar o transparente)

 Hisopos  Frasco gotero
 Frascos (varios)  Tapa de butilo
 Portaobjetos,  Retapa de aluminio
 Cubreobjetos  Pipetas (de 1ml, 5ml)
 Aplicadores  Matraces (varios)
 Asa bacteriológica  Vasos de precipitados (varios)
 Tubos de ensaye de 13 x 100  Jeringas
 Cajas Petri  Mechero
 Nefelómetro de Mac Farland  Puente de coloración
3.2 REACTIVOS
 Equipo de Gram  Sensidiscos de antibióticos (Gram positivos

y Gram negativos)
 Peróxido de hidrógeno
 Sangre de carnero
 Reactivo de Erlich
 Rojo de metilo.
 α-naftol
 Solución salina (comercial)
 KOH
 Agar base sangre  Caldo de soya tripticasa

 Agar sal y manitol  Agar Biggy
 EMB  Medio de TSI
 PDA  LIA
 Agar Müller-Hinton  MIO
 Caldo V-P  Citrato
 Caldo urea
3.4 QUIPO
 Microscopio compuesto  Centrífuga

137
 Incubadora a 37°C  Engargoladora manual
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL. ELABORACIÓN DE LA VACUNA

Obtención de la cepa problema. Se aislará, identificará y seleccionará la cepa problema.
4.1 Tomar una muestra de exudado faríngeo o de orina (de preferencia se tomarán muestras de
personas enfermas) y sembrar por estría cruzada o extensión con varilla en los medios de cultivo
diferenciales y enriquecidos proporcionados e incubar 24 horas a 37°.
4.2 Seleccionar colonias sospechosas de un agente infeccioso y sembrar en dos tubos con AST.
4.3 Realiza las pruebas bioquímicas correspondientes para identificar el agente.
4.4 Una vez identificada y seleccionada la cepa (bacteria o levadura), sembrarla en 5 ml de caldo de
soya y tripticaseína e incuba a 37 ° C por 24 horas.
4.5.-Centrifugar a 300 rpm durante 5 minutos, desechar el sobrenadante y adicionarle 3 ml de solución
salina estéril para lavar, de esta manera estamos eliminado los residuos de medio de cultivo. Realizar
este procedimiento 2 veces.
4.6.- La suspensión bacteriana se filtra a través de una tela de acetato, para retener impurezas.
4.7.- Para la estandarización de la suspensión utilizar el tubo No. 1 del Nefelómetro de McFarland con
aproximadamente 300 millones de bacterias por mililitro
4.8.-Envasar dos frascos viales de vidrio transparente con tapón de butilo y retapa de aluminio.
4.9 Colocar 2 mililitros en cada frasco y etiquetarlo con (300 millones de bacterias por ml).
4.10.- Las vacunas se esterilizan en autoclave, a 121°C por 5 minutos, esta es una modificación del
método original en que se debe de efectuar el calentamiento en baño María a 60°C durante 60 minutos.
4.11.- Terminado el tratamiento térmico realizar la prueba de esterilidad, utilizando Caldo Tioglicolato,
Caldo Soya Tripticaseína y agar dextrosa saboraud en tubo inclinado.
4.12.- Tomar el frasco vial y desinfectar con una torunda que contenga alcohol, y con una jeringa estéril
retirar 0.5 ml.
4.13.- Colocar 0.2 ml en un tubo que contenga 3 ml de caldo de soya y tripticaseína, 0.2 ml en el tubo
con caldo tioglicolato y una gota pequeña en la placa de agar dextrosa saboraud para realizar estría
cruzada. Incubar a 37°C por 10 días los tubos y a 28 °C la placa.
4.14 Observar si hay presencia de crecimiento mediante la turbidez, para ello realizar revisiones diarias,
y si no se obtiene ningún crecimiento la vacuna puede ser aceptada para su aplicación.
APLICACIÓN
La aplicación de la auto vacuna tiene un protocolo establecido que puede variar de acuerdo a la
gravedad de la infección, edad del paciente y tipo de respuesta en la aplicación de la prueba, finalmente
los criterios de administración los hace el médico basándose en la valoración clínica del paciente. La
aplicación de las autovacunas debe ser supervisada y valorada únicamente por el médico tratante. El
formato de aplicación general de la autovacuna es el siguiente:
1.- Anota la morfología colonial y microscópica de la cepa seleccionada. Medio________________

Características coloniales:
138
Tamaño _____________________Bordes_________________
Color _______________________Elevación_______________
Luz transmitida________________Aspecto ________________
Luz reflejada__________________Consistencia _____________
2.- Anota la morfología microscópica
Forma_______________Agrupación ________________GRAM________________
Forma_______________Agrupación ________________GRAM________________
3.- Anota las pruebas bioquímicas realizadas
4.- Anota el o los nombres de los microorganismos aislados del exudado faríngeo.
Exudado faríngeo___________________________________________________________________
5.- Anota tus resultados de prueba de esterilidad
Caldo tioglicolato____________________________________
Caldo soya tripticaseina_______________________________
Agar sabouraud _____________________________________
5.1 ¿Qué es una vacuna autógena?
5.2 ¿Qué es un antígeno y cuales son sus características?
5.3 ¿Qué es un epítope?
5.4 ¿En qué consiste la respuesta inmune?
5.5 ¿Qué son las vacunas génicas?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
6.1 Discutir cada uno de los pasos que se realizaron en la elaboración de una vacuna.
6.2 Analizar las ventajas y desventajas de este tipo de vacunas
7. CONCLUSIONES.
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los objetivos de la práctica, los resultados y la
bibliografía consultada
8. BIBLIOGRAFIA.
8.1 Balcells Gorina A. 1995. La Clínica y el Laboratorio, interpretación de análisis y pruebas funcionales,
exploración de los síndromes, cuadro biológico de las enfermedades. Ediciones científicas y técnicas
S.A. 16Q Edición.
8.2 Blanco de la Mora E. 1997. Inmunidad y Vacunas. Infectología. Año 17. No. 3. Marzo.
8.3 Koneman W. E. 1992. Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas. Editorial Médica Panamericana. 3°
Edición. Págs. 11-13,150-152,395-397,413-415.
8.4 Lawrence A. K. and Amadeo J. P.1989. Clinical Chemestry, theory, analysis and correlation.
2Qedition. Pages 12-15.
139
8.5 Mac Faddin J. F. 1980. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. Editorial Médica Panamericana.
8.6 Regueiro J.R. y López LC. Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. Editorial Médica
Panamericana. 2Q Edición. Págs.100-104, 136-137.
8.7 Roitt I. 1994. Fundamentos de Inmunología. Editorial Médica Panamericana. 7Q Edición.
8.8 Rojas Espinosa. Inmunología (de memoria). Editorial Médica Panamericana. lQ Edición Págs.11-
13,181-182.
8.9 Programa de Actualización en Vacunas. Asociación Española de Pediatría, Programa de
actualización de vacunas
140
AGARES
1. AGAR BACTERIOLÓGICO
El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y
semisólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetración del
oxígeno en medios líquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l
2. AGAR NUTRITIVO
Fórmula en g/l de agua destilada:
Peptona de gelatina 5g
Extracto de carne de res 3g
Agar 15 g
pH final = 6,8  0,2
Método de preparación:
Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. Calentar
a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Determinar la funcionalidad del
medio de cultivo con microorganismos típicos.
3. AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR
Peptona de caseína 5g
Extracto de levadura 2.5 g
Glucosa 1g
Agar 15 g
pH final = 7,0  0,1
Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C durante 15
minutos, vaciar en placas estériles
4. AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fosfato dehidrogenado de amonio 1,0 g
Fosfato dipotásico 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Citrato de sodio 2,0 g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul bromotimol 0,06 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y
calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir volúmenes de 3 ml en tubos
de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar en posición inclinada de
manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear
también como medio en placas.
5. AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR
Mezcla de peptonas 20,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Dextrosa 1,0 g
141
Sulfato de amonio férrico 0,2 g

Rojo fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,3 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 118ºC
durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el
fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm.
6. AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina 10 g
Citrato férrico de amonio 0,5 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 13,5 g
pH final = 6,7  0,2
Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el punto de
ebullición para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y esterilizar a 121 °C
durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
7. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)
Digerido pancreático de gelatina 10,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,0 g
Agar 15,0 g
Lactosa 10,0 g
Eosina "Y" 0,4 g
Azul de metileno (Metiltionina) 0,065 g
Agua 1 000,0 ml
pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2
Disolver el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en el agua. Esterilizar, dejar
enfriar y antes de utilizar, agregar las siguientes soluciones a cada 100 ml de agar líquido: 5 ml de solución 1:5
de lactosa, 2 ml de solución 1:50 de eosina "Y" y 2 ml de solución 1:300 de azul de metileno. Mezclar.
8. AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)
Infusión de papa (sólidos) 4g
Dextrosa 20 g
Agar 15 g
pH final = 5,6  0,1
Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación frecuente
y hervir durante un minuto hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
9. AGAR LETHEEN MODIFICADO
142
Agar Letheen 32,0 g

Peptona de caseína 5,0 g
Peptona de carne 10,0 g
Extracto de levadura 2,0 g
Bisulfito de sodio 0,1 g
Agar 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2
Mezclar los componentes y calentar con agitación hasta la disolución completa del agar. Esterilizar en autoclave
a 121ºC durante 15 minutos.
10. AGAR MACCONKEY
Digerido pancreático de caseína 1,5 g
Digerido péptico de tejido animal 1,5 g
Lactosa 10,0 g
Mezcla de sales biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal Violeta 0,001 g
Agua 1 000,0 ml
Suspender el medio deshidratado en 1 000 ml de agua, remojar de 10 a 15 minutos y calentar a ebullición
agitando continuamente. Hervir durante un minuto, esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a
45-50ºC y vaciar en cajas Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se
deposite un exceso de humedad en la superficie del medio.
11. AGAR VOGEL JOHNSON
Manitol 10,0 g
Fosfato dibásico de potasio 5,0 g
Cloruro de litio 5,0 g
Glicina 10,0 g
Agar 16,0 g
Rojo de fenol 0,025 g
Agua 1 000,0 ml
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar, dejar remojar de 5 a 10 minutos. Calentar
agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15
minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50ºC y adicionar 20 ml de una solución estéril al 1 % de telurito de potasio.
Agitar vigorosamente y distribuir unos 20 ml en cajas de Petri.
12. AGAR DE SAL Y MANITOL
Digerido péptico de tejido animal 5,0 g
Extracto de carne 1,0 g
D-manitol 10,0 g
143
Agar 15,0 g
Agua 1 000,0 ml
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y remojar 15 minutos. Mezclar y calentar a ebullición
durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Distribuir porciones de 20 ml en cajas
Petri de 15x100 mm.
13. AGAR CETRIMIDA
Cloruro de magnesio 1,4 g
Sulfato de potasio 10,0 g
Agar 13,6 g
Cetil bromuro de trimetil amonio
(cetrimida) 0,3 g
Glicerol 10,0 ml
Agua 1 000,0 ml
Disolver en agua los componentes sólidos antes de adicionar el glicerol. Remojar unos 10 minutos. Calentar
agitando frecuentemente y hervir un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
14. AGAR EXTRACTO DE MALTA
Extracto de malta 30,0 g
Agar 20,0 g
Agua 1 000,0 ml
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, homogeneizar y remojar de 10 a 15 minutos, calentar
agitando frecuentemente, hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Si el
medio se sobrecalienta el agar perderá su capacidad de gelificarse. Enfriar de 47-50°C y ajustar el pH a 3,5 con
una solución de ácido tartárico al 10% estéril.
15. AGAR VERDE BRILLANTE.
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Agar 20,0 g
Verde brillante 0,125 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar remojar unos 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos, dejar enfriar a
45-50ºC y distribuir en cajas de Petri estériles.
16. AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (AGAR XLD)
Xilosa 3,5 g
L-Lisina 5,0 g
Lactosa 7,5 g
144
Sacarosa 7,5 g
Agar 13,5 g
Desoxicolato de sodio 2,5 g
Citrato de hierro y amonio 0,8 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,4 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar que se remoje de 10 a 15 minutos. Calentar con
todo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Transfiera al
baño de agua, dejar enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri. El medio debe ser transparente y color rojo rubí
anaranjado. El calentamiento excesivo o el mantener demasiado tiempo en baño de agua, puede ocasionar que
se formen precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamaño y presenten
reacciones menos nítidas. Sin embargo el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse
por filtración con papel filtro.
17. AGAR PSEUDOMONA F
Sulfato de magnesio 1,5 g
Hidrogenofosfato dipotásico 1,5 g
Agar-agar 12,0 g
Glicerina 10,0 ml
Agua 1 000,0 ml
Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15
minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas.
18. AGAR PSEUDOMONA P
Peptona de gelatina 20,0 g
Cloruro de magnesio 1,4 g
Sulfato potásico 10,0 g
Agar-agar 12,6 g
Glicerina 10,0 ml
Agua 1 000,0 ml
Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15
minutos a 121ºC. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas.
19. AGAR SULFITO Y BISMUTO
Extracto de carne 5,0 g
Dextrosa 5,0 g
Fosfato disódico 4,0 g
Sulfato ferroso 0,3 g
Indicador de sulfito de bismuto 8,0 g
Verde brillante 0,025 g
Agar 20,0 g
Agua 1 000,0 ml
145
pH final 7,5 ± 0,2

Suspender el polvo en un litro de agua, mezclar bien y remojar el medio deshidratado de 10 a 15 minutos para
obtener un buen gel. Hervir no más de un minuto agitando continuamente para que se disuelva completamente
el agar.
Dejar que el medio se enfríe a 45ºC y sin dejar de agitarlo vacíe en cajas de Petri no menos de 20 ml de medio
fluido. Las placas deben permanecer parcialmente descubiertas hasta que se seque la superficie del medio y
usarlos el mismo día. Evite el sobrecalentamiento.
20. MEDIO INDOL NITRITO
(Medio de tripcaseína y nitrato)
Dextrosa 1,0 g
Nitrato de potasio 1,0 g
Agar 1,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,2 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Agregar 2 g de agar en el caso de hacerse movilidad y
detección de gas. Calentar agitando continuamente y hervir durante más o menos un minuto hasta disolución
total del medio. Envasar en tubos de ensayo hasta la mitad de su altura y esterilizar en autoclave durante 15
minutos. Si se prepara el medio semisólido, dejar que se solidifiquen los tubos en posición vertical.
21. AGAR LISINA HIERRO
Dextrosa 1,0 g
L-lisina 10,0 g
Citrato férrico-amónico 0,5 g
Trisulfato de sodio (anhidro) 0,04 g
Agar 15,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,7 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes agitando con
frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Distribuir en porciones de 4 ml en tubos con
tapón de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición
inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de
agua por evaporación.
22. AGAR DNA AZUL TOLUIDINA
Acido desoxirribonucleico (DNA) 0,3 g
Agar 10,0 g
Cloruro de calcio (anhidro) 0,0011 g
Azul O toluidina 0,083 g
Tris (hidroximetil) aminometano 6,1 g
Agua 1 000,0 ml
Disolver el Tris (hidroximetil) aminometano en un litro de agua. Ajustar el pH a 9,0, adicionar los demás
ingredientes excepto el azul O toluidina y calentar a ebullición para su disolución. Añadir al medio el color azul O
toluidina. Distribuir en cajas Petri o portaobjetos.
146
23. AGAR COLUMBIA

Digerido pancreático de caseía 10.0 g
Digerido péptico de carne 5.0 g
Digerido pancreático de corazón 3.0 g
Almidón de maíz 1.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Agar 10-15 g
Agua purificada 1 000 mL
Suspender 42.5 g de medio en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante
un minuto para disolver.Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos, enfriar a 45°-50°C; agregar sulfato de
gentamincina que corresponda a 20mg de gentamicina base y verter en cajas Petri estériles.
24. AGAR YEMA DE HUEVO

Digerido pancreático de caseía 40.0 g
Glucosa 2.0 g
Fosfato dibásico de sodio 5.0 g
Sulfato de magnesio 0.01 g
Agar 10-15 g
Disolver 74 g en un litro de agua. Llevar a ebullición, agitando hasta su total homogenización. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos. Enfriar a 45°-50°C y añadir 50 mL de emulsión de yema de huevo, mezclar y verter en cajas
Petri estériles.
147
CALDOS
1. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta
disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
2. CALDO NUTRITIVO
pH final = 6,9  0,2
Suspender el almidón en 100 ml de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 ml de agua destilada
con calentamiento y agitación continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 °C por 15 minutos en
autoclave.
3. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO
Formula en g/l de agua destilada:
Extracto de levadura 1g
Sulfato de amonio 2g
Fosfato monopotásico 0,4 g
Cloruro de sodio 2g
Malonato de sodio 3g
Dextrosa 0,25 g
Azul de bromotimol 0,025 g
pH final = 6,7  0,2
Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar en
autoclave a 121° C durante 15 minutos.
4. CALDO DE INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN
Infusión de cerebro de ternera 200 g
Infusión de corazón de res 250 g
Peptona de gelatina 10 g
Cloruro de sodio 5g
Dextrosa 2g
pH final = 7,4  0,2
Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para disolverlo.
Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe utilizarse el
mismo día de su preparación.
5. CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA
148
Peptona de caseína 10 g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 5g
pH final = 7,4  0,2
Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su ebullición y
completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15 minutos.
6. CALDO UREA
Urea20 g
pH final = 6,8  0,2
Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Distribuir en cantidades de 0,1 a 1 ml en
tubo estériles. En lugar de esterilizarse por filtración puede esterilizarse en autoclave a 108 °C de 7 a 10
minutos.
7. CALDO NITRATO
Nitrato de potasio 1g
pH final = 7,0  0,2
Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolución total.
Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
8. CALDO KCN
MEDIO BÁSICO
Peptona 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de potasio monobásico (KH2 PO4) 0,225 g
Fosfato dibásico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g
pH final = 7,6  0,2
Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es necesario hasta su
disolución. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapón de rosca y esterilizar a 121 °C durante 15
minutos.
CIANURO DE POTASIO
Preparar un tubo con tapón de rosca, estéril
KCN 0.5 g
No absorber la solución de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El cianuro es
sumamente venenoso y puede causar la muerte.
149
A los 5 ml del medio básico frió agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y mezclar bien.
9. CALDO LETHEEN MODIFICADO
Caldo Letheen 26,7 g
Bisulfito de sodio 0,1 g
Agua 1 000,0 ml
pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2
Mezclar los componentes hasta la disolución completa y distribuir 95 ml en botellas con tapón de rosca para
dilución. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
10. BASE DE CALDO TETRATIONATO
Mezcla de sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,0 ± 0,1
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Mezclar bien y calentar a ebullición. Dejar enfriar y
envasar en tubos de ensayo estériles, en volúmenes de 10 ml cada uno.
Guardar en refrigeración. No esterilizar en autoclave. Momentos antes de usarlo agregar 0,2 ml (de 3 a 4 gotas)
de la solución yodo-yoduro de potasio (6.3.1.7) a cada tubo. Usar el medio el mismo día en que se le agrega la
solución de yodo.
11. CALDO DEXTROSA SABOURAUD
Polipeptona o neopeptona 10,0 g
Dextrosa 40,0 g
Agua 1 000,0 ml
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien hasta obtener
una suspensión uniforme. Calentar agitando frecuentemente durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121ºC
durante 15 minutos. No sobrecalentar, ya que por su alto contenido en carbohidratos se obscurece y pierde
eficacia.
12. CALDO INFUSIÓN DE CEREBRO CORAZÓN
Infusión de cerebro de ternera 200,0 g
Infusión de corazón de res 250,0 g
Dextrosa 2,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,4 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y calentar ligeramente si es necesario. Se puede agregar
0,1% de agar si se desea. Envasar y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
150
13. CALDO CISTINA SELENITO

Lactosa 4,0 g
Fosfato de sodio 10,0 g
Selenito ácido de sodio 4,0 g
Cistina 0,01 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,0 ± 0,2
Suspender 23 g del polvo en un litro de agua desionizada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta que el
medio se disuelva. Envasar en tubos de ensaye, preferiblemente con tapas de rosca, volúmenes entre 10 y 15
ml por tubo. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos. No en autoclave. No sobrecalentar. El medio así
preparado y herméticamente tapado, puede conservarse en buenas condiciones, hasta 3 meses en
refrigeración.
14. MEDIO ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta
disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos
15. CALDO UREA
Urea 20,0 g
Fosfato de sodio 9,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,8 ± 0,2
Disolver 38,61 g en 1 000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60ºC como máximo. Esterilizar por
filtración o tras distribución a razón de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de vapor durante
5 minutos. No esterilizar en autoclave.
16. CALDO DE LISINA Y DESCARBOXILASA
Dextrosa 1,0 g
L-Lisina 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,8 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de
rosca. La tapa debe de estar algo floja para permitir un buen intercambio de gases. Apretarla bien al terminar la
esterilización. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
151
17. RAPPAPORT VASSILIADIS PARA ENRIQUECIMIENTO DE Salmonella

Peptona de soya 10.0 g
Cloruro de magnesio hexahidratado 10.0 g
Fosfato dibásico de potasio 0.4 g
Fosfato monobásico de potasio 0.6 g
Verde de malaquita 0.036g
Suspender 42.5 g de polvo en un litro de agua purificada. Reposar durante 5 minutos y mezclar uniformemente.
Calentar hasta disolución total, distribuir en recipientes y esterilizar a 115°C durante 15 minutos.El pH debe ser de
5.2 ± 0.2 a 25°C después de calentar y esterilizar.
18. MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO PARA CLOSTRIDIOS

Extracto de carne 10.0 g
Peptona 10.0 g
Almidón soluble 1.0 g
Glucosa monohidratada 5.0 g
Clorhidrato de cisteína 0.5 g
Acetato de sodio 3.0 g
Agar 0.5 g
Hidratar el agar, disolver calentando a ebullición con agitación continua. En caso necesario, ajustar el pH de modo
que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar en autoclave usando ciclos validados
calificados
19. CALDO MOSSEL

Digerido pancreático de gelatina 10.0 g
Glucosa monohidratada 5.0 g
Bilis de buey deshidratada 20.0 g
Fosfato dibásico de potasio 8.0 g
Fosfato monobásico de potasio 2.0 g
Verde de brillante 15 mg
Suspender 45 g del medio deshidratado en un litro agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir
durante 1-2 minutos para disolver completamente los ingredientes. Se recomienda dejar 30 minutos en baño de
agua o vapor a 100º C ya que el medio no se puede esterilizar en autoclave. Distribuir y enfriar a temperatura
ambiente antes de su utilización. Como el medio no es estéril debe utilizarse el mismo día de su preparación.
20. CALDO TIOGLICOLATO
Digerido pancreático de caseína 17.0 g
Digerido papaínico de la soya 3.0 g
Dextrosa 6.0 g
Tioglicolato de sodio 0.5 g
Agar 0.7 g
Sulfito de sodio 0.1 g
Suspender 30 g de polvo en un litro de agua purificada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar frecuentemente y llevar
a ebullición hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
152
21. CALDO LECHE HIERRO

Leche descremada 25.0 g
Caldo nutritivo 8.0 g
Disolver los componentes por separado, posteriormente mezclar, distribuir en recipientes, adicionar un
clavo y esterilizar a 118°C durante 12 minutos.
153
. MEDIOS SEMISÓLIDOS
1. MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)
Medio SIM
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Agar 3,5 g
Agua 1000,0 ml
pH final 7,3 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10 minutos y
hervir a ebullición durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4 cm y esterilizar en
autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
2. MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON
Peptona Caseína 2,0 g
Azul bromotimol 0,03 g
Agar 2,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,1 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con
frecuencia, hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración (o del
azúcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido, mezclar y distribuir asépticamente 5 ml en tubos de 13 x
100 mm. Esterilizar en autoclave a 118°C durante 10 minutos a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio
tiene un color verde.
3. MEDIO INDOL ORNITINA (MIO)
Peptona 10,0 g
Triptona 10,0 g
L-ornitina 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 2,0 g
Bromocresol púrpura 0,02 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,5 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullición. Distribuir
porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
4. GELATINA NUTRITIVA
Gelatina 120 g
pH final = 6,8  0,2
Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir en tubos.
Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
154
SOLUCIONES Y REACTIVOS
1. Aceite mineral
Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
2. Solución de rojo de metilo
Formula:
Rojo de metilo 0.1 g
Alcohol etílico 300 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas
de la solución a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta
como prueba Negativa.
3. Solución de ácido tartárico al 10% p/v
Formula:
Acido tartárico 10,0 g
Agua c.b.p. 100,0 ml
Disolver el ácido tartárico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana
4. Solución de -Naftil amina
Fórmula:
Dimetil alfa naftil amina 5,0 g
Ácido acético 5 N1,0
5. Solución de hidróxido de potasio al 40 %
Fórmula:
Hidróxido de potasio 40 g
Agua destilada100 ml
6. Solución de alfa naftol
Fórmula:
Alfa naftol 5g
Etanol100 ml
7. Reactivo de Griess-Ilosvays
Solución A
Acido sulfanílico 8,0 g
Acido acético 5N 1 000,0 ml
El ácido acético 5N se prepara agregándole un volumen de ácido acético glacial a 2,5 volúmenes de agua.
Mezcle bien, añada luego el ácido sulfanílico y vuelva a mezclar.
Solución B
Alfa naftilamina 8,0 g
Acido acético 5N 1 000,0 ml
Mezclar y almacenar en refrigeración (4ºC) cuando no esté en uso. Generalmente ambos reactivos son estables
aproximadamente durante 3 meses.
8) Reactivo de Kovacs y Ehrlich
Para-dimetil-amino-benzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico o butílico 75,0 ml
Acido clorhídrico (37%) QP 25,0 ml
155
Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un baño de

agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado.
9) Reactivo de O'Meora
Hidróxido de potasio 40,0 g
Agua 100,0 ml
Disolver y enfriar. Añadir 0,3 g de creatinina (monohidrato) La solución reactiva, lista para el uso, puede
conservarse en refrigeración (4ºC) durante 4 semanas aproximadamente.
10) Prueba de Vogues Proskauer
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.
Formula:
Alfa naftol 5g
Alcohol etílico absoluto 100 ml
Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.
11) Reacción de Indol (reactivo de Kovac)
Formula:
P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico.o alcohol isoamílico 750 ml
Acido clorhídrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, gota a
gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo
al café claro. Se debe conservar a 4 ºC.
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente
hasta completa disolución. Enfriar a 60 ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.
12) Solución de ácido sulfanilico
Formula:
Ácido sulfanílico 8,0 g
Ácido acético 5N
(Una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua)1,0 L
13) Solución de agua oxigenada 1:10
Preparación:
Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.
14) Solución de telurito de potasio al 1% p/v
Telurito de potasio 1,0 g
Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana.
15) Solución de tween 80%
Tween 80% sin diluir
Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
16) Solución salina al 0,85%
Agua c.b.p. 1 000,0 ml
156
Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1 000 ml, ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 filtrar, envasar y
esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
17) Solución de etanol 80% y HCl al 1% v/v
Etanol 80,0 ml
HCl 1,0 ml
Mezclar el etanol y el HCl, aforar a 100 ml con agua y envasar.
18) Solución de yodo-yoduro de potasio p/v
Yodo 6,0 g
Yoduro de potasio 5,0 g
Agua 20,0 ml
Disolver el yoduro de potasio en el agua y en esta solución disolver el yodo. Conservar en envases protegidos
de la luz.
19) Solución de agua oxigenada al 3% v/v
Peróxido de Hidrógeno 3,0 ml
Mezclar el peróxido en agua, aforar a 100 ml y envasar.
20) Solución indicadora rojo de metilo
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol al 95% 300,0 ml
Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml.
21) Solución yodo-yodurada
Yoduro de potasio 2,0 g
Yodo 1,0 g
Agua 100,0 ml
Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se disuelva el yodo,
agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz.
22) Solución safranina

Safranina "O" 2,5 g
Alcohol etílico al 95% 100,0 ml
Disolver la safranina "O" en el alcohol etílico.Tomar 10 ml de esta solución y llevar a 100 ml con agua. Agitar.
23) Solución alcohol-acetona
Partes iguales de acetona y alcohol etílico al 95%.
24) Reactivo de Ehrlich
Fórmula:
Para-dimetil amino benzaldehído2 g
Alcohol etílico absoluto 190 ml
Ácido clorhídrico concentrado 40 ml
157
COLORANTES, DECOLORANTES Y MORDENTE

1) Cristal violeta
Formulación en g/100 ml:
Cristal violeta 2
Agua destilada 80
Etanol al 95% 20
Oxalato de amonio 0,8
Preparación:
Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de amonio en 80
ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.
2) Yodo (lugol)
Yoduro de potasio 2
Yodo 1
Agua destilada 100
Preparación:
Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metálico y disolver.
Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar.
3) Alcohol cetona
Acetona 50
Alcohol etílico 100
Preparación:
Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco herméticamente
cerrado, hasta su uso.
4) Safranina
Agua destilada 100
Safranina 0,5
Preparación:
Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua destilada.
5) Fucsina fenicada
Formulación:
Solución A
Fucsina básica 0,3
Alcohol etílico al 95% 10
Mezclar hasta disolución completa
Solución B
Cristales de fenol 5
Agua destilada 95
Preparación:
Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la solución en
un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.
6)Azul de metileno
Formulación:
Azul de Metileno 1g
Preparación:
Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.
7)Verde de malaquita
158
Formulación:
Verde de malaquita 10 g
Preparación:
Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante en frasco
ámbar.
159
ESTÁNDARES NEFELOMÉTRICOS DE McFARLAND
1.- Preparación de estándares: Sulfato de bario

Reactivos:
BaCl2, solución acuosa al 1 %
H2SO4 QP al 1 %
BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl
2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamaño, mismos diámetro, limpios y enjuagados con agua
destilada.
3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a
continuación:
Estándares de sulfato de bario
Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad aprox. De 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
8
células (X 10 /ml)
Densidad aprox. de 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
células en millones /ml
4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células homogéneas de
E. coli por ml.
Precauciones:
Si el caldo de cultivo es claro, o si es coloreado.
160

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Laboratorio de Microbiología farmacéutica UPIBI-IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA

Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ

Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ

NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________

PROFESOR DE TEORÍA: ___________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________

PERIODO LECTIVO: _____________________________________________

Instrucciones generales ______________________________________________________________3

Practica No. 1 Tinciones y uso del microscopio____________________________________________7

Práctica No. 2 Métodos de esterilización y controles _______________________________________19

Práctica No. 3 Preparación de medios y cultivo de microorganismos___________________________ 26

Práctica No. 4 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios___________________________43

Práctica No. 5 Conservación de microorganismos _________________________________________49

Práctica No. 6 Determinación de organismos coliformes, mesofílicos aerobios, mohos y levaduras en

superficies vivas e inertes ____________________________________________________________ 61

Práctica No. 7 Aislamiento e identificación de patógenos en productos farmacéuticos y cosméticos___70

Práctica No. 8 Pruebas para identificar bacterias (PARTE I) _________________________________ 85

Practica No. 9 Cinética de crecimiento _________________________________________________ 118

Practica No. 10 Resistencia microbiana ________________________________________________ 126

Practica No. 11 Autovacunas_________________________________________________________135

Caldos __________________________________________________________________________ 148

Medios semisólidos ________________________________________________________________ 154

Soluciones, reactivos y colorantes _____________________________________________________155

Nefelómetro de McFarland___________________________________________________________ 160

II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

2.- Por equipo deberá traer:

Un rollo de Masking tape Una regla graduada

3.- Por sección:

Un candado con llave Una caja de cubreobjetos

5.- Por grupo deberá traer.

Un rollo de gasa hospitalaria Una caja de guantes de látex

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

Tabla 1. Correspondencia entre

5 portaobjetos Lámpara de alcohol o mechero

3.4 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

Colores Muestra de agua estancada

a)Tomar la preparación fija de Saccharomyces cerevisiae y colocarla el colorante según el siguiente

4.4.1 Tinción de Gram:

cerevisiae, en el puente de coloración.

4.6 Tinción de Gram aplicada a una suspensión de microorganismos:

a)Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

4.7 Tinción de Ziehl-Neelsen.

a)Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración

Diferentes tipos de posición de las esporas

III.- Observación microscópica

de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)

IV.- Observación de una muestra en fresco

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Método de la tira de papel

Autoclave a 121°C  Incubadora a 35°C

Tres matraces de 125 ml con 50 ml de Escherichia coli (suspensión turbia)

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

b)Enjuagar suficientemente con agua de la llave

4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO