Los huesos en desarrollo están afectados diferencialmente por la formación muscular

esquelética comprometida.

Abstracto

Las fuerzas mecánicas son esenciales para la función normal y reparación del hueso adulto, pero el impacto de las
contracciones musculares prenatales sobre el desarrollo óseo aún no se ha explorado en profundidad en los sistemas del
modelo mamífero. En este estudio, se analizan el esqueletogénesis en dos modelos 'sin músculo' ratón mutante en el que
se interrumpe la formación de desarrollo del músculo esquelético; Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - y Pax3 Sp / Sp (Splotch).
Los centros de osificación se encuentran afectados diferencialmente en las extremidades sin músculo, con una disminución
significativa en la formación de hueso en la escápula, húmero, el cúbito y el fémur, pero no en la tibia. En la escápula y
húmero, las morfologías de los centros de osificación fueron anormales en las extremidades sin músculo. Histología del
húmero reveló un grado de disminución de la zona hipertrófica en las extremidades mutantes pero ningún cambio en la
forma de esta región. La articulación del codo se encontró también que ser claramente afectada con una reducción
dramática en la línea de la articulación, mientras que no eran evidentes anormalidades en la rodilla. La tuberosidad
deltoidea del húmero se redujo significativamente en tamaño en la nlacZ Myf5 / nlacZ: MyoD-/ - mutantes, mientras que un
cambio en la forma, pero no en tamaño, se encontraron en las tuberosidades humerales de los Pax3 SP / Sp mutantes.
También se examinó el desarrollo del esqueleto en un modelo de "muscular reducida", la Myf5 nlacZ / +: MyoD-/ - mutante,
en el que las formas de músculo esquelético, pero con masa muscular reducida. El fenotipo muscular reducido parecía
tener un efecto intermedio en el desarrollo esquelético, con la formación ósea reducida en la escápula y el húmero
comparación con los controles, pero no en otros rudimentos. En resumen, hemos demostrado que el desarrollo del
esqueleto es diferencialmente afectado por la falta de músculo esquelético, con algunos rudimentos y las articulaciones
están más afectadas que otras. Estos hallazgos indican que la respuesta de las células progenitoras esqueléticas a
estímulos biofísicos puede depender de su ubicación en la embrionaria extremidad, lo que implica una compleja interacción
entre las fuerzas mecánicas y específicos de la ubicación factores de regulación que afectan a los huesos y el desarrollo
conjunto.

Introducción

Las fuerzas mecánicas se sabe que son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea adulta [1,2], y se cree que el
entorno mecánico en la extremidad en desarrollo tiene una influencia importante sobre el hueso embrionario y la formación
de la junta [3-6]. Por ejemplo, se ha demostrado que los niños con enfermedades neuromusculares, los cuales causan una
reducción de movimiento en el útero, tienen huesos largos que son delgadas, y pomineralizada y propensos a las fracturas
[3]. En los niños afectados con parálisis cerebral hemipléjica, la maduración esquelética en el lado afectado se retrasa [7].
Una mejor comprensión de la mecánica de la formación de huesos y articulaciones durante el desarrollo proporcionará
pistas vitales para la mecanoregulación de células y tejidos, y potencialmente podría conducir a mejores tratamientos para
afecciones que se vea afectado el desarrollo del esqueleto de movimiento reducida en el útero. El estudio de la relación
entre las fuerzas mecánicas y el desarrollo esquelético pueden contribuir a la ingeniería de tejidos del esqueleto, donde los
aspectos de desarrollo se emulan procesos in vitro [8].

Mutantes de ratón en los que está afectado el desarrollo muscular proporcionar sistemas útiles para examinar
esqueletogénesis en la presencia de la alteración de los entornos mecánicos. Dos cepas son Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ -
[9] y Pax3 Sp / Sp (Splotch) [10]. Pax3 SP / Sp mutantes carecen del factor de transcripción Pax3, que es crítica para las
migraciones musculares de las células madre / progenitoras en las yemas de las extremidades [11], por lo tanto, estos
mutantes carecen de músculos de las extremidades. Pax3 se requiere en múltiples sistemas en desarrollo y mutaciones
también causan tubo neural [12] y defectos cardíacos [13], lo que puede conducir a la muerte de homocigotos mutantes en
el útero de día embrionario E14 [14]. Las anormalidades del cráneo, las costillas y las vértebras, y la fusión de los huesos
en las regiones de los hombros y la cadera también se han observado en embriones de ratón Pax3 nulos [14]. En los seres
humanos, las mutaciones heterocigotas del gen causan el síndrome de Waardenburg, con síntomas que incluyen pérdida
de la audición y anormalidades de pigmentación [15]. En Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - mutantes dobles, la función de tres
genes de determinación miogénica es abrogado: Myf5, MyoD y MRF4 (MRF4 compromiso de la función en cis) [9]. Las
células madre/progenitoras musculares migran hacia las extremidades de los mutantes, pero no se comprometen con el
destino miogénico, mioblastos y en consecuencia se carece de las fibras musculares diferenciadas [9,16]. Rot-Nikcevic et
al. [17,18] La esqueletogénesis se ha examinado en ausencia del músculo esquelético en etapas tardías del feto (E18.5)
Myf5-/ -: Myod-/-, un modelo comparable con un alelo knockout diferente de Myf5. Las características de los embriones
inmovilizados incluyó una escápula más corto, clavícula, fémur mandíbula, y en la tibia, una esternón anormal y ausencia de
la tuberosidad deltoidea del húmero, con longitudes no modificadas del húmero, el radio o el cúbito [17]. Los ratones sin
músculos habían reducido la separación entre el radio y el cúbito, y entre la tibia y el peroné [17]. Gómez et al. [19] también
se informó de una ausencia de la tuberosidad humeral en el modelo Myf5-/ -: Myod-/-, pero en contraste con la el estudio
Rot-Nikcevic [17], reportó significativamente un ulnae más corto en E18 [19]. Gómez et al. [19] encontraron húmeros y
fémures más gruesa en los mutantes E18, con un mayor espesor cortical en el fémur. Se encontró un aumento en el
número de osteoclastos en la tibia y el peroné, pero la histología reveló ninguna diferencia entre las osificaciones de las
falanges o fémures de animales mutantes y de tipo salvaje en E18 [19]

Si bien existe evidencia que sugiere que la ausencia de músculo puede afectar a la forma y el tamaño de los diferentes
elementos esqueléticos, hay pocos datos sobre cómo el inicio y mantenimiento de la osificación puede verse afectada por
un ambiente mecánicamente alterada en el miembro de mamífero. Sin embargo, los datos de estudios de inmovilización de
pollo sugieren que las fuerzas mecánicas debido a las contracciones musculares pueden jugar un papel importante en la
iniciación y el mantenimiento del hueso. Hosseini y Hogg [5] examinó la oportunidad y alcance de los centros de osificación
en miembros inmovilizados de pollo, y señaló que, aunque el momento de la primera  aparición de centros de osificación fue
similar en miembros inmovilizados y control, por 19 días, hubo una reducción de entre el 25% y el 33% en la longitud de la
diáfisis calcificado en los huesos largos principales. Los estudios que utilizan el pollo han investigado los posibles
mecanismos subyacentes a la mecanoregulación de hueso embrionario. Germiller y Goldstein [20] observaron una
disminución en la proliferación de los condrocitos en la placa de crecimiento embrionario aviar como resultado de la
inmovilización, y propone que las contracciones del músculo esquelético juegan un papel en la regulación de los condrocitos
inmaduros. Hemos mostrado anteriormente que la osificación de la tibia aviar se vio afectada por un entorno mecánico
alterada y propuesto, basado en los cambios en la expresión génica en las extremidades inmovilizadas, que COLX y Ihh
pueden jugar un papel en las vías de mecanoregulatoria contribuyendo a la formación de hueso [21]

En este estudio, caracterizamos el desarrollo óseo en extremidad anterior y miembro posterior de los elementos
esqueléticos en dos cepas ratones mutantes; 'sin músculo' Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ -, y Pax3 Sp / Sp con especial
énfasis en el grado de osificación temprana. Como ambos mutantes están completamente desprovistas de músculo
esquelético de las extremidades, los elementos esqueléticos se desarrollan en ausencia de tejido muscular vecina, y por lo
tanto carecen de patrones dinámicos de estímulos biofísicos que hemos mostrado en el resultado de las contracciones
musculares espontáneas embrionarias [22]. En camada de la doble eliminatoria, cuando una copia funcional de Myf5 está
presente (Myf5 nlacZ / +: MyoD-/ -), la diferenciación del músculo esquelético se produce, pero el número de fibras
musculares, y la masa muscular, se reduce en 35-55% [23].También examinamos esqueletogénesis en estos embriones sin
musculo "Myf5nlacZ / +: MyoD-/ - . Se probo la hipótesis de que la iniciación y progresión de la osificación se ven afectadas
por la falta de músculo esquelético mediante el examen de dos lesiones independientes genéticos que conducen a la
ausencia del músculo, y se identifican los elementos esqueléticos que están más afectadas por la alteración del entorno
mecánico en la extremidad en desarrollo.

Métodos

Los modelos animales y la generación de muestras embrionarias Myf5 nlacZ / +: MyoD + / - o Pax3Sp / + se mezclaron bien
mediante cruzamientos espontáneos o por superovulación de las hembras, y posteriormente las crías fueron genotipo
como se describe anteriormente [9,10]. Los embriones y los fetos fueron cosechadas en E14.5, E15.5 y E14.75 y cada
embrión fue efectuado utilizando criterios morfológicos Theiler [24], con especial énfasis en las características anatómicas
susceptibles de ser afectados por la falta de músculo, como características externas de piel, los ojos y el desarrollo del oído,
en conjunción con características de las extremidades tales como la separación de los dígitos. Por ejemplo, los embriones
fueron designado etapa Theiler (TS) 23 si los dedos de manos y pies estaban separados y divergentes, los párpados
abiertos, la piel suave y el pabellón de la oreja todavía no cubra totalmente el canal auditivo [24]. Diez Myf5 nlacZ / nlacZ:
MyoD-/ - y once Myf5 nlacZ / +: MyoD-/ - de embriones en etapa TS23 se analizaron y en comparación con compañeros de
la camada trece con el músculo esquelético normal en TS23, usadas como controles para estos grupos. Los genotipos de
control incluidas, en peso, Myf5 nlacZ / +: MyoD + / -, Myf5 nlacZ / +: MyoD + / + y Myf5 + / +: MyoD-/ +. Pax3 Sp / Sp
embriones en TS23 (n = 7) y TS25 (n = 3) fueron comparados con la etapa de concordancia de camada de control (n = 9 a
TS23 y n = 6 a TS25). TS23 es la etapa en la que los centros primarios de osificación iniciar en los rudimentos de huesos
largos mayores [25], mientras que en TS25, los centros óseos se establecen y se avanza en los rudimentos de huesos
largos mayores [25].

El análisis morfológico

Los embriones fueron divididos en dos mitades a lo largo de la línea media del eje anterior-posterior, con un medio
manchado uno para cartílago y hueso utilizando azul alcian y rojo de alizarina tal como se detalla en Hogan et al. [26]. Las
muestras teñidas se fotografiaron, y los miembros anteriores y miembros posteriores se retiraron y se fotografió
individualmente de una manera consistente. Cualquier características anormales de los rudimentos del esqueleto y / o
articulaciones se registraron. La formación de hueso fue examinado con detalle en cinco elementos esqueléticos, es decir,
la hoja escapular, el húmero, el cúbito, el fémur y la tibia. Sólo un elemento distal de los miembros anteriores y miembros
posteriores se midió como la progresión de la osificación no mostro ser dramáticamente diferente entre elementos
adyacentes (por ejemplo, radio y cúbito, fig. 1). La pelvis no fue examinada debido a los daños que ocasionalmente se
produjo cuando los embriones se dividen por la mitad. Para cada uno de los cinco elementos esqueléticos, las mediciones
de la azul alcian y rojo alizarina tiñeron regiones que fueron tomadas en el aspecto ventral o dorsal para dar la longitud del
elemento esquelético y la longitud del hueso en cada rudimento, como se indica en la figura. 1. La extensión de la
mineralización en la espina de la escápula se midió también, como se indica entre las puntas de flecha en la figura. 2. Para
la mayoría de los rudimentos, la longitud era de la longitud máxima paralela al eje longitudinal del elemento esquelético.
Cuando una gran curvatura estaba presente, tal como se encuentra a menudo en la tibia, la longitud longitudinal se registró
como la suma de las longitudes de cada segmento de aproximación lineal. Con el fin de normalizar los cambios en la
longitud del rudimento al calcular un efecto sobre la calcificación, la proporción de cada rudimento ocupada por hueso se
calculó a continuación, para reflejar las posibles diferencias en la progresión de la osificación en relación con la longitud del
rudimento.

Adquisición y análisis de datos en 3D

Seis extremidades teñidas de cartílago al TS23 de cada uno de los dos grupos de mutantes sin músculo (Myf5nlacZ/nlacZ:
Myod-/-and Pax3Sp/Sp) y el mismo número de hermanos de camada de control se seleccionaron para la formación de
imágenes en 3D. Estos miembros fueron digitalizadas mediante tomografía óptica de proyección (OPT) [27] para obtener
los datos 3D sobre la morfología y distribución de azul alcian del tejido teñido (como se describe en [28,29]). La morfología
del tejido manchado se visualizó con luz visible y un filtro de 750 nm. Software (MAPaint) desarrollado y provisto por el
proyecto Atlas de ratón Edimburgo [30] fue utilizado para navegar a través de los datos 3D y ver las secciones virtuales a
través de dos articulaciones, la articulación del codo en las patas delanteras y la articulación femorotibial (rodilla) en el
miembro posterior (conocida como la babilla en los cuadrúpedos). Los datos 3D también se utilizaron para cuantificar el
tamaño de la tuberosidad humeral, la conicidad de la porción distal del húmero, y la quema de la tibia proximal y el radio. El
tamaño de la tuberosidad humeral se calculó mediante la normalización del área de la tuberosidad a la superficie total del
húmero, con las áreas medidas de virtuales secciones longitudinales tomadas en la anterior a posterior aspecto de las
reconstrucciones 3D del húmero, como se ilustra en la figura. 3. La disminución del grosor del húmero se midió por la
normalización de la anchura más estrecha (anterior a la cara posterior) del húmero distal en secciones longitudinales a la
longitud del húmero, como se muestra en la figura. 3. Ensanchamiento de la tibia proximal y el radio también se midió a
partir de secciones longitudinales mediante el cálculo de la relación de anchuras (de anterior a posterior) en las partes más
estrechas y más amplia de la tibia proximal y el radio, como se indica por líneas de puntos y numerados 1 y 2 en la figura. 1.

La figura. 1. Morfología bruto de los miembros anteriores y las posteriores de los grupos de mutantes Myf5nlacZ / nlacZ:
MyoD-/ - (MM) y Pax3Sp/Sp (SP) con la etapa con ajuste de control de camada en TS23 TS25 y (SP). Dobles flechas que
terminaron en los dibujos anatómicos muestran que las mediciones fueron tomadas de la longitud de rudimento. Se
muestran discontinuas (numeradas) líneas, en el radio y tibia donde las mediciones de ancho fueron tomadas de secciones
transversales de extremidades escaneadas de reconstrucciones 3D de OPT. Las barras de escala 1 mm.

Histología

Las extremidades de TS23 Myf5nlacZ/nlacZ: MyoD-/ -, Pax3Sp/Sp, Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -(muscular disminuida) y
compañeros de camada de control fueron fijadas en paraformaldehído al 4% a 4 º C durante la noche, se deshidrataron a
través de una serie de etanol y se aclaró en Histoclear-II (Diagnósticos Nacional), embebidos en cera de parafina pura
(Acros-organics, New Jersey) y se seccionaron a 10 μm utilizando una Leica RM2255 micrótomo. Las secciones fueron
recogidos en SuperFrost más de diapositivas y teñidas con hematoxilina férrica de Weigert, verde rápido y safranina-O (WIH
/ FG / SO). Las secciones recién fueron teñidas durante 30 s en preparados de hierro de Weigert de solución de
hematoxilina de trabajo, compuesta de proporciones iguales de solución A; 1% Hematoxilina (Fisher Scientific) en 95% de
etanol, y la solución B; 4 ml 29% de cloruro férrico, 1 ml de HCl concentrado y 95 ml de de agua. Las secciones después se
tiñeron con 0,02% de solución de Fast Green (Sigma) durante 5 min y luego en 0,1% de solución de safranina-O (Sigma)
durante otros 5 min.

La figura. 2. Anomalías escapular y humeral en los miembros que carecen de músculo esquelético en Myf5nlacZ/nlacZ:
MyoD-/ - (MM) y mutantes Pax3Sp/Sp (SP). En los embriones de control, la osificación de la espina escapular (flechas) y la
hoja de progreso escapular en el mismo grado (A), mientras que en los mutantes, la osificación de la espina de la escápula
se extiende más allá de osificación de la hoja, como se muestra en los paneles B y C. La escapulario del hueso se
encuentra a menudo a ser incompleta a través de la anchura de la hoja escapular como se muestra en el panel B, o ausente
de la cuchilla como se muestra en el panel C (región circular está calcificado base de espina de la escápula). El territorio de
la formación de hueso humeral se encontró que era irregular en los mutantes, con más en el aspecto posterior del
rudimento (E, F), en comparación con el collar de hueso normal que se ve en los controles (D). Las barras de escala 1 mm.

Métodos estadísticos

Los datos TS23 se analizaron en el paquete estadístico R (http://www.r-project.org/), último acceso el agosto de 2009), y en
T estándar se realizaron pruebas para comparar conjuntos de datos. La normalidad de los datos se verificó mediante
pruebas de Shapiro-Wilk, y la varianza de cada conjunto de datos fue probada por lo que la correcta t-test podría ser
utilizada. Un valor de p de menos de 0,05 se tomó como una diferencia estadísticamente significativa. El nlacZ Myf5 / nlacZ:
MyoD-/ -, Myf5 nlacZ / +: MyoD-/ - y Pax3 SP / Sp mutantes se compararon con los controles de la misma etapa de la
deformación equivalente, y pruebas t se usa también para comparar estos mutantes. Debido al tamaño pequeño de la
muestra, t-test no se realizaron en los datos Pax3 Sp / Sp TS25.

La figura. 3. Características del húmero en el control y las extremidades mutantes en TS23. El esquema indicativo de la
izquierda representa el plano de la sección longitudinal (anterior a la parte posterior, a, p) a través de reconstrucciones 3D
por ordenador de control y muestra de húmeros mutante. El tamaño de la tuberosidad humeral se midió mediante la
normalización del área de la tuberosidad (que se muestra en negro en la izquierda) con la superficie total del húmero (en
gris). El tamaño de la tuberosidad humeral se redujo significativamente (pb0.05) en la Myf5nlacZ/nlacZ: MyoD-/ - (MM)
mutantes en comparación con controles de la misma etapa-(flecha). Mientras que el tamaño de la Pax3 Sp / Sp (SP)
tuberosidades humerales no fue significativamente diferente a los de los controles, la forma de la tuberosidad fue diferente
(SP mutante). La conicidad de la porción distal del húmero se cuantificó mediante la normalización de la anchura más
estrecha de la porción distal del húmero (1) a la longitud más larga paralela del húmero (2). Se encontró que ambos tipos de
mutantes tenían significativamente menos (pb0.01) que se estrecha con los controles de sus hermanos de camada. Las
barras de escala 1 mm.

Resultados

Morfología bruto esquelético de las extremidades mutantes

Varias anomalías prominentes se observaron en las extremidades anteriores rudimentos del esqueleto de la
Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-and Pax3 SP / Sp mutantes, como se muestra en la figura. 1 y se enumeran en la Tabla 1. La
iniciación de osificación fue anormal en todas escápulas mutantes, con una serie de anomalías en las pruebas. En dos Pax3
Sp / Sp mutantes, calcificación de la hoja escapular no había comenzado aún, como se muestra en la figura. 2C, a pesar de
que la mineralización se había iniciado en los elementos más distales (radio y cúbito). En 4 de las 10 Myf5 nlacZ / nlacZ:
MyoD-/ - mutantes, y un 3 de 7 TS23 Pax3 SP / Sp mutantes, la región calcificada de la hoja escapular no se extiende a lo
ancho de todo el elemento (Figs. 1C y G). Todos los mutantes muestran una falta de coincidencia entre la osificación de la
hoja escapular y espina de la escápula, donde la calcificación de la columna vertebral parecía pariente más avanzada para
la osificación de la hoja, como se muestra en las Figs. 2B y C, en comparación con las escápulas de control de los
embriones en ellas calcificadas la cuchilla y la columna vertebral a la misma, o similar medida, como se muestra en la
figura. 2A. Análisis cuantitativo del desarrollo de hueso en los dos componentes de la escápula se presenta a continuación.
En el húmero, mientras que la región calcificada en el control de embriones forma una banda regular en torno a la media de
la diáfisis, un patrón anormal de calcificación se observó en diecinueve de cada veinte de las extremidades 'sin músculo'. En
estos mutantes sin músculo el hueso humeral formada como una región no uniforme en la media de la diáfisis, con
calcificación más extensa en el lado posterior del rudimento (Figs. 1C, G y K, y 2E y F) mientras que los territorios
mineralizadas en el radio y el cúbito parecía normal en forma. En la Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - mutantes, la tuberosidad
humeral apareció ausente, o muy reducido en tamaño (Fig. 1C), mientras que en los Pax3 SP / Sp mutantes de la
tuberosidad humeral no parece disminuido drásticamente en tamaño (Fig. 1K). No hay anomalías graves que fueran
evidentes en las patas traseras de la nlacZ Myf5 / nlacZ: MyoD-/ - y Pax3 SP / Sp mutantes (Fig. 1). En Myf5 nlacZ / +:
MyoD-/-embriones, que tienen una masa muscular reducida, sin alteraciones en el sitio de la morfología de osificación que
se observaran.

Tabla 1

La frecuencia de aparición de las anomalías esqueléticas más prominentes se observó en Myf5nlacZ/nlacZ: MyoD-/ - (MM)
y Pax3Sp/Sp (SP) mutantes.

Cambios en la forma en rudimentos esqueléticos en extremidades sin músculo el tamaño de la tuberosidad humeral se
cuantificó midiendo el área de las secciones longitudinales a través del eje anterior-posterior. Reconstrucciones por
ordenador en 3D de escaneados en extremidades manchados de azul alcian permiten secciones virtuales que deben
tomarse en la misma orientación al 6 Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ -, 6 mutantes Pax3 Sp / Sp y 6 controles para cada grupo
(todos TS23). La zona de la tuberosidad humeral en cada caso se normalizó a la zona del húmero en la misma sección. Se
encontró que el tamaño de la tuberosidad humeral se redujo significativamente en la Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes en
comparación con compañeros de camada control (pb0.05), como se ilustra en la figura. 3. No se encontraron diferencias
significativas en el área de la tuberosidad humeral entre Pax3 SP / Sp mutantes y controles, pero una diferencia en la forma
fue evidente en todos Pax3 Sp / Sp mutantes, cuyo tuberosidades humerales tendían a ser más largo, más delgado y
menos adjunta a la húmero que los compañeros de camada de control, como se muestra en la figura. 3.
La figura. 4. Reducción de la línea común en los miembros que carecen de músculo esquelético en Myf5nlacZ / nlacZ:
MyoD-/ - (MM) y Pax3Sp/Sp (SP) mutantes. La línea de la articulación del codo se reducen visiblemente en las
extremidades mutantes como se muestra en las fotografías de los rudimentos del cartílago teñidos de azul alcian (A-C),
vistas exteriores de las reconstrucciones en 3D de las articulaciones teñidas de azul alcian (D-F), las secciones virtuales a
través de la reconstrucciones 3D (G-I), y por los cortes histológicos que muestran la articulación húmero-cúbito (J-L) y la
articulación húmero-radio (M-O). La línea de la articulación de la rodilla no se reducen visiblemente, como se muestra en las
fotografías (P-Q) y las vistas exteriores de las reconstrucciones en 3D del tejido teñido de azul alcian(R-S). La línea de
articulación escápulohumeral del hombro se reduce, como se muestra en las secciones de reconstrucciones 3D del teñido
del tejido de azul alcian (T-U) y por secciones histológicas (V-W). Las secciones histológicas teñidas con hematoxilina
férrica de Weigert rápido / verde / safranina-O. Las barras de escala 200 μm.

Tabla 2

La desviación estándar media y la longitud del rudimento, la longitud de los huesos y la proporción de la longitud del hueso
a la longitud del rudimento en 'sin músculo' nlacZ Myf5 / nlacZ: MyoD-/ -(MM) mutantes, los mutantes con reducción
muscular (Myf5 + / nlacZ: MyoD - /) y compañeros de camada de control (controles mm) en TS23, y 'sin músculo' mancha
(Pax3 Sp / Sp) Mutantes y compañeros de camada control a TS23 TS25 y. los valores de p que se muestran indican una
diferencia estadísticamente significativa en los TS23 mutantes en relación con los compañeros de camada de control. t-
pruebas no se realizaron en TS25 datos debido al tamaño pequeño de la muestra. Las diferencias significativas entre los
grupos camada mutantes y el control están resaltadas en gris.

Diferencias en la forma también se observaron en el espesor y la conicidad del húmero distal y el radio proximal donde se
interconectan con la articulación del codo. La conicidad de la porción distal del húmero se caracterizó por la normalización
de la anchura en la parte anterior a la orientación posterior a la parte más estrecha de la porción distal del húmero a la
longitud del húmero, como se ilustra en la figura. 3. Se encontró que hubo un número significativamente menor conicidad
(pb0.01) del húmero distal en la Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-and Pax3Sp/Sp TS23 mutantes que en los hermanos de camada
de control, con los húmeros mutante que presenta una anchura más regular en el extremo distal de la extrema cónica distal
del húmero de control, como se muestra en la figura. 3. El ensanchamiento de la tibia proximal y el radio también se midió, y
se encontró que ambos mutantes en TS23 exhibió significativamente menos (pb0.01) abocardado en el extremo proximal
del radio que el medido en los controles, mientras que no hubo diferencias significativas entre los mutantes y controles se
encuentran en la quema de la tibia proximal.

Formación anormal de articulación de las extremidades sin músculo

Las regiones comunes fueron afectadas diferencialmente en las extremidades de los ratones carentes de músculo. En
TS23-protagonizaron Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - (MM) y Pax3 Sp / Sp (SP) de los ratones, el codo fue el más afectado,
con una reducción en la línea de la articulación del codo evidente en las fotografías superficiales (Figs. 4A-C), mientras que
la articulación de la rodilla parecía no afectada (Figs. 4P, Q). Las alteraciones en la articulación del codo fueron examinados
con más detalle utilizando reconstrucciones en 3D de extremidades manchadas de azul alcian y secciones histológicas.
Vistas exteriores de los rudimentos reconstruidas muestran una dramática reducción en la definición nítida en los territorios
del rudimento y la separación de los rudimentos en el codo (Fig. 4D-F), mientras que ningún cambio en la definición de los
límites fue visto en las articulaciones mutantes de la rodilla (Figs. 4R-S). Secciones virtuales a través de las
reconstrucciones en 3D del codo confirman la pérdida de una definición nítida en el tejido teñido de azul alcian (Figs. 4G-I).
Las secciones histológicas, se tiñeron con safranina-O, que mostró una pérdida completa de la organización celular de la
interzona entre los rudimentos cartilaginosos del codo en tanto Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - (MM) y Pax3Sp/Sp (SP)
mutantes (Figs. 4J-O). La separación normal entre los rudimentos de la articulación del codo se observó en el músculo
mutantes reducidos (Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -) (datos no mostrados). La articulación del hombro también mostró una
reducción en la línea de la articulación, y una alteración similar de la organización del tejido como se ve en el codo se
encuentra en la interfaz escápulohumeral de la articulación del hombro (Figs. 4T-W).

La figura. 5. Comparativa de 'muscular reducida "fenotipo (Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -), 'N fenotipo de músculo'
(Myf5nlacZ/nlacZ: MyoD-/ -) y compañeros de camada de control en el que el normal desarrollo muscular esqueléticos.
Diferencias estadísticas significativas (t-test, pb0.05) entre los grupos se indican mediante un asterisco (*). Rudimento
longitud, longitud de hueso y la proporción de rudimento compuesto de hueso se muestran para la escápula, húmero, el
cúbito, el fémur y la tibia. Números de muestras se dan en la Tabla 2.

El análisis cuantitativo de la extensión de la iniciación y la progresión del hueso en las extremidades sin músculo

Para comparar las primeras etapas de la osificación en las extremidades mutantes sin músculo y compañeros de camada
de control con masa muscular normal, tres parámetros se registraron para la hoja escapular, el húmero, el cúbito fémur y la
tibia de cada espécimen; estos parámetros fueron la longitud longitudinal del rudimento (longitud rudimento), la longitud
longitudinal de tejido calcificado en el rudimento (longitud de los huesos), y la proporción del rudimento compuesta de tejido
calcificado (proporción hueso) ( Tabla 2, Figs. 5 y 6). Se encontraron diferencias significativas para los tres parámetros de la
escápula, húmero y el fémur, y para la longitud y la longitud del hueso cubital en el Myf5nlacZ/nlacZ: MyoD-/ - TS23
mutantes, mientras la proporción cubital ósea y las tres mediciones de la tibia no mostraron diferencias significativas, como
se detalla en la Tabla 2, e ilustrado en la figura. 5. El grado de calcificación de la espina de la escápula también se midió, y
se encontró que no había diferencia significativa entre la Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes y los controles en la cantidad
de hueso en esta región de la escápula (no mostrado). Por lo tanto, el avance relativo de la osificación en la columna
vertebral en comparación con la hoja de la escápula se observó a partir de la figura. 1 se debe a una reducción en la
osificación en la hoja, y no es debido a un aumento en la formación de hueso en la espina de la escápula. No hubo
diferencias significativas entre el nlacZ Myf5 / nlacZ: MyoD-/ - mutantes (sin músculo) y Myf5 lanlacZ / +: MyoD-/ - (muscular
reducida) mutantes de la cantidad presente de hueso humeral (longitud de los huesos y la proporción), y para todas las tres
mediciones del fémur, mientras que la escápula, húmero y el cúbito no mostró diferencias significativas entre la sin músculo
y fenotipos reducida del músculo (Tabla 2 y Fig. 5.). Cuando el fenotipo muscular reducida se comparó con compañeros de
camada de control, se encontraron diferencias significativas para la longitud del cúbito, hueso escapular (cuchilla) y el hueso
humeral, mientras que todos los demás parámetros y los rudimentos no mostraron diferencias significativas a los
compañeros de camada de control (Tabla 2, la fig. 5). Al igual que el Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes, los
Pax3Sp/SpTS23 mutantes mostraron una disminución significativa en los tres parámetros de la escápula y el húmero, y
ninguna diferencia significativa en el hueso cubital o la proporción de hueso en la tibia (Fig. 6). En contraste con la Myf5
nlacZ / nlacZ: Myod-/-mutantes, los Pax3 SP / Sp TS23 mutantes no mostraron ningún cambio significativo en la longitud del
fémur, y mostró una diferencia significativa en la duración y la longitud de los huesos de la tibia, y la proporción de hueso en
el cúbito (fig. 6). Los Pax3 SP / Sp TS23 mutantes también tenían significativamente menos osificación de la espina de la
escápula, en comparación con los controles (pb0.05). Debido al tamaño pequeño de la muestra de los Pax3 Sp / Sp TS25
mutantes (n = 3), pruebas t no se realizaron. Sin embargo, las mediciones (como se detalla en la Tabla 2) indican que
algunos de los efectos observados anteriormente en desarrollo están todavía en evidencia en este punto de tiempo con
longitud reducida de rudimento y la formación de hueso impedido en la escápula, húmero, el cúbito y el fémur.

Como el húmero fue uno de los rudimentos más gravemente afectados, el análisis histológico se realizó para analizar el
centro de osificación primaria (POC) de TS23 sin músculo (Myf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - y Pax3 Sp / Sp), muscular reducido
(Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -) y el húmero control. Histología de los húmeros de control reveló dos frentes de condrocitos
hipertróficos, con degradación de la matriz indicativa de la deposición ósea en la media de la diáfisis (Fig. 7). Por el
contrario, una sola región, más uniforme de condrocitos hipertróficos fue detectable en theMyf5 nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - y
Pax3 SP / Sp mutantes, y el alcance de la POC todo en estos mutantes se redujo mucho en comparación con los de los
miembros de control, como se muestra en la figura. 7. La ausencia de evidencia de degradación de la matriz en el POC en
las extremidades mutante indica que la deposición ósea sustancial aún no había comenzado. El alcance de la POC en
ratones muscular reducida (Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -) Fue intermedia a los de los controles y mutantes sin músculo, y la
región diafisaria media fue más uniforme y homogénea que visto en los miembros de control (Fig. 7). Curiosamente, el
patrón en forma de cuña de la mineralización visto en húmeros mutante intacto (Figs. 1 y 2) no era tan evidente en la forma
de las zonas hipertróficas, uniformes a lo largo del eje anterior-posterior. En contraste con lo observado en el húmero, el
análisis histológico no reveló las diferencias entre los mutantes y las tibias de control (no mostrado).

La figura. 6. Las medias y las desviaciones estándar de Pax3sp/sp (splotch) en TS23 TS25 y con etapas del control
camadas pareados. Las pruebas t-se realizaron para sólo datos de TS23, como el tamaño del conjunto de datos TS25 era
demasiado pequeño. Las diferencias estadísticas significativas (t-test, pb0.05) entre TS23 mutantes y controles se indican
con un asterisco (*). Números de muestras se dan en la Tabla 2.

La figura. 7. El análisis histológico de los centros de osificación primaria en TS23 Myf5nlacZ / nlacZ: MyoD-/ - (MM),
Myf5nlacZ / +: MyoD-/ - (muscular reducida), Pax3Sp / Sp (SP) y humero. La orientación de control de las secciones es
como se indica en la esquina superior izquierda (D; distal, P; proximal, a; anterior, p; posterior). La zona de condrocitos
hipertróficos en la diáfisis media del húmero se reduce en las extremidades desprovistas de músculo (Myf5nlacZ/nlacZ:
MyoD-/ - (MM) y Pax3 SP / Sp mutantes (SP)) en comparación con controles de la misma etapa. Myf5 nlacZ / +: Myod-/-
embriones con muscular reducida tienen una zona hipertrófica que es intermedio en extensión entre el control y las
extremidades sin músculo. Las secciones teñidas con hematoxilina férrica de Weigert rápido / verde / safranina-O. Barras
de escala barras de 200 μm.

Discusión

En este estudio, el desarrollo esquelético se caracterizó en las extremidades de embriones de ratones mutantes que
carecen de músculo esquelético. Ambos tipos de mutantes sin músculo examinado (Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-y Pax3Sp/Sp)
mostró diferencias en el tamaño y la forma de los rudimentos, el patrón de aparición de sitios de osificación dentro de
rudimentos específicos y la separación de los rudimentos en articulaciones específicas. Un análisis cuantitativo de la
osificación en un número de rudimentos ósea reveló significativamente menos hoja escapular, el húmero, el cúbito y el
fémur, pero ningún cambio significativo en la progresión de la osificación en la tibia en ambos mutantes sin músculo. La
morfología de los centros de osificación se vio afectado en la escápula y húmero, con regiones calcificadas no uniformes o
ausente en las escápulas de mutantes, y no uniforme morfología del hueso en el húmero. El análisis histológico del centro
de osificación primaria en el húmero reveló una reducción en el tamaño de la región hipertrófica e impedido progresión de
las placas de crecimiento. En ambos modelos de ratón sin músculo, sitios de osificación se vieron afectados
diferencialmente, con una tendencia que indica que la formación de hueso puede ser más gravemente afectados en los
elementos proximales que en los elementos distales (escápula y el húmero vs cúbito), y que calcificación de los huesos
largos principales de la extremidad anterior puede depender más de las contracciones musculares que en los elementos de
los miembros posteriores (por ejemplo, cúbito vs tibia). El desarrollo conjunto y la forma del rudimento también mostraron
efectos diferenciales de la musculatura ausente. La articulación del codo es afectada por la falta de músculo esquelético,
con una reducción dramática en la definición de los territorios del rudimento y la separación de los rudimentos, mientras que
ningún cambio en la definición o la separación se vio en la rodilla mutante (reprimir) empalmes. La forma de varios
elementos se vio afectada, con los mutantes que presentan menos conicidad de la porción distal del húmero y menos
quema de la radio proximal, pero sin cambios la quema de la tibia proximal. El tamaño de la tuberosidad humeral se
encontró que se reduce en todas las Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes, y mientras que el tamaño de la tuberosidad no se
vio afectada en los Pax3 SP / Sp mutantes, la forma fue alterada en comparación con los controles. Un mutante en el que
se reduce la musculatura de la extremidad, pero no ausente se examinó también (Myf5 nlacZ / +: MyoD-/ -). El fenotipo de
'muscular reducida "produjo un efecto intermedio en los miembros, con un cúbito corto y óseo significativamente menos
escapular y humeral que en compañeros de camada control (como también se observa en la sin músculo Myf5 nlacZ /
nlacZ: Myod-/-miembro), pero con todas las demás mediciones del fenotipo muscular reducida, no mostró diferencias
significativas con los controles.

Hemos descrito cómo la falta de músculo esquelético afecta el desarrollo del esqueleto en TS23, la etapa de desarrollo en
que los centros de osificación forman los huesos largos principales. Algunos de los hallazgos de la TS23 se correlacionan
con las etapas de desarrollo posteriores, como la escápula y el fémur más corto reportado por Rot-Nikcevic et al. [17] y el
cúbito más corto descrito por Gómez et al. [19]. Estudios anteriores [17,19] informó de que las longitudes de los rudimentos
diferentes no fueron igualmente afectados por la falta de músculo en los embriones en etapa posterior, y que muestran
resultados similares a TS23, tales como la reducción significativa en la duración de la escápula, húmero, cúbito y fémur pero
no de la tibia en la Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes. Gómez et al. [19] informó de húmeros y fémures más grueso en sin
músculo E18 mutantes, mientras que en TS23, se encontró que la falta de músculo tenía un efecto diferencial en la forma
de los rudimentos, con el húmero distal y cúbito proximal significativamente afectadas pero con ninguna diferencia
significativa en la tibia proximal. En contraste con los resultados de estudios previos [17,19] que la tuberosidad humeral está
ausente en los ratones sin músculo en E18-18.5, nuestros resultados demuestran que la tuberosidad humeral está presente
en TS23, aunque de tamaño reducido en la Myf5 nlacZ / nlacZ: Myod-/-mutantes. Esto indica que la iniciación de la
tuberosidad humeral se produce, pero el mantenimiento y el crecimiento externo de la tuberosidad puede ser dependiente
de la estimulación mecánica de los músculos en el Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes. La forma pero no el tamaño de la
tuberosidad humeral era alterado en los Pax3 Sp / Sp mutantes, lo que sugiere que la tuberosidad humeral puede verse
afectada por la presencia de células progenitoras musculares en la Myf5nlacZ/nlacZ: Myod-/-mutantes, o por los resultados
específicos de las lesiones genéticas diferentes.

Se muestra que la iniciación y la progresión de huesos largos de centros de osificación son diferencialmente afectadas por
la ausencia de músculo esquelético con una formación ósea anormal y reducida en algunos, pero no en todos los
rudimentos. Gómez et al. [19] informó de que la osificación está igualmente desarrollada y estructurada en los dígitos de los
embriones mutantes y el control en E18. Como osificación en los dígitos no se inicia hasta TS25, no analizamos la
progresión de la formación de hueso en estos rudimentos en nuestros animales. Es posible que la osificación de los dígitos
es afectada por la falta de músculo esquelético, como se encontró para la tibia en nuestro estudio, o, alternativamente, que
las diferencias en el desarrollo de huesos similares a los que hemos observado ya no son evidentes por la etapa posterior
de E18.

Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que los rudimentos en desarrollo están afectadas diferencialmente por
la ausencia de músculo esquelético de las extremidades, para el crecimiento del cartílago, la formación ósea y el desarrollo
conjunto, lo que indica una relación compleja entre esqueletogénesis y el entorno biofísico. El estudio comparativo de varios
rudimentos muestra una correlación interesante entre la gravedad de efecto y la posición del rudimento en el eje
anteroposterior (extremidad anterior vs miembro posterior) y el eje proximodistal. El omóplato (lámina) y el húmero fueron
severamente afectados en los mutantes sin músculo, con alteraciones en la morfología de centros de osificación, y los
cambios en las longitudes de los rudimentos cartilaginosos y las regiones calcificadas. La hoja escapular y humeral regiones
óseas parecen ser altamente dependiente de ciertos niveles de estímulos biofísicos inducidos por contracciones
musculares, como su osificación se ve afectada incluso cuando una cantidad reducida de músculo está presente, mientras
que otros rudimentos no se ven significativamente afectados. En los Myf5 nlacZ / nlacZ: Myod-/-mutantes, mientras que la
cuchilla de la escápula se vio afectada significativamente, la espina de la escápula no lo era. Curiosamente, parece que el
efecto de músculo ausente puede depender de origen embrionario de las células, como la escápula tiene un origen
embrionario dual; siendo la columna vertebral somatopleura y la cuchilla son de origen somite [31]. Formación conjunta fue
también afectadas diferencialmente, como el análisis histológico mostró cómo la organización celular se perdió casi por
completo en la articulación del codo mutante, y datos en 3D reveló una clara línea de la articulación de la rodilla mutante
(reprimir), pero no en el codo.

Los efectos diferenciales de músculo esquelético en la esqueletogénesis descrito en este estudio podrían ser debido a los
cambios de las fuerzas mecánicas, o a la falta de factores tróficos de los órganos musculares, o a una combinación de
estas influencias. Sin embargo, los efectos visto en el fenotipo intermedio del "músculo reducida" (Myf5nlacZ / +: MyoD-/ -),
indican que los efectos en las extremidades mutantes son poco probable que sea desde factores tróficos del músculo
solamente. El hecho de que algunos aspectos del fenotipo del "músculo reducida" fueron normales, como la formación de
las articulaciones y osificación de extremidades posteriores, puede implicar que un umbral mínimo de fuerzas mecánicas
debe alcanzar para el desarrollo normal del esqueleto. Es posible que las fuerzas debidas a las contracciones musculares
sean complementadas por la estimulación mecánica externa, tal como los efectuados por las fuerzas de las contracciones
uterinas, o por el movimiento de la madre y hermanos de camada en el útero. Ciertas regiones de la extremidad en
desarrollo pueden estar sujetos a mayores fuerzas "externos", y los estímulos biofísicos inducidas por estas fuerzas podrían
ser lo suficientemente alta como para compensar (al menos en parte) por la falta de esquelético muscular en elementos
tales como la tibia. Planificaron análisis de elementos finitos va a caracterizar los niveles de estímulos biofísicos en los
diversos elementos del esqueleto para el control y la reducción de las extremidades del músculo, y puede ofrecer pistas
sobre cómo el entorno mecánico alterado puede producir una serie de efectos sobre la formación de hueso.
Alternativamente, es posible que un "umbral" al mínimo de fuerzas mecánicas varíe dependiendo de la ubicación en la
embrionaria de las extremidades, lo que significa que algunos partes de la extremidad en desarrollo son más sensibles a la
estimulación mecánica que otros debido al contexto molecular en esa región. Se ha demostrado que ciertos genes
reguladores se expresan de forma diferente en el temprano desarrollo de extremidad anterior y miembros traseros, con una
encuesta de Wnt patrones de expresión génica en el primordio de la extremidad que muestra diferencias en la distribución
de transcripción entre patas delanteras y patas traseras [29] y un análisis del genoma de ancho de transcritos expresados
diferencialmente en el primer plano y las patas traseras que demuestra diferencias en la utilización de FGF, el erizo y las
moléculas de la familia BMP de señalización [32]. Por lo tanto, la variación en el contexto molecular de desarrollar
rudimentos del esqueleto en diferentes partes del primer plano y el desarrollo de las extremidades posteriores pueden influir
en el impacto del entorno mecánico alterada resultante de la ausencia de los músculos.

En conclusión, el desarrollo del esqueleto es diferencialmente afectado por la falta de músculo esquelético, con algunos
rudimentos, sitios de osificación y las articulaciones están más afectados que otras. Estos resultados indican una
interacción compleja entre fuerzas mecánicas y específicos de la ubicación de factores reguladores que influyen en el
desarrollo óseo y articular. Los resultados tienen implicaciones para la ingeniería de tejidos de hueso y el cartílago articular,
ya que implica que las células mesenquimales en las extremidades embrionarias pueden responder de forma diferente a
los estímulos biofísicos, dependiendo de su ubicación y el medio ambiente.