HERRAMIENT FUNDAMENTO
A PROTOCOLO
CLONACIÓN Aislar un fragmento de ADN de interés e insertarlo
MOLECULAR en un plásmido (vector) y obtener múltiples copias
de ello en un organismo generalmente procariota
por acción de la ADN polimerasa.
HIBRIDACIÓN Unión de dos moléculas monocatenarias de los
MOLECULAR ácidos nucleicos por la complementariedad de sus
bases nitrogenadas dando origen a una cadena
bicatenaria
Las cadenas de ácidos nucleicos provienen de dos
moléculas diferentes, dando lugar a la hibridación
de ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN.
Sothern Blod Es la técnica por la que se transfiere el ADN desde
el gel de agarosa o poliacrilamida a una membrana
de nylon o nitrocelulosa
Northern
FASES
1. Elección del organismo huésped y el
vector de clonación
2. Preparación del ADN del vector
3. Preparación del ADN a clonar
4. Creación del ADN recombinante
5. Introducción del ADN recombinante en
el organismo huésped
6. Selección de los organismos que
contienen ADN recombinante
Detección de clones con insertos de ADN
deseado y propiedades biológicas
ARN:
Northern Blod convencional
Northern Blod reverso (microarray)
Hibridación in situ
ADN:
Southrn Blod
Análisis de genotecas
Restricción para generar varios fragmentos
de ADN
Electroforesis en geles de agarosa
Desnaturalización que permite la unión a la
membrana de nitrocelulosa (UV, NaOH)
Transferencia al papel filtro por capilaridad
Hibridación con sonda específica
Lavados y visualización de la sonda por
autoradiografía
No se realiza digestión enzimática para
APLICACIONES DESVENTAJAS
 Toma de las huellas dactilares
 producción de proteínas a gran escala
 Conocer la función de determinados genes a
través de la deleción, inserción y
transposición de ciertos genes en distintos
organismos
 Usar promotores para estimular la actividad
de determinados genes.
 Mediante la manipulación genética se
puede obtener animales que padezcan
enfermedades análogas a las humanas para
simular dichas enfermedades y pruebas
preclínicas de medicamentos y terapias para
combatirlas.
 Fabricación de Productos Terapéuticos
 Terapia Génica
 industria, a la resistencia de alimentos, a las
plagas sin pesticidas, animales mejorados y
más eficientes, animales de compañía
mejorados genéticamente que son
hipoalergénicos.
 Detectar secuencias puntuales de ácidos nucleicos
o dianas (ADN o ARN) con la utilización de Sondas
Marcadas.
 Fertilización in vitro.
 Producción de biológicos (proteínas, anticuerpos
monoclonales, hormona, enzimas).
 Producción de fármacos y vacunas.
 Transgénesis parcial: Terapia génica en humanos.
 Estudios de genotoxicológicos.
 Estudios de aberraciones cromosómicas adquiridas
y congénitas.
 Diagnóstico de enfermedades moleculares,
infecciosas, hereditarias.
 Test de paternidad.
 Reconocimiento de identidad en la ciencia forense.
Esta técnica permite la detección de ARN
Blot obtener fragmentos de ARN
Electroforesis en condiciones
desnaturalizantes:
geles de agarosa con formaldehido,
muestra de ADN se diluye en tampón con
farmamida y formaldehido y se calienta a 65
grados centígrados.
No se necesita el paso de desnaturalización
para la transferencia del gel a la membrana.
La transferencia, la hibridación y el revelado
es similar a Southern blot.
REACCIÓN Técnica de laboratorio utilizada para amplificar Se desarrolla en 3 pasos básicos que se
DE LA secuencias de ácidos nucleicos como: ADN, ARN repiten de 25 veces o más:
CADENA DE El propósito de la PCR es hacer muchas copias de Desnaturalización
POLIMERASA un fragmento específico de ADN o ARN, se realiza (95° 1 MIN) Apariamiento o hibridación
PCR esta amplificación teniendo un mínimo de material (Anneling) (54°-45 SEG)
genético disponible  Polimerización o extensión. (72° 2
MIN)
 La amplificación de ácidos nucleicos in
vitro se realiza por medio de la
polimerización de las cadenas de éstos
ácidos en un equipo conocido como
termociclador.
 Para iniciar el procedimiento se
prepara la mezcla que esta compuesta
de:
 La polimerasa que se utiliza
actualmente es la Taq polimerasa
obtenida de la bacteria Thermus
acuaticus.
 La detección del producto de la PCR se
realiza por lo general mediante un
corrido electroforético.
 Dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución que
deseamos, utilizamos diferentes
medios (agarosa, poliacilamida) a
distintas concentraciones.
 La posterior visualización se puede
realizar por bromuro de etidio, syber
safe, tinción de plata, fluorescencia,
radioactividad en lámpara de luz UV o
en el fotodocumentador (Chimidoc).
específicos separados por electroforesis a
través de sondas marcadas.
 La PCR es la técnica que ofrece como  La principal desventaja es
principal ventaja general millones de copias la necesidad de
de la región de interés a partir de un estandarizar la técnica
fragmento de ADN (ARN)
para el organismo o la
 A partir de una muestra pequeña de ADN o
ARN se puede obtener una cantidad técnica de interés, lo cual
suficiente para realizar un estudio. puede ser tardado y
 Es una técnica robusta debido a la capacidad costoso.
de los oligonucleótidos iniciadores o primers  Se puede reproducir
de unirse firme y complementariamente a la solamente partes del
región diana aislando fácilmente ésta genoma, en donde se
molécula en medio de millones de
conoce por lo menos una
fragmentos de ADN.
 El proceso se puede utilizar para clonar, mínima secuencia de 20 a
secuenciar y analizar muestras de ácidos 40 pb
nucleicos.  Se necesitan cebadores
 Se puede amplificar el ADN de cualquier (primers) específicos que
organismo vivo o muerto. sean complementarios al
 La PCR es la técnica más importante en la fragmento que se desea
biología molecular porque con ella se ha
amplificar.
logrado la simplificación e innovación de
muchas técnicas moleculares que permiten  Al momento de la
abordar nuevas líneas de investigación en polimerización puede
diferentes ramas de la ciencia como: darse errores al sintetizar
biotecnología, ecología, evolución, biología el ADN.
de la conservación, arqueología, patología,  Puede contaminarse con
medicina clínica y forense, entre otras. otro ADN o molécula (ARN
 Diagnóstico molecular, análisis prenatales, o proteínas) que puede ser
terapia génica, genotipificación, ancestría,
del mismo investigador o
filogenia, farmacogenómica, pruebas de
paternidad y pruebas de identificación en cualquier otro.
criminalística.
SECUENCIACI determina el orden de los nucleótidos de un
ÓN fragmento de interés.
Secuenciació El principio de esta secuenciación es que el ADN
n Sanger polimerasa no puede añadir nucleótidos a una
cadena de ADN en crecimiento una vez que se
incorpora un análogo nucleotídico o sea un ddNPT
que carece del grupo hidroxilo en posición 3
MICROARRE expresión de varios genes a la vez, esta técnica
GLOS utilizada en biología molecular y las ciencias
genómicas
 determina el orden de los nucleótidos
de un fragmento de interés.
 Los resultados de la secuenciación se
leen en un electroferograma o
cromatograma
El trabajo con microarreglos podemos
dividirlo en cuatro etapas: (figura. 1)
1Selección del tipo de microarreglo y de las
secuencias que se colocarán en el soporte.
2Obtención de la muestra biológica.
2.1 Purificación del ADN o ARN.
3. Amplificación del material genético (RT-
PCR).
3.1 Marcaje de la muestra problema.
4. Hibridación del microarreglo.
4.1 Captura de resultados.
 4.2 Análisis de resultados.
 Análisis de desordenes en una 
muestra.
 VENTAJAS TESTS MOLECULARES
 Igual técnica para el diagnóstico de
patologías.
 La presencia de una única mutación
para algunas patologías facilita el
diagnóstico.
 Los resultados son objetivos y
definitivos.
 Se puede predecir el fenotipo desde el
genotipo en algunos desordenes.
 Estas técnicas no son afectadas por
factores como: prematuridad,
nutrición o edad.
 Toma de muestra no invasiva.
 Resultados relativamente rápidos.
 Permite individualizar el tratamiento
basado en el genotipo.
 Posibilidad de realizar diagnóstico
prenatal y estudio de portadores
 Detección de mutaciones. 
 Secuenciación de ADNs fósiles.
 Diagnóstico de enfermedades
genéticos.
 Identificación de especies y control de
cruces entre animales.
 Proyecto de Genoma Humano.
 medición y cuantificación de la expresión génica e 
identificación de mutaciones en genes específicos
para el diagnóstico de enfermedades, también en la
investigación biomédica, debido a que permite
analizar diferentes tipos de muestras
biológicas(tejidos, proteínas y material genético) y
miles de moléculas de manera simultánea por cada
ensayo
 pueden ajustarse para explorar el perfil de
expresión de genes en un organismo en diferentes
circunstancias biológicas y terapéuticas.
 En los estudios de expresión génica hibridando en
microarreglo con ADNc se puede saber que genes
se expresan y con que intensidad.
 Nos permite observar la expresión de miles de
genes del genoma de un organismo
 Podemos identificar genes que producen ciertas
enfermedades mediante la comparación de los
niveles de expresión entre células sanas y células
que están desarrollando ciertos tipos de
enfermedades.
POLIMORFIS presencia en la misma población de dos o más
MOS alelos en un mismo locus, con una frecuencia del
1%. Es una serie de fenotipos alternativos
normales y comunes.
La mayoría de los polimorfismos no tienen efecto
sobre el fenotipo (caen en regiones no
codificantes).
Pero, algunos pueden afectar nuestro fenotipo
(Estatura: alta/baja; el color del cabello:
claro/oscuro; el color de ojos)
Un número muy pequeño de polimorfismos son
responsables de enfermedades genéticas (Ej: 1/20
habitantes de Europa del Norte portan el gen de la
Fibrosis Quística)
Microsatélite también conocido como SSR (repeticiones de
s secuencia simple) son disposiciones de
repeticiones tanden de una secuencia simple,
generalmente inferior a 10pb.
SNP Son cambios de un solo nucleótido que ocurren en
el genoma en una ubicación particular. El
 MICROSATÉLITES: (Dinucleotide
Microsatellite Repeat Polymorphism)
Repeticiones de un par de nucleótidos
en regiones no codificantes.
 SNP: ( Single nucleotide
polimorphism)Polimorfismo de
nucleótido simple.
 VNTR: (Variable Number of Tandem
Repeats) Repeticiones en tándem de
número variable.
 RFLP: (Restriction long fragment
polimorphism) Fragmentos largos de
restricción.
 
 
Los polimorfismos genéticos pueden ser 
usados como marcadores para ayudar a
esclarecer ciertos patrones y/o procesos
biológicos; además, pueden establecer
parentescos.
También se puede determinar la cantidad
de entrecruzamiento entre diferentes
grupos de la misma especie (flujo genético),
y la información puede ser usada para
identificar poblaciones únicas,
potencialmente importante para la
sobrevivencia de la especie.
El método es conocido como “huellas de
ADN” y representa una herramienta
importante en medicina forense y en
procesos jurídicos, porque si se analizan
suficientes polimorfismos es posible
distinguir diferentes individuos con alto
grado de certeza.
Identificación individual: Medicina forense,
el genotipo de una persona o su huella de
ADN, puede ser determinado a partir de
muestras muy pequeñas (cabello, sangre,
células de la piel, etc.)
También, el análisis de los polimorfismos
puede ayudar a probar la paternidad en
situaciones de disputa.
Análisis de ligamiento: Este análisis de
ligamiento o escaneo genómico es un
método en el cual se hace una búsqueda
aleatoria en el genoma para tratar de
encontrar los genes asociados a una
enfermedad.
El genotipo de la muestra encontrada en
una escena de un crimen puede ser
comparado con el genotipo del individuo
“sospechoso”. Criminalística
 polimorfismo de un solo nucleótido es la forma
más común de variación genética
VNTR Son repeticiones en tanden de secuencias entre 2
a 5 nucleótidos , están distribuidos de forma casi
homogénea por todo el genoma y presentan un
número elevado de alelos con frecuencias
similares entre sí, de forma que la probabilidad de
que un individuo sea heterocigoto es muy elevada.
RFLP Los fragmentos de restricción de longitud
polimórfica, son un tipo de polimorfismo que
resulta de la variación en la secuencia de ADN
reconocida por las enzimas de restricción, estas
enzimas cortan fragmentos de ADN en lugares
conocidos y específicos.
HUELLA Es una técnica llamada prueba de ADN o análisis
GENÉTICA de ADN, se utiliza para distinguir a dos individuos
de la misma especie a través de muestras de su
ADN.
 
 Los RFLPs se han utilizado y han sido muy
 La técnica se basa en analizar dos
individuos que tienen gran parte de su
secuencia de ADN en común y para
distinguir a estos dos individuos se
puede explorar la repetición de
secuencias altamente variables
llamadas minisatélites.
 Estos dos individuos no emparentados
será poco factible que tengan el
mismo número de repeticiones o
minisatélites.
 comparación de muestras de

útiles como marcadores de localización en el
ADN genómico humano de sitios
particulares, de una serie de cuatro a ocho
nucleótidos que son un sitio donde una
enzima de restricción de bacteria puede
unirse y cortar el ADN. Esto es útil para
observar características de la secuencia del
ADN donde se une la enzima de restricción
o no, y ver las diferencias entre las personas
al tener o no el sitio donde se une la enzima.
 Esta técnica nos permite establecer 
una selección, que es muy poco
probable que haya surgido por
casualidad, salvo en el caso de
gemelos, que tendrán idénticos
perfiles genéticos pero no las huellas
digitales.
 Ciencia Forense: Comparar a un
sospechoso con muestras de sangre,
cabello, saliva o semen.
 Identificación de restos humanos por
familiares.
 Pruebas de paternidad.
 Estudio de compatibilidad en donación
de órganos y tejidos.
 Estudio de evolución de animales
salvajes, estudio de composición de
alimentos.
 Generación de hipótesis de
migraciones humanas e identificación
de migrantes.