PRACTICA Nº 4

ENZIMAS

I. OBJETIVOS

1. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

2. Evaluar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática

3. Estudiar la influencia de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

II. MARCO TEORICO

Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químicas de los organismos vivos,
incrementando la velocidad de estas hasta alcanzar su punto de equilibrio.

En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción,
aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los
correspondientes substratos, en tanto que la enzima permanece inalterable.

La actividad enzimática usualmente es expresada por:

a) La desaparición del sustrato (P)

b) La aparición del producto (P)

c) La modificación de los cofactores

 La velocidad de una reacción enzimática, como la velocidad de cualquier reacción en
general, puede ser determinada midiendo la cantidad de sustrato transformado en un
determinado tiempo de reacción, generalmente un minuto. También puede ser medida
determinando la cantidad de productos formados, cualquiera de ellos, basta con uno sólo, lo
que nos permite deducir que cantidad de sustrato ha formado cierta cantidad de producto.

Diversos factores modifican la actividad enzimática:

a) El pH del medio

b) La concentración de la enzima

c) La temperatura de la reacción

d) La concentración del sustrato

e) La fuerza iónica ambiental

f) El tiempo de reacción

g) El efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica se estudiará algunas de las propiedades de las reacciones enzimáticas.

Para ello utilizaremos como modelo experimental, la acción hidrolítica de la pepsina sobre la
proteína albumina de huevo.

La ovoalbúmina es una proteína globular presente en altas concentraciones en la clara de

huevo, apareciendo en el huevo fresco como una solución viscosa y ligeramente opalescente.
Esta proteína en su estado natural tiene las dimensiones de 13 mµ, y está constituida de 584
residuos de aminoácidos dispuestos en una sola cadena polipeptídica, con un PM de 64500 y
un pI de 4.6. Esta es la proteína que será utilizada como sustrato de la pepsina, previa
desnaturalización. La desnaturalización de la albumina se logra hirviendo el huevo por algunos
minutos; entonces, se extrae la clara, se la licua con agua destilada, finalmente, esta solución es
filtrada. Se obtiene así, una solución no viscosa pero turbia, a la cual tiene que observar
cuidadosamente antes y después de añadirle pepsina.
 Recuerde Ud. que la pepsina es una enzima proteolítica secretada por las células principales
del estómago al estado de “zimógeno” o “proenzima” (pepsinógeno). Su activación requiere de
un pH muy ácido e implica la remoción de un péptido bloqueador de su extremo amino
terminal.

La enzima así activada, digiere a las proteínas hidrolizando los enlaces peptídicos situados
hacia el lado amino de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptófano, además de aspartato,
glutamato y leucina , mientras que no actúa si el aminoácido anterior es prolina.

En las células somáticas normales, las actividades catalíticas de las numerosas enzimas se
mantienen muy constantes, ya que existe un equilibrio entre la síntesis y la degradación
enzimática, pero constantemente llegan al espacio extracelular pequeñísimas cantidades de
muchas enzimas intracelulares. En muchas enfermedades orgánicas está aumentada la salida de
enzimas desde el interior celular, esto puede deberse por un aumento de la permeabilidad de las
membranas celulares, o bien por disolución de la estructura celular. De esta manera se originan
modificaciones del nivel enzimático en el plasma sanguíneo, de indudable valor que ayudan a
realizar un diagnóstico.

III. PARTE EXPERIMENTAL

A) Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática

Procedimiento:
1. Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

(los valores se encuentran en ml)

1 2 3 4 5
 Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HC1 1.0 N 2.0 0.5 0.0 0.0 0.0

Na2CO3 10% 0.0 0.0 0.0 0.5 2.0

Agua destilada 0.0 1.5 2.0 1.5 0.0

2. En otros 5 tubos de prueba pequeños, medir 0.3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 10 tubos en baño maría a 37° C por 5 minutos

4. Agregar rápidamente a cada uno de los 5 primeros tubos, los 0.3 ml de la solución de pepsina
preincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a 37° C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada
tubo antes y después de agregar la enzima.

6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al
final de 1,5 y 10 minutos.

1 2 3 4 5

pH estimado

1 minuto

Aclaramiento 5 minutos

10 minutos

7. Haga el cálculo teórico del pH de los tubos 1 y 2 y compruebe con papel indicador el pH de
todos los tubos.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática
2. El pH óptimo de la pepsina es …………..………………………………………….......

Interrogantes:

1. ¿Por qué se debe cocer un huevo antes de comerlo?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
2. ¿Por qué ocurre aclaramiento de la solución sustrato de ovoalbúmina cuando se le añade
pepsina?

_____________________________________________________________________

3. ¿Por qué el pH afecto la actividad de las enzimas?

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

B) Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática

Procedimiento

1. Para determinar la temperatura óptima para la actividad de la pepsina se debe preparar:

4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: (los valores se encuentran en ml)

 1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada 1.5 1.5 1.5 1.5

2. En otros 4 tubos de prueba pequeños, medir 0.3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 8 tubos por 5 minutos a las siguientes temperaturas

Tubo 1 2 3 4

Temperatura Baño
0°C T. amb. 37°C
hirviente

4. Agregar rápidamente a cada uno de los 4 primeros tubos, los 0.3 ml de la solución de
pepsina preincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a la temperatura correspondiente por 10 minutos.

Observar cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.

6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos.

Resultados:

3. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática. Señale la Temperatura óptima
de la Pepsina _______________________
Interrogantes:

1. ¿Cómo explicaría ud. el resultado obtenido en el último tubo?

_____________________________________________________________________
2. ¿Qué es temperatura óptima?
______________________________________________________________________

C) Efecto de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Procedimiento

7. Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: (los valores se encuentran en ml)

1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada 1.5 3.5 4.2 4.2

Preincubar los 4 sistemas a 37°C y luego añadir:

1 2 3 4

Pepsina 1% preincubada 3.0 1.0 0.3 0.0

 Pepsina 1 % hervida 0.0 0.0 0.0 0.3

1. Mezclar bien y continuar la incubación a 37°C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada
tubo antes y después de agregar la enzima.

2. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al
final de 1,5 y 10 minutos.

1 2 3 4

1 minuto

Aclaramiento 5 minutos

10 minutos

3. Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas la [E] y en el eje de ordenadas la actividad enzimática.
Interrogantes:

1. ¿Qué ocurriría si se sigue aumentando la [E] sin modificar la [S]?

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_____________________________________________________________________
2. ¿En el laboratorio clínico, qué requisitos son fundamentales para la determinación de la
actividad enzimática en líquidos biológicos con fines diagnósticos?
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3. Menciones 5 fármacos que actúan inhibiendo a las enzimas