El factor de iniciación 

de la traducción eucariótica 4E en la disponibilidad de los controles del

cambio entre  La Cap-dependiente y la  entrada  interna ribosomal del sitio mediante la traducción.

La traducción de  de m7G en la nivelación celular de RNA se inicia por el reclutamiento de los ribosomas en el extremo de
5 de RNA a través de  factor de iniciación de la traducción eucariótica 4F (eIF4F), un complejo heterotrimerico formado
por una tapa en la subunidad  de unión (eIF4E) y una helicasa  RNA (eIF4A) salvado por una molécula de
andamios (eIF4G). La traducción interna en la iniciación pasa por alto el requisito de la tapa y eIF4E y se produce en los
RNAm  virales y celulares que contienen sitios internos de entrada ribosomal (IRES). Aquí nos demuestran que la
disponibilidad de eIF4E desempeña un papel fundamental en el pasar de la tapa que dependen de IRES medida por la
traducción en las células infectadas por picornavirus. Cuando ambos nivelados e IRES contienen RNAm están
presentes (como en las células intactas o en los extractos de traducción in vitro), una disminución en la cantidad
de eIF4E asociada con el complejo eIF4F provoca un aumento notable en IRES medida en el RNAm viral de
traducción. Este efecto no se observa en los extractos de traducción de RNA de cubiertas empobrecidas, lo que indica que
cubiertas de RNA  compiten con IRES que contienen RNAm para la traducción. Estos datos explican numerosos informes
de observaciones en las que RNA virales son preferentemente traducidos durante la infección.

La contratación de los ribosomas a RNAm es el paso limitante en la iniciación de la traducción y un objetivo frecuente de la
traducción de control (22). Dos mecanismos diferentes de unión al ribosoma existente en las células de los mamíferos. La
Cap-dependiente de la traducción está medida por el RNAm 5` de estructura de cap (m7GpppN, donde N es cualquier
nucleótidos), y representa el modo estándar de la traducción utilizada por la mayoría de los RNAm celulares. La Cap-
independiente de traducción es utilizada por algunos virus RNA de cadena más, como los picornavirus y virus de hepatitis
C, así como por algunas células de RNA, e implica la unión de los ribosomas a un RNAm de elemento estructural
denominado un sitio interno de entrada ribosomal (IRES) (20, 41).

Los factor de iniciación de la traducción de eucariotas (4F eIF4F) es un medidor de la subunidad ribosomal 40S enlazada al
final 5` del tope de RNAm. EIF4F es un complejo que contiene tres proteínas: eIF4E, la tapa de unión a la subunidad;
eIF4A, una ATPasa dependiente de RNA / ATP-dependiente del RNA helicasa, y eIF4G, un alto peso molecular de la
proteína que actúa como un andamio para la unión y eIF4E eIF4A. Además, eIF4G interactúa con el factor de unión de
ribosoma 40S eIF3 y el poli (A) de unión a proteína, con lo que establecen un vínculo fundamental entre el RNAm y el
ribosoma (Revisado en las referencias 14, 21 y 22). El eIF4F varios subunidades se expresan a niveles muy diferentes en la
mayoría de los tipos de células, la subunidad eIF4E es el menos abundante (22). Es importante destacar que la formación
del complejo eIF4F es dinámica y estrechamente regulado (44). En particular, la disponibilidad, de eIF4E para la
participación en la formación de eIF4F es modulada por una familia pequeña de las moléculas del represor de traducción,
las proteínas de unión eIF4E
(4E-BPs) (31, 38). Mientras la hipofosforilada 4E-BPs interactúa fuertemente con eIF4E, la hiperfosforilada 4E-BPs no (15).
Los niveles de fosforilación de 4E-BP son modulados por muchos tipos de estímulos extracelulares. En particular, la
estimulación, hormonales o nutricionales tiende a aumentar los niveles de fosforilación de 4E-BP1, mientras el estrés
ambiental o nutricional provoca la desfosforilación de 4E-BP (15, 43). Así, un subcomplejo binario que consta de eIF4G y
eIF4A (eIF4G/4A) parece existir en un equilibrio dinámico con eIF4F. Este equilibrio se puede desplazar para aumentar o
disminuir la formación de eIF4F en respuesta a los nutrientes, hormonas de la estimulación, o el estrés (43).

La iniciación de la traducción interna en la mayoría de IRES-que contiene RNA, tales como el virus de la
encefalomiocarditis (EMCV) RNAm, requiere los mismos Fs canónicos que se requieren para la traducción de las cubiertas
de RNA, a excepción de eIF4E (1, 39, 40). En contraste con el típico eIF4E medida en el reclutamiento ribosómico, el paso
inicial en la contratación de los ribosomas a la EMCV IRES es la eIF4A dependiente de alta afinidad de unión de la central
de dominio de eIF4G al vástago- bucle JK del IRES (27, 32). La posterior adición de la subunidad ribosomal, 40S es de
suponer a través de la interacción de eIF4G-eIF3-40S, y la subunidad 60S completa el montaje del complejo de iniciación.

EMCV y otras infecciones por picornavirus se acompañan por un cierre de la síntesis de proteínas de la célula huésped
(10). En las células infectadas por el poliovirus (PV), el rinovirus humano, y la enfermedad del virus de la fiebre aftosa, el
principal responsable de este evento de cierre es la escisión de las isoformas eIF4G por virus-proteasas específicas (11,
47). El fragmento de escisión C-terminal de eIF4G eficientemente apoya al IRES-dependiente, pero a cap-dependen de la
traducción, ya que conserva los sitios de unión para IRES, eIF4A y eIF3, pero no puede enlazar a eIF4E. Esta situación es
similar a un aumento neto de eIF4G/4A a expensas del complejo eIF4F. Mientras que infección de las células con EMCV
también inhibe la proteína de la síntesis de la célula huésped, esta inhibición se desarrolla más lentamente que el causado 
por PV y no está medido por la escisión de eIF4G (25, 35). 

Aunque eIF4G no se escinde en las células infectadas EMCV, es  altamente probable que la relación de eIF4G/4A a eIF4F
también se incremente  durante la infección EMCV. Hemos descrito previamente la desfosforilación y activación de 4E-BP1
siguiente a la infección de EMCV  (16). En la medida en que la desfosforilación de 4E-BP1 coincide con el cierre de la
traducción del RNAm en el anfitrión de las células infectadas de EMCV, nosotros hipotetizamos de que estos dos eventos
están causalmente relacionados (16). Disociar eIF4F también pueden favorecer la síntesis de proteínas virales, tal como se
sugiere por medio de experimentos que emplean rapamicina y wortmanina, dos inhibidores de la fosforilación de 4E-BP1 
(5, 51). La desfosforilación forzada de 4E-BPs por tratamiento de las células con rapamicina y wortmanina al comienzo 
de la infección de EMCV, la síntesis de proteínas virales y los títulos virales fueron mayor que en las células de control no
tratados (5, 51). Sin embargo, debido a la rapamicina y a la wortmanina también tienen otros objetivos celulares 
(15) y porque estos estudios in vivo eran simplemente correlativos, era fundamental para evaluar directamente la función de
eIF4F en la traducción de RNAm EMCV. Recientemente fuimos capaces de reconstituir la traducción EMCV 
y la replicación en el extracto de las células de Krebs-2 (55). Este sistema nos ha permitido  hacer frente a la importancia de
la composición de la subunidad de eIF4F en la síntesis de proteínas y la replicación viral. Aquí nos informa 
que cuando RNAm EMCV se traduce en competencia con RNAm celular (es decir, en los extractos que no son tratados con 
nucleasa), además de 4E-BP aumenta significativamente la síntesis de proteína viral. En contraste, la adición de eIF4E
dramáticamente inhibe la síntesis de proteínas virales. Además, cuando se convierte eIF4F a la subcomplejo de eIF4G/4A
por la caída de eIF4E, al inicio de la síntesis de proteínas virales en las células infectadas  de EMCV o PV está
marcadamente acelerada y el rendimiento viral es mayor. Estos hallazgos demuestran que las funciones activas eIF4E
como un negativo modulador de IRES medida por la traducción por la creciente competencia a partir de las cubiertas
RNAm para el complejo de eIF4F. 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Materiales. RNAm que codifica la luciferasa fueron transcritas de pT3luc (A)+ y pT7EMCVluc (A)+ utilizando la polimerasa de
T3 o T7 RNA respectivamente (52). El RNAm EMCV se aisló a partir de virus purificado por extracción con una mezcla de 
fenol y cloroformo (51). Total de poli (A)-RNA que contiene [poli (A)+ RNAm] Se aisló el citoplasma de Krebs-2 células y se
purificó mediante dos ciclos de cromatografía en oligo (dT)-celulosa (3, 49). La  globina de RNAm fue comprada 
en el comercio (Gibco Invitrogen Corporación [continuado]). Los componentes utilizados para preparar los extractos de
células y Krebs-2 para complementar las reacciones de traducción fueron especificados anteriormente (56). El
recombinante glutatión S-transferasa (GST)-4E-BP1, GST-4E-BP1? 4E (4E-BP1? 54-63), GST-4E-BP2, GST-eIF4E, 
GST-eIF4EW73A, eIF4E, eIF4A y eIF4G CT-que se han descrito anteriormente (12, 13, 33, 52-54). La expresión de
proteínas se llevó a cabo en E. coli BL21 (DE3) las células de acuerdo a las instrucciones del fabricante (GE
Healthcare). Para evaluar la pureza, las proteínas se analizaron por dodecilsulfato sódico-gel de
poliacrilamida electroforesis (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie. 2Apro era una especie de regalo de H.-D. Liebig
(52). El anticuerpo monoclonal 8D10 de ratón contra el virus recombinante  de Mengo proteínas 3Dpol (8) fue proporcionado
amablemente por Ann Palmenberg (Universidad  de Wisconsin, Madison, WI). Los anticuerpos Monoclonales de ratón
contra eIF4E y el β-actina fueron adquiridos de BD Biociencias y Sigma, respectivamente. Los anticuerpos de los conejos 
policlonales contra eIF4GI eIF4AI y que se han descrito anteriormente (30, 34). La peroxidasa de rábano secundaria (HRP)-
conjugado de los anticuerpos de la oveja anti-ratón y el burro anti-conejo se obtuvieron a partir de GE Healthcare. HeLa
S3 y las células BHK-21 se obtuvieron del tipo de colección de la cultura Americana  (Números ATCC CCL-2.2 y CCL 10-,
respectivamente). Águila de Dulbecco de Medio Modificado (DMEM), Lipofectamina 2000, y Optimem fueron de Invitrogen. 

La preparación de extracto celular de Krebs-2. La propagación de las células Krebs-2 ascitis en ratones y la preparación de
extractos se realizaron como se describió previamente (56).Antes de  la homogeneización, las células se suspendieron en
DMEM libre de metionina y se incubaron a 37 ° C durante 2 h con agitación suave. Las células se rompieron con un
Dounce homogeneizador, y un posmitocondrial sobrenadante (S10) se obtuvo por un centrifugación a alta velocidad (18.000
X g, 4 ° C, 20 min). Cuando se indicaron, los extractos se trataron con nucleasa micrococal en presencia de CaCl2 (56). 

En ensayos in vitro para la traducción del RNAm EMCV, la replicación del RNA, y virión de síntesis. La traducción y
replicación de mezclas de reacción de EMCV RNA (30µ L) que contenía sin tratar o tratado con extracto de nucleasa de
Krebs-2 S10 se programado con RNAm EMCV (4µg / ml), como se ha descrito anteriormente (55). Para mezclas de
etiquetado de proteínas, la reacción se complementó con [35S] metionina. Después de la incubación a 32 ° C durante 1,5 a 3
h, las reacciones se detuvieron con Laemmli tampón de muestra. Los productos proteicos se resolvieron por SDS-PAGE
(geles de 15%), electroforéticamente transferido a un difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana, y se detecta por
autorradiografía. Se realizó Western blot para 3Dpol como se describe a continuación. La replicación del RNA y la
producción del virión se ensayaron en las mezclas de reacción que contenía no etiquetados metionina como se ha descrito
anteriormente (55). Por RNA etiquetado, [α-32P] CTP se añadió a las mezclas de reacción después de 4 h de
incubación. Una hora después, se extrajo el RNA y los productos de RNA fueron analizados por electroforesis nativa 1% en
gel de agarosa y autorradiografía (55). A ensayo para la síntesis de EMCV, en las mezclas de reacción se incubó a 32 ° C
durante 20 h y se trató con una mezcla de RNasa A y T1 (55). Los ensayos se realizaron en placa utilizando diluciones
seriadas de muestras como se describe a continuación. 

Transfección siRNA. En las secuencias de las metas de pequeñas interferencias de RNA (siRNA) fueron diseñados
utilizando los criterios Dharmacon basados en la web y la compra  de Dharmacon. Las posiciones y las secuencias de los
siRNAs utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Células HeLa S3 se sembraron en una placa de cultivo de 24
pocillos a una densidad de 7 X 105 células por pocillo. Transfección de siRNA se ha realizado mediante Lipofectamine 2000
como se ha descrito anteriormente (7). 

Las infecciones por virus y radiomarcaje metabólica. Cuarenta y ocho horas después de que la  transfección de siRNA,
en las células HeLa S3 fue infectada con EMCV o PV a una multiplicidad de infección de 5 PFU por célula. El virus de
adsorción estuvo a temperatura ambiente durante 30 min. El medio fue reemplazado luego con DMEM libre de metionina, y
se continuó la incubación a 37 ° C. En varias ocasiones después de la infección (véase el gráfico leyendas), los medios
fueron reemplazados con medios que contienen proteína 35S-etiquetado mezcla (10µ Ci / ml). Después de 30 minutos de
etiquetado, las monocapas celulares se lavaron con salina tamponada con fosfato y se lisaron con tampón de muestra
Laemmli. Radiomarcado proteínas fueron resueltas por SDS-PAGE (geles de 15%), se transfirió a una membrana de
PVDF, y se detecta por autorradiografía. La membrana se utilizó la misma para Western Blot. 

Western Blot. Las membranas de PVDF se bloquearon con Tris-solución salina tamponada / 0,1% (vol / vol) de Tween 20
que contenía 5% de leche desnatada seca y se sondeó con los anticuerpos indicados. Los anticuerpos contra eIF4E,
eIF4GI, eIF4AI, y β-Actina se utilizaron diluido en 1:500, 1:1,000, 1:1,000 y 1:5,000, respectivamente. El anticuerpo contra el
virus Mengo proteínas 3Dpol se utilizó en una dilución de 1:1,500.Después de lavar, la membrana se incubó con HRP-
conjugado un anticuerpo de anti-ratón o anti-conejo, según sea apropiado (diluida 1:5.000). HRP se detectó mediante el Kit
de quimioluminiscencia Rayo Occidental según lo recomendado por el fabricante (Perkin-Elmer Life Sciences, Inc.). 

Análisis en placa. Ensayos en placas se realizaron como se ha descrito anteriormente utilizando monocapas confluentes

de cualquiera de células BHK-21 (para EMCV) o células HeLa R19 (para PV) en placas de 60-mm de diámetro (45). Las
células infectadas por virus de 24-pocillos fueron lisaron en 500µ l por pocillo de DMEM por tres ciclos de congelación y
descongelación.  Los desechos de la célula se separaron por centrifugación (10.000 X g, 4 ° C, 5 min), y los
sobrenadantes se diluyeron con DMEM que contenía 2% de suero fetal bovino. Las células fueron infectadas con 250µ l de
lisados diluidos en serie. Las placas se dejaron desarrollar bajo agar semisólida durante 26 horas (EMCV) o 36 h (PV) a 37
° C y se detectaron por tinción con violeta cristal al 1%.

RESULTADOS
La estimulación de EMCV IRES medida por la traducción 4E-BPs en un sistema de traducción exento de células no
tratadas. Buscamos directa evidencia de un papel subcomplejo de eIF4G/4A en la regulación de EMCV IRES en la
traducción dirigida in vitro. Anteriormente, hemos añadido recombinante BF 4E-a un conejo tratado con nucleasa- lisado de
reticulocitos de secuestrar eIF4E y evitar su incorporación en eIF4F; estas condiciones no se tradujeron en la estimulación
de EMCV IRES medida por la traducción (38, 53). Estos datos son en contraste con las observaciones de las células
infectadas de EMCV in vivo, donde la prevención de la incorporación en eIF4E eIF4F por rapamicina y wortmanina estimula
la síntesis de la proteína viral (5, 51). La hipótesis de que los RNAm celulares presentes en células infectada con virus
secuestra el eIF4F, por lo que este es un factor limitante para la traducción viral. L generación de eIF4G/4A, que no se une
RNA cubiertas de manera eficiente, sería de esperar para aliviar esta competencia. Por lo tanto, imitado en condiciones in
vivo por la realización de ensayos bajo condiciones de competencia-RNAm es decir, en los extractos en los que los RNAm
endógenos no eran destruidos por el pretratamiento con una nucleasa. Hemos utilizado una traducción sistema derivado de
Krebs-2 células a estudiar los efectos de 4E-BPs en la traducción de tope [cap-luc (A+)] O EMCV IRES contiene [EMCV
IRES-luc (A+)] Luciferasa poliadenilado RNAm. En este sistema, tanto 4E-BP1 y 4E-BP2 inhibe la traducción de la tapa-luc
(A+) RNA de tres a cuatro veces, similar a la analógica tapa, m7GDP, que fue utilizada como una control positivo (Fig. 1A;
comparar barras abiertas 3, 5 y 15 con 1 bar). Es importante destacar que, y en contraste con las observaciones en
nucleasa tratados RRL, 4E-BPs y m7GDP estimula la traducción de EMCV IRES-luc (A+) RNAm (~triple; comparar negro
barras 3, 5, y 15 con la barra 1). Tanto la tapa que dependen de la traducción y el IRES-dependiente de la traducción no se
vieron afectados por la 4E BP1 4E, una proteína mutante 4E-BP1 que carecen de la unión de sitio de eIF4E (barras 4)
(12, 33). EIF4E exógeno recombinante, ya sea con o sin etiqueta GST, estimulado tapa que dependen de la traducción
(De cuatro a cinco veces), pero inhibido EMCV IRES-dirigido traducción (de tres a cuatro veces; Fig. 1A; comparar las
barras negras 6 y 8 con 1 bar de IRES basada en la traducción). Los efectos de eIF4E sobre la traducción se ejerce a través
del complejo eIF4E/4G, como que fueron negados por la mutación en eIF4E W73A, que suprime esta formación de
complejos (barras 7) (13). Ni la traducción cap-dependiente ni IRES impulsada fue significativamente afectada por eIF4A
(Fig. 1A, bares 9). Sin embargo, eIF4G-Ct, la porción C-terminal de eIF4G que no contiene el lazo de eIF4E sitio y
corresponde al fragmento de la escisión de la proteasa picornavirus C-terminal (28), estimulado IRES medida por la
traducción aproximadamente cuatro veces (Fig. 1A; comparar barra de color negro 10 con la barra 1). Un aún más
sorprendente (10 veces) la mejora de la traducción EMCV IRES dirigida se observó después de la escisión de eIF4G por la
proteasa de rinovirus 2A (2Apro; Fig. 1A; comparar negro con barra de bar de 11 1). La adición de 4E-BP1 no más potenciar
este efecto. Además, eIF4E no influyó en la traducción medida IRES cuando eIF4G se escindió. En general, hay una
correlación inversa entre la eficiencia de cap-dependiente y el IRES-dependiente de la traducción, lo que sugiere
que están reguladas por eIF4F opuestamente. Estos resultados también demuestran que la estimulación de EMCV IRES
traducción dirigida por 4E-BPs pueden ser reproducidas in vitro.

La figura. 1. Reglamento de la traducción cap-dependiente y la tapa independiente por efectores de la función eIF4F en

Krebs-2 extractos de células. (A) Traducción en el extracto no tratada. Cap-luc (A+) y el virus EMC-luc (A+) RNAm (5
µ G / ml) se traduce en 12,5 µl Mezclas de reacción a 32 ° C durante 90 min en la presencia de metionina no marcada
(52). Antes de las adiciones de RNAm, los extractos se preincubaron a 32 ° C durante 2 minutos, ya sea con
control de tampón (control) o los componentes siguientes: GST (20 µg / ml), los GST-4E-BP1, GST-4E-BP1? 4E, GST-4E-
BP2, GST-eIF4E, GSTeIF4EW73A (40µ G / ml cada uno), eIF4E (16µ G / ml), eIF4A (80µG / ml), se eIF4G-Ct (40µ g / ml),
el PIB, o m7GDP (0,5 mM), como se indica en la figura. Donde se indique (2A), las mezclas de reacción contenían extraer
los tratados con 2Apro (25µ g / ml, 32 ° C, 5 min) (52). (B) la traducción de la Cap-luc (A+) y EMCV IRES-luc (A+) en el
RNAm de extraer los nucleasa tratados. Adiciones de proteínas y las condiciones de traducción fueron descritas como
en el panel A, a excepción de S10, que fue tratado con nucleasa. Luciferasa actividad (unidades relativas de luz [RLU]) se
determinó como se describió previamente (56) y se muestra como un porcentaje de la de la muestra de control.
Los datos representan la media de tres determinaciones independientes. Error Las barras indican la desviación estándar de
la media.

Para demostrar que el exceso relativo de la subcomplejo eIF4G/4ª en comparación con el complejo intacto eIF4F
indirectamente estimula EMCV IRES traducción dirigida por la disminución de la competencia de RNA celulares, hemos
realizado ensayos similares a los anteriormente usando un extracto en el que los RNA celulares endógenos
fueron degradados por tratamiento de nucleasa (Fig. 1B).  La directa traducción EMCV IRES fue mejorado (~ triple) en la
extracción de la nucleasa tratada (datos no presentados), lo que demuestra que compiten los RNA celulares en el extracto
no tratada tenía un efecto inhibitorio sobre la actividad de EMCV IRES. Nuestros resultados fueron consistentes con
los reportados para nucleasa tratada conejo reticulocyte lisado (38, 53). Aunque la adición de 4E-BP y m7GDP fue
fuertemente inhibida ten la tapa que dependen de la traducción (8 - a 20 veces), estos componentes no hicieron estimular la
actividad EMCV IRES en el extracto de la nucleasa tratos; de hecho, 4E-BP tenía un efecto ligeramente negativo en la
actividad de IRES EMCV (Fig. 1B; comparar las barras negras 3 y 4 con la barra 1). El tratamiento nucleasa también abolió
la capacidad de eIF4E para inhibir la traducción de la EMCV IRES (Fig. 1B; comparar las barras negras 5 y 1). En diferencia
de las observaciones en el extracto no se trata, el tratamiento 2Apro o eIF4G-Ct, además no puso en estimular la actividad
de EMCV IRES en el extracto de nucleasa tratados (Fig. 1B; comparar negro barras 8, 7, y 1). En conjunto, estos hallazgos
sugieren que un exceso relativo de los libres subcomplejo eIF4G/4A, en comparación con eIF4F, sube la regulación de
EMCV IRES basada solamente en la traducción de la presencia de competidores RNA celulares.

Figura. 2. EMCV traducción del RNAm, la replicación del RNA, y el virus ceden en las no tratadas de EMCV programados
en los extractos RNAm- S10. (A) Efectos de la concentración 4E-BP1 y eIF4E sobre la síntesis proteica no tratada de
EMCV RNAm-programada de extracto celular de Krebs-2. [35S] metionina etiquetado de proteínas se llevó a cabo en un µ20
Total de la reacción en volumen en ausencia (carril 1) o presencia (carriles 2 a 9) de RNAm EMCV (4µG / ml). Antes de la
adición de RNAm, los extractos Se preincubaron con las proteínas indicadas, como se describe en el leyenda de la
fig. 1. GST-4E-BP1 se utilizó a 15, 30 y 60µ G / ml (carriles 3, 4 y 5, respectivamente). eIF4E se utilizó a 3, 6 y 12µg / ml
(carriles 7, 8, y 9, respectivamente). Los productos de traducción se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a una
membrana de PVDF. Se muestra la autorradiografía de la membrana. Las posiciones de las dos abundantes proteínas
celulares (p47 y p50, puntas de flecha), la proteína específica de EMCV 3Dpol (flecha), y el peso de [14C] molecular de la
proteína metilada en los marcadores (GE Healthcare) que se indican. (B) El análisis de Western blot de EMCV específica la
síntesis 3Dpol proteína. La porción media de la membrana desde el panel A se probaron con anti-3Dpol como se describe en
Materiales y Métodos. Las intensidades de 3Dpol de la banda en distintas filas eran en comparación con la versión 1.63 de la
imagen del software NIH I. Los valores obtenidos de las reacciones se realizan en la ausencia de proteínas añadidas
(carriles 2y 6) y se define como 100%. (C) EMCV en la replicación del RNA que fue ensayada en 30 l - mezclas de reacción
que contienen extracto no se trata, EMCV RNAm (4µg / ml), y otros componentes como se describe en Materiales y
Métodos. Antes de la adición de RNA, las mezclas de reacción se preincubaron con tampón de control (carril 1), GST-4E-
BP1 (carril 2), eIF4E (carril 3), o una combinación de eIF4E y 2Apro (carril 4), como se describió para la figura. 1A. Los
productos de RNA fueron pulso marcado con [α-32P] CTP después de 4 a 5 h de incubación a 32 ° C y se analizaron por
electroforesis en gel de agarosa y autorradiografía. La posición del RNAm intacto EMCV es indicada (RNA v). (D) Las
mezclas de reacción (30µ L) preincubaron con bien el control tampón o los componentes indicados (como se describe para
la figura. 1A) y programado con RNAm EMCV (4µ G / ml) se incubaron durante 20 horas a 32 ° C. Las muestras se trataron
entonces con una mezcla de RNasas A y T1 y se ensayaron para la inefectividad después de la dilución apropiada, como se
describe en Materiales y Métodos. Los valores representan la media de tres determinaciones del título independientes. Las
barras de error indican la desviación estándar de la media.

El subcomplejo eIF4G/4A es esencial y la limitación de replicación de EMCV en el extracto no tratada. A continuación

examinamos si 4E-BP1 y eIF4E modular de la traducción de la EMCV IRES cuando el RNAm es de longitud completa a
EMCV se utilizan sin tratar ni extraer. RNAm EMCV se tradujo en la presencia de aumento de concentraciones de 4E-BP1
o eIF4E. Los productos de traducción se resolvieron por SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana PVDF, y se detecta
por autorradiografía. [35S] la incorporación de metionina en el extracto de polipéptidos no tratados principalmente
alargamiento reflejada de preexistente cadenas polipeptídicas. Sin embargo, en consonancia con la contribución de la
traducción de la iniciación novo, la incorporación de [35S] metionina en proteínas celulares fue inhibida por 4E-BP1 y
estimulado por eIF4E (Fig. 2A, tenga en cuenta los cambios correspondientes en las intensidades de
dos proteínas importantes celulares, p47 y p50). Esta última observación indica que eIF4E es limitante para la traducción de
endógenos RNA celulares. Era difícil discernir lo específico del virus de polipéptidos en este autorradiografía debido al alto
grado de etiquetado de sus propias proteínas celulares. Por lo tanto se evaluó la eficacia de la traducción del RNAm EMCV
por Western Blot utilizando en un anticuerpo contra la no estructural proteína 3Dpol (una RNA polimerasa dependiente de
RNA).  Además de estimulado 4E-BP1 (hasta 3,2 veces) la síntesis de 3Dpol (Fig. 2B; comparar los carriles 5 y 2). En
contraste, eIF4E dramáticamente inhibe la síntesis de 3Dpol hasta en 14 veces (Fig. 2B; comparar carriles 9 y 6). Así, en el
extracto no tratado, la traducción de larga duración RNAm EMCV se reguló por el artículo 4E-BP1 y la baja regulación por
eIF4E. Así, los efectos de 4E-BP1 y eIF4E en la traducción de RNAm de larga duración fueron EMCV similares a los
medidos utilizando la plantilla sustituto, EMCV IRES-luc (A+) MRNA. Para determinar si la estimulación de la síntesis de
proteínas virales por 4E-BP1 es suficiente para afectar EMCV replicación del RNA, que el pulso marcado con las mezclas
de reacción con [α-32P] CTP 4 h después del comienzo de la incubación con 4E-BP1. El nuevo RNA sintetizado se extrajo y
se analizó por gel de agarosa electroforesis y autorradiografía.  La síntesis de EMCV y de RNA se estimuló
aproximadamente 15-veces en presencia de 4E-BP1 (Fig. 2C; comparar los carriles 2 y 1). Por el contrario, la adición de
eIF4E reduce la síntesis de RNA a debajo de niveles detectables (Fig. 2C; comparar los carriles 3 y 1). En consonancia con
la importancia de la intacta eIF4G para la inhibición eIF4E medida de la traducción, la escisión de eIF4G por 2A pro síntesis
de RNA viral restaurado (Fig. 2C; carril 4 compara con los carriles 3 y 1). A continuación, se examinó los efectos de la 4E-
BP1, 4E-BP2, eIF4E, eIF4A y eIF4G CT-de ceder de EMCV. Los títulos de EMCV en la reacción de las mezclas
suplementadas con diferentes factores se determinaron después de una incubación de 20-h (Fig. 2D). Sorprendentemente,
4E-BP1 y 4E-BP2, así como m7GDP, estimula la síntesis de EMCV 24 - a 35-veces (comparar las barras 3, 5 y 15 con 1),
mientras que 4E-BP1 4E, lo cual no se puede enlazar a eIF4E, el tenía sólo un marginal efecto. A la inversa, el eIF4E,
pero no el eIF4E W73A mutante, disminuido drásticamente el título viral por 150 - a 200-veces (fig. 2D; comparar las barras
6 y 8 con 1). La adición de la C-terminal de la porción de eIF4G o 2Apro potentemente estimulado en la inefectividad (7 - y
15-veces, respectivamente; comparar las barras 10 y 11 con 1), y esta mejora no fue influenciado por coadicion de eIF4E o
4E-BP1. En general, los títulos de EMCV bajo diferentes condiciones covarían con expresión de la luciferasa de la EMCV
IRES-luc (A+) RNAm (compárese con la fig. 2D con la fig. 1A). Sin embargo, la magnitud de los cambios en título viral fue
mayor que el medido por traducción de eficiencia.

Es importante destacar, y de acuerdo con el papel de la competencia del RNAm en la regulación de la traducción del RNA
viral, la adición de eIF4E al EMCV RNAm-programado o nucleasa tratada- extrae ni inhibe la traducción del RNAm EMCV
(según se juzga por la acumulación de la proteína viral 3D) ni cambió el patrón de expresión de virus específicos de
polipéptidos (fig. 3A; comparar carril 4 con calle 2). Además, eIF4E no tuvo ningún efecto sobre la síntesis de EMCV (Fig.
3B). Estos resultados descartar la posibilidad de que las proteínas sean contaminantes bacterianos, que pueden estar
presentes en la preparación de eIF4E, afectando negativamente la replicación EMCV. El tratamiento de la nucleasa también
abolió el efecto estimulador de 4EBP1 en EMCV traducción y la replicación (Fig. 3A y B). Aunque estos controles negativos
abogó por la importancia de la competencia de RNAm en la regulación de la expresión de la proteína viral por eIF4F, que no
descartó una posibilidad alternativa. Específicamente, el efecto perjudicial del tratamiento con nucleasa podría ser una
consecuencia de la destrucción o inactivación de algunos lábil elementos de regulación de la extracción. Para hacer frente a
esta posibilidad, hemos restaurado la competencia RNAm mediante la adición de concentraciones de saturación de los
RNAm de cubiertas [ya sea total poli (A)+ RNAm aislado del citoplasma de las células Krebs-2 o RNA de globina] junto con
RNAm EMCV al extracto de nucleasa y tratada examinaron los efectos de 4E-BP1 y eIF4E en proteína viral expresión. La
traducción de poli (A)+ RNAm solo han mostrado ser heterogénea de los polipéptidos similares a los productos de
endógeno RNAm traducción en el extracto no tratada (fig. 3C, calle 1). Traducción de RNAm de globina produjo un
polipéptido de 15 kDa como lo esperado (calle 8). Cuando RNAm EMCV se tradujo en la presencia de poli (A)+ o globina
RNAm, la expresión de las proteínas del virus se redujo de dos a tres veces (compárese calle 3 con 2 y el carril 10 con
9). En paralelo, RNAr 18S fue utilizado como un control negativo y se encontró no para inhibir la traducción viral (datos no
se muestra). (Debe señalarse que un exceso molar de tope RNA más de RNAm EMCV se utilizó en estos experimentos.
Esto fue para imitar la etapa inicial de la infección viral cuando RNAm constituye una pequeña fracción de RNA total.)
Adición de 4E-BP1 al sistema programado con una mezcla de EMCV RNA y tapado estimulado expresión del virus proteína
dos a tres veces (comparar carriles 4 con 3 y calle 11, con 10), similar a la adición de m7GDP (comparar carril 6 con 3 y el
carril 13 con 10). En contraste, eIF4E marcadamente inhibida en la síntesis de proteínas virales (1,9-a la inhibición de 2,7
veces; comparar carril 5 con 3 y el carril 12 con 10). Así, la adición de las cubiertas de RNA al EMCV RNAm-programada
nucleasa tratada con extracto rescata la regulación de la expresión de la proteína viral por eIF4F.

Estimulación específica de EMCV y traducción en células PV tratados con siRNA contra eIF4E. Para demostrar que la
concentración del subcomplejo de eIF4G/4A determina la tasa de la síntesis de proteínas de EMCV in vivo, se utiliza la
interferencia de RNA para agotar específicamente eIF4E (58). Tal sería el agotamiento esperado que disminuiría la
competencia de RNA celulares por aumento de la cantidad del complejo eIF4G/4A disponible para traducción del RNAm
viral. El siRNA seleccionado provocó una fuerte (~85%) desmonta de eIF4E (fig. 4B; véase también la figura S1A y. S2B en
el material complementario). La caída del eIF4E no condujo a una disminución en la abundancia general de eIF4GI o
eIF4AI, que representa a la mayoría de eIF4G total y eIF4A (6, 50), pero se redujo drásticamente la cantidad de eIF4F,
según lo determinado por desplegables de las columnas de límites máximos de ensayos (véase la figura S1A en el material
suplementario) (datos no presentados). Para determinar si la baja regulación de eIF4E disminuye la velocidad de la
traducción de iniciación, los polirribosomas aislados del control y las células de eIF4E desmontables fueron fraccionados por
la densidad de sacarosa centrifugación en gradiente. Las células deeIF4E desmontables muestra un superior 80S de
monosoma / polirribosomas de la proporción en comparación con el controlar. Además, un pequeño cambio de la
distribución poliribosoma a favor de más ligeros polisomas era evidente (ver fig. S1B en el material complementario). La
reducción en poliribosoma carga después de agotamiento eIF4E es consistente con la inhibición de iniciación celular
traducción del RNA bajo estas condiciones. Para examinar el efecto de la caída en la proteína viral eIF4E síntesis, las
células fueron pulso marcado con [35S] metionina en diversos tiempos después de la infección de EMCV. A las 4 h después
de la infección, sólo trazas de proteínas virales puede ser detectada en las células pretratadas con el control de siRNA (Fig.
4A, calle 8). En contraste, en las células tratadas con siRNA contra la síntesis de eIF4E, la proteína viral fue robusta 4 h
después de la infección (calle 3). El estimulador efecto de derribo de eIF4E sobre la síntesis de proteína viral fue también
observado después de 5 h de la infección (comparar carril 4 a carril 9). Después de 6 horas de la infección, las células
fueron desmontables de eIF4E, pero no las células de control, mostraron cambios morfológicos, indicativos inducida por el
virus de efecto citopático, acompañado por un descenso generalizado en la síntesis de la proteínas de capacidad (Fig. 4A,
carril 5) (datos no se muestra). Estos datos sugieren que la anulación de eIF4E expresión acelera la síntesis de proteína
EMCV. También se analizó los títulos virales recuperados de control y la caída eIF4E las células a 4 h después de la
infección. Un aumento de aproximadamente 10-veces en la producción de virus infeccioso se asoció con una caída eIF4E
(Fig. 4D y E). Vale la pena mencionar que esta elevación

La figura. 3. 4E-BP1 y eIF4E no tienen ningún efecto sobre la síntesis de proteína EMCV y la replicación en extracto celular
de la nucleasa-tratado de Krebs-2. (A) Los productos de EMCV traducción del RNA. Las mezclas de reacción contenían la
nucleasa tratada de Krebs-2 de células extracto pero por lo demás eran idénticas a la descrita en la figura. 2A. Las mezclas
de reacción se preincubaron con control tampón, GST-4E-BP1 (60µg / ml), o eIF4E (12µg / ml) que se indique. La
traducción se realizó a 32 ° C durante 3 h. Alícuotas (5µ L) de las mezclas de traducción de reacción se analizaron por
SDS-PAGE. Un autorradiograma del gel seco se muestra. [35S] metionina en la incorporación EMCV específica 3Dpol
proteína se cuantificó mediante un Fuji BAS2000 fosforimager. El valor obtenido de la reacción realizada en la ausencia de
proteína añadida (carril 2, el control) se definió como 100%. (B) EMCV rendimientos. Las mezclas de reacción (30µ L, sin
etiqueta) se preincubaron con tampón de control, GST-4E-BP1 o eIF4E y programado con RNAm EMCV, tal como se
especifica anteriormente. Las placas fueron anotadas después de incubación durante 20 horas a 32 ° C y tratamiento con
RNasa. Los datos representan la media de tres determinaciones. Las barras de error indican la norma desviación de la
media. (C) Coadicion de los competidores de RNAm de cubiertas rescata la regulación de la traducción del RNAm de EMCV
por el artículo 4E-BP1 y eIF4E en nucleasa tratada extracto. RNAm EMCV (4µ G / ml) fue traducido a 32 ° C durante 90
minutos en ausencia (pistas 2 y 9) o presencia ya sea total de Krebs-2 de células poli (A)+ RNAm (40µ g / ml, carriles 3 a 6)
o
RNAm de globina (10µg / ml, los carriles 10 a 13). Las mezclas de reacción fueron preincubaron con control de tampón,
GST-4E-BP1 (60µ g / ml), eIF4E (12 µ G / ml), o m7GDP (0,5 mM) que se indique. Productos de la traducción
de Krebs-2 de células poli (A)+ RNAm o RNAm de globina solo se muestran en la carriles 1 y 8, respectivamente. N RNAm
se añadió a la reacción mezcla analizada en el carril 7. Los valores relativos de [35S] de la incorporación de la metionina
en EMCV en la proteína específica de 3Dpol se determinaron como en Panel A. En los paneles A y C, la asignación de
polipéptidos EMCV se describió como anteriormente (55). Las posiciones de la 14C-metilado los marcadores de proteínas
de bajo peso molecular (GE Healthcare) también se muestran. Un asterisco en el panel C indica la posición de globina.

En el título del virus, aunque significativa, es menor ejercida por el secuestro de eIF4E de 4E-BPs in vitro (24 -
a 28 veces la estimulación [fig. 2D]). Nosotros atribuimos esto al hecho de que algunos de eIF4E residual (10 a 20%), y por
inferencia alguna eIF4F, está presente en las células de eIF4E desmontables. Por el contrario, el secuestrante de eIF4E por
4E-BP en exceso in vitro por completo perturba a eIF4F. La abundancia del subcomplejo de eIF4G/4A también podría
desempeñar un papel en una etapa temprana de la infección por enterovirus cuando la escisión de eIF4G todavía no se ha
logrado. Para probar esta hipótesis, se examinó el efecto de la caída de infección de eIF4E por el VPH. Las células HeLa
transfectadas con siRNA control, ya sea o siRNA dirigida contra eIF4E se infectaron con el PV, y la cinética de la de síntesis
de proteínas virales fueron analizados por [35S] la metionina de pulso-etiquetado. Al igual que con EMCV, la caída de eIF4E
significativamente acorta la fase de eclipse de la infección, durante los cuales ningún virus de proteínas puede ser
detectado (ver fig. S2A en el suplementario material). Las tasas más altas de la síntesis de proteínas PV fueron evidentes
en 3, 4, y 5 h después de la infección en células desmontables eIF4E en comparación con las células control (ver fig. S2A
en el material complementario). De acuerdo con estos resultados, las células agotadas de eIF4E exhibieron un efecto
fotovoltaico inducido de citopático antes que el control de las células fotovoltaicas y producidas más (ver fig. S2D en el
suplementario materiales) (datos no presentados). Así, eIF4E parece ser un general, en lugar de específico de EMCV
RNAm, inhibidor de la medida de traducción IRES. Una posibilidad poco probable que no pueda ser rigurosamente excluido
es que el agotamiento de eIF4E estimula principalmente la replicación del RNA viral y que la mejora de la viral la
acumulación de proteínas es un efecto secundario.

DISCUSIÓN
Debido a que eIF4E no es necesario para la traducción por internos de entrada de ribosomas, se ha asumido generalmente
que este factor no juega un papel en la regulación de la actividad IRES. Aquí demostrar que eIF4E es, de hecho, un
regulador negativo de EMCV traducción del RNAm en condiciones de competencia con RNA celulares. La saturación de la
subcomplejo eIF4G/4ª con eIF4E para generar eIF4F disminuye drásticamente EMCV RNAm traducción y rendimiento de
virus en los extractos tratados. Por el contrario, el secuestro de eIF4E de 4E-BPs in vitro o el agotamiento de eIF4E in vivo
estimula la traducción del RNA y EMCV aumenta título viral. Estos resultados implican que la eIF4F intacto complejo es
incapaz de soportar IRES eficientes funcionar, ya que es secuestrada por el RNAm tapado. Liberar el subcomplejo eIF4G/4ª
alivia la competencia de RNA celulares, con lo que

La figura. 4. caída de eIF4E estimula la traducción y la replicación de EMCV in vivo. (A) Tiempo curso de la síntesis de
proteínas en las células infectadas de EMCV. SiRNA contra eIF4E o siRNA no específico (de control) se transfectó en
células HeLa S3.  La caída de eIF4E o el control Se infectaron células con EMCV, y la síntesis de proteínas se examinó por
pulso-etiquetado con metionina [35S] en los puntos de tiempo indicados Después de etiquetado, los polipéptidos se
resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. La autorradiografía de la membrana se
muestra. Las posiciones de las principales proteínas específicas de EMCV se indican a la derecha. (B) los niveles eIF4E en
las células, como se analiza por Western Blot. La membrana desde el panel A se probaron con anti-eIF4E, y las señales se
cuantificaron como se describe en Materiales y Métodos. El nivel medio de agotamiento de eIF4E de las calles 1 a 5 (frente
a 6 carriles 10) fue de 86%. (C) β-Actina de detección por Western Blot (una carga controlar). (D) ensayos de placa de las
diluciones indicadas de los lisados a partir de células de control desmontables y eIF4E 4 h después de la infección.(E) El
rendimiento de EMCV, como afectados por el tratamiento de siRNA eIF4E. Las células infectadas de EMCV (caída eIF4E o
control, sin etiqueta) se lisaron a las 4 h después de la infección. Título viral se midió como se describe en la leyenda para
Fig. 2D.

Favoreciendo la traducción del RNAm viral. Nuestros hallazgos apoyan la idea de que la concentración citoplásmica de
sesión es de eIF4F menor que la concentración del total de RNA celulares (1, 57). La idea de que un factor de iniciación
discriminatoria regula la competencia entre los RNA celulares y virales en la infección por EMCV fue propuesto por primera
vez hace tres décadas (17, 29, 49). Sin embargo, la limitación de paso y la limitación de los componentes en la traducción
no eran definidas. Nuestros resultados demuestran claramente que juega este eIF4F función discriminatoria a través de la
disponibilidad de su tapa de unión subunidad, eIF4E. La abundancia de eIF4E funcional, que es
regulada por el artículo 4E-BP, por lo tanto actúa como un interruptor entre la tapa que dependen de y el IRES medida por
la traducción. ¿Cómo eIF4E disociación de eIF4F mejorar la traduccion especifica del virus ?eIF4E disociación se cree que
causa un cambio conformacional en eIF4GI que puede ser detectado por su lenta tasa de escisión por proteasas
picornavirus (19, 37). Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren que esta conformación cambio no puede explicar
por el efecto estimulador de la eIF4G/4A subcomplejo sobre el virus específico de la traducción. En primer lugar, los rayos
UV entrecruzamiento experimentos sugieren que eIF4G une de manera eficiente a los EMCV IRES como un componente
del complejo eIF4F (42). En segundo lugar, la tapa analógico m7GDP, que inhibe la cap-encuadernación de la actividad de
eIF4F pero no altera la Asamblea de eIF4F, estimula la actividad EMCV IRES y la producción viral de una manera similares
a 4E-BP (fig. 1A y 2D). Finalmente, y más importante, 4E-BP1 y eIF4E no tienen ningún efecto sobre el RNA viral de
traducción en un extracto de nucleasa tratada (fig. 3A). Así, en el extracto reconstituido sistema o en la nucleasa-tratado,
EMCV IRES parece interactuar con los complejos eIF4F o eIF4G/4ª con eficacia comparable. Por lo tanto, la conclusión de
que la competencia de los RNAm celulares para eIF4F se requiere para la regulación de la síntesis de EMCV por eIF4E y
4E-BP. La traducción de luciferasa de la EMCV IRES se ha mejorado en respuesta a eIF4G escisión o después de la
adición de la eIF4G C-terminal de la proteína fragmento al extracto. Resultados similares han reportado para PV IRES
medida traducción (4, 52). Si este efecto se a ser influenciado por la competencia de RNAm, debería ser más pronunciada
en la presencia de competir RNA celulares. De acuerdo con esta predicción, hemos encontrado que El tratamiento 2Apro
estimulado la actividad EMCV IRES mucho más potentemente en no tratada que en nucleasa tratados extractos (11-pliegue
frente al 1,4 veces; comparar la figura. 1A, negro barra 11, y B, negro barra 8). Asimismo, la competencia RNAm celular se
requiere para eIF4G-CT-o m7GDP medida por la estimulación de la actividad IRES, como esta estimulación producida
exclusivamente en los extractos tratados. RNA de replicación y rendimiento de virus correlacionada con EMCV eficiencia
RNAm traducción, lo que indica que la traducción es la limitación de paso en la replicación del virus. Sorprendentemente, la
magnitud de modulación de la replicación del RNA y la formación del virión por 4EBP1 y eIF4E fue sustancialmente mayor
que la magnitud de su efecto en la traducción del RNAm EMCV. Así, los efectos asociados con la competencia por los
factores de conversión se amplifican en los pasos subsiguientes del ciclo infeccioso. Curiosamente, eIF4F complejo de la
disociación es también beneficioso para la expresión de genes PV, en la medida en eIF4E empobrecido o células tratadas
con rapamicina apoyado síntesis de proteínas virales a un nivel mayor que las respectivas células de control (ver fig. S2A
en el material suplementario) (5).Presumiblemente, esta estimulación se produce al principio de la infección-antes de la
eIF4G escisión, cuando el RNA viral debe competir con celular RNA de la piscina de limitar eIF4F intacta. Queda por
determinar si la disociación eIF4F estimula infecciosa procesos inducida por otros picornavirus.

La figura. 5. Modelo eIF4F explica la regulación de la competencia de las células infectadas de RNAm en EMCV. Se
presume que existe un equilibrio entre eIF4F (eIF4E/4G/4A) y un subcomplejo binaria compuesta por eIF4G y eIF4A
(eIF4G/4A) y que compite con RNAm EMCV RNAm celular con tapa para la contratación de eIF4G compartida por éstos
complejos. La saturación de la subcomplejo eIF4G/4A con eIF4E de Generar eIF4F aumenta su reclutamiento por parte de
cubiertas de RNA celulares y dramáticamente inhibe la traducción EMCV y replicación (Fig. 1 y 2). Por lo tanto, el RNAm
EMCV se encuentra con la fuerte competencia de celulares RNAm cuando se une a eIF4G dentro del complejo ternario
eIF4F. Por defecto, el RNAm EMCV utiliza eIF4G en el binario subcomplejo eIF4G/4A, que es reclutado por el RNAm
ineficiente tope (32, 36). Desfosforilado (activo) 4E-BP1 y 4E BP2-(designado como 4E-BP) desencadenar la expulsión de
eIF4E del complejo ternario eIF4F. Elevación de la concentración de la subcomplejo eIF4G/4A, resultando ya sea de
activación 4E-BP (5, 51) o desmontables eIF4E (fig. 4), estimula la EMCV IRES dirigida la traducción y lo especifico del
virus de aguas abajo de los procesos. Flechas de trazos sólidos y en la mala designación eficiente y los caminos
ineficientes, respectivamente. m7G y AAA denota la tapa y la estructura de poli (A) la cola del RNAm,
respectivamente. VPg denota la proteína ligada al genoma de EMCV.

Un modelo que ilustra la regulación de la replicación por EMCV eIF4F se muestra en la fig. 5. Central de este modelo es el
hecho de que EMCV IRES no compite eficazmente con tope móvil RNAm para eIF4F a menos que la subunidad de eIF4E
de unión a tope es secuestrado en un complejo con el 4E-BP, y lo relativo abundancia del subcomplejo eIF4G/4A se
incrementa. Como hay no es tapa de la subunidad de unión dentro de la subcomplejo eIF4G/4A, se puede suponer que no
ha sido contratado de manera eficiente por celular RNAm. En efecto, en presencia de eIF4A, la afinidad de unión
de eIF4G para RNAm β-globina es menor que la de EMCV IRES de hasta de 100 veces (32). Sin embargo, la concentración
de la subcomplejo eIF4G/4A en células HeLa es limitante para la traducción RNAs de picornavirus, desde desmontables
eIF4E significativamente aumenta la expresión de proteínas virales en EMCV y PV células infectadas. Debido a que eIF4A
no está estrechamente asociada con eIF4G y recicla durante la traducción (39), algunos eIF4G puede también existen fuera
del complejo eIF4F o el binario eIF4G/4ª subcomplejo. Sin embargo, esta "libre" de eIF4G no se espera que unan a EMCV y
IRES con alta afinidad (32) y no es por lo tanto mostrado en el modelo. El tropismo celular y la patogénesis de los
picornavirus puede se determina en parte por la disponibilidad de IRES de acción trans factores, que se unen
específicamente a IRES picornavirus y regular su función (4). Una idea interesante es que el tropismo y la patogénesis
también se ven influenciadas por la concentración de la libre eIF4G/4A, que depende de la expresión de la eIF4F
componentes y la regulación de la abundancia y la fosforilación estado de 4E-BPs. Anfitrión permisividad para la traducción
del virus podría estar limitada por la exposición de las células a los estímulos extracelulares que activan a través de mTOR
fosfatidilinositol 3-de quinasa de señalización y aumentar la fosforilación de 4E-BP (43). Por lo tanto, es probable que tanto
las células de tipo específico y ambientales factores afectan a la capacidad del virus para establecer una eficiente
infección. También es posible que las condiciones patológicas que afectar a la concentración de componentes eIF4F
afecten al resultado de una infección viral. Por ejemplo, varios tipos de cáncer son asociados con mayores niveles de
subunidades eIF4F, en particular eIF4E y eIF4G (2, 23). En condiciones de exceso de eIF4G, RNA celulares no pueden
competir con los RNAm picornavirus para la traducción (o competir de otra manera por otro limitar componente), y estas
células se espera que sea altamente susceptibles a la infección. En este sentido, cabe señalar que los picornavirus
preferentemente eliminar las células malignas encima de las células normales (18, 46). Sin embargo, no se sabe si el tumor
de las células utilizadas en estos estudios contenía niveles más altos de eIF4G que las células normales. Además de su
papel en la expresión de los genomas de virus, los relación entre los complejos eIF4G diferentes pueden regular la
proliferación celular, la supervivencia y la muerte, como elementos IRES se encuentran a menudo en los RNAm de los
genes que controlan estos procesos (20, 24, 26, 48). Nuestros resultados sugieren que el IRES-medido de traducción de
RNAm celulares no sólo debe ser resistente a eIF4F disociación pero estimulado por ella. Los siguientes ejemplos de la
traducción selectiva conforme a esta noción. A pesar de una reducción en la síntesis de proteínas en general, el X-ligado
inhibidor de la apoptosis de RNAm, que posee un IRES, es traduce de manera más eficiente en la privación de suero, lo
que disminuye 4E-BP fosforilación (24). Los niveles elevados de Xlinked inhibidor de la apoptosis se cree que retrasar la
aparición de la apoptosis y permiten a la célula para sobrevivir bajo condiciones de estrés. Una rápida inhibición de la
traducción, como una consecuencia de 4E-BP1 desfosforilación y eIF2 α fosforilación por PERK, se desarrolla durante la
hipoxia, que es común en muchas enfermedades humanas como los accidentes cerebrovasculares, enfermedades
cardíacas y el cáncer (24). Sin embargo, por lo menos dos proteínas (HIF1α y el crecimiento endotelial vascular Factor) que
participan en la supervivencia celular se regula durante la hipoxia, presumiblemente a través de su síntesis por IRES
dependiente de la traducción. También es digno de mención que en las neuronas de los moluscos califórnicos de Aplysia el
cambio de la tapa que dependen de IRES-dependiente de la traducción se cree que es desencadenada por la
desfosforilación de eIF4E (9). Saber cómo selectiva de traducción permite a las células adaptarse a las tensiones
ambientales y fisiológicos, tales como la hipoxia, golpe de calor, toxinas, y la exposición al fármaco, es importante para
comprender muchos trastornos humanos y puede conducir a la desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para estas
condiciones.

AGRADECIMIENTOS
Damos las gracias a Ann Palmenberg para el anticuerpo contra el virus Mengo proteínas 3Dpol, Hiroaki Imataca para
pT7EMCVluc (A)+, Sandra Perreault y Colin Lister para la asistencia técnica excelente, y Wayne Sossin para la lectura
crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) a
NS, que es un distinguido científico CIHR y un Instituto Médico Howard Hughes Internacional Académico.