UNIVERSIDAD NACIONAL «SAN LUIS GONZAGA» DE ICA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Biotecnología
Molecular

Dra. Rosa Altamirano Díaz

CONCEPTO
Aplicación de organismos o componentes
(proteínas, ADN, ARN) obtenidos por tecnología
del DNA recombinante o Ingeniería Genética
para obtener productos o servicios.
 Creación de bases
de datos
de ADN y péptidos

Producción de
SOMATOSTATINA
en bacterias

Sintesis enzimática
del ADN por PCR
Taq Primer genoma
Inicio de la
ingeniería genética secuenciado

50s 60s 70s 80s 90s 2000s

Primera proteína
terapeutica producida por
ingeniería genética
El codigo genético Clonación del primer
Es controlado. animal

Era de la genómica funcional

Chips de DNA
Diagnóstico molecular
Farmacología molecular
Biomedicina
 INGENIERÍA GENÉTICA

La Ingeniería Genética
Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo
que carece de ellos

Se realiza por

Incluye
Enzimas de restricción
Capaces de cortar el ADN por puntos
concretos
Técnicas biotecnológicas
•Recombinación de ADN
•Secuenciación del ADN
Se obtiene •Reacción en cadena de la polimerasa
•Aplicaciones diversas

ADN Recombinante
Segmento de ADN extraño intercalado
en un ADN receptor
 INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA

APLICACIONES

Obtención de productos
Medicina forense
farmacéuticos
Marcadores
Insulina genéticos
Interferón Huella genética
H. De crecimiento
Factor VIII
Terapia génica
Diagnóstico de Inserción de genes
enfermedades funcionales para corregir
un defecto genético
Detección en personas o
fetos enfermedades
En células germinales
hereditarias por técnicas
de ADN recombinante En células somáticas
 SISTEMAS DE EXPRESION
PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES

Vectores de clonamiento:
permiten insertar secuencias de DNA (pBluescript, pBR322, pTOPO,
pGMT).
Enzimas de restricción.
Uso de enzimas de corte poco frecuente.
Fragmentos de ADN de genes de interés.
Secuencias génicas con regiones regulatorias.
Amplificados mediante PCR.
Secuencias génicas sin regiones regulatorias. Marcos de lectura abiertos
(ORF).
 SISTEMAS DE EXPRESION
PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES

Huéspedes de clonamiento:
células que reciben vectores de clonamiento. E. coli JM109, DH-5α

Vectores de expresión:
permiten sobreexpresar
los genes clonados
(pET-21a-d; pBAC)

Huéspedes de expresión:
células que pueden sobreexpresar un gen clonado en un vector de expresión.
E. coli JM109(DE3)
Esquema para la producción de proteína
recombinante

Producción del vector recombinante.

(Vector y DNA cortado con enzimas de
restricción y su posterior ligación)

Transformación de células de E. coli

Células de E. coli transformantes

creciendo en el medio

IPTG
Inducción de proteína recombinante
8
REQUERIMIENTOS PARA LA EXPRESIÓN DE UN GEN

1. El gen se transcriba y traduzca.

2. Un promotor para el inicio de la transcripción y un
terminador.
3. Una RNA polimerasa compatible con la célula
hospedera. El sistema del promotor puede ser
regulado con IPTG o cambiando la temperatura
(promotores termosensibles).
4. Que la proteína sea activa y se secrete.
 PROBLEMAS COMUNES EN LA PRODUCCION DE
PROTEINAS RECOMBINANTES

1. La proteína recombinante puede ser degradada por

enzimas proteolíticas de la célula huésped.
2. Formación de cuerpos de inclusión.
3. Plegamiento apropiado de las proteínas y actividad.
4. Modificaciones postraduccionales.
5. Estabilidad del vector. Degradación por sistemas
de restricción.
Producción de proteínas humanas con fines farmacéuticos
Ventajas:

1. Conseguimos compuestos imposibles de sintetizar

químicamente.

2. Obtenemos grandes cantidades, por la mayor velocidad

de crecimiento de los microorganismos con respecto a
otros seres vivos.

3. Las proteínas producidas son idénticas a las humanas,

por lo que desaparecen los problemas de rechazo
inmunológico.
 EXPRESION DE GENES EN HUESPEDES
BACTERIANOS

USO DE BACTERIAS

1. Simplicidad.
2. Tiempo de generación corto.
3. Alto rendimiento a bajo costo. B. subtilis puede
excretar el producto al medio de cultivo.
 EXPRESION DE GENES EN HUESPEDES
BACTERIANOS

INCONVENIENTES
1. Productos con actividad biológica inestable
2. Modificaciones postraduccionales para procariontes.
- Formación de enlaces disulfuro.
- Ruptura proteolítica de precursores (eliminación de secuencias
específicas para generar proteínas activas.
- Glicosilación (adición de azúcares) en residuos de serina,
treonina, asparagina.
INCONVENIENTES

3. Purificación insuficiente. Producto final con compuestos

bacterianos tóxicos.
4. La proteína debe ser idéntica a la proteína natural: propiedades
bioquímicas, físicas y funcionales.
5. Cuerpos de inclusión: proteínas inactivas.
6. Proteínas recombinantes tóxicas para la célula huésped.
 Uso de Escherichia coli como huésped
• Es el microorganismo mejor estudiado
• No patógeno
• Fácil de cultivar en medios baratos
• Crecimiento rápido

Desventajas
Ventajas Las proteínas no son secretadas
Genética bien conocida. Contienen endotoxinas
Mecanismos regulatorios No realizan modificaciones post-
conocidos traduccionales para eucariontes
Crecimiento rápido y fácil Posibilidad de plegamiento incorrecto de
Medios de cultivo baratos proteínas
Altos niveles de expresión La separación de células puede dañar las
proteínas
 Producción de insulina humana
La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están
codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener
en cultivos bacterianos separados.
Proteína de fusión con subunidad A
Promotor del gen de la insulina
Corte CNBr

Subunidad A del Enlace

gen de la insulina disulfuros
Transformación Extracción de Separación de
en E. coli las proteínas de los polipéptidos
fusión AyB
Promotor

Formación
Proteína de fusión
de insulina
con subunidad B del
Subunidad B del activa
gen de la insulina
gen de la insulina
 EXPRESION DE GENES EN CELULAS EUCARIONTES

a. Introducción de DNA en el interior de células bacterianas y levaduras:

transformación.
b. Introducción de DNA exógeno en células animales: transfección.

Uso de vectores similares a los utilizados con bacterias:

1. Marcadores de selección.
2. Secuencia promotora eucarionte.
3. Sistema de transcripción y traducción eucarionte.
4. Secuencia señal de poliadenilación del RNAm transcrito.
5. Los vectores pueden insertarse en el genoma (recombinación
homóloga)
 SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE Saccharomyces cerevisiae

Razones de uso:
1. Células eucariontes como de mamíferos.
2. Genética y fisiológicamente conocida.
3. Es posible su cultivo a gran escala.
4. Se conocen muchos promotores.
5. Capaz de realizar modificaciones postraduccionales.
6. Proteínas heterólogas son liberadas extracelularmente.
7. Es un organismo seguro (GRAS) de uso industrial.
DESVENTAJAS:
La presencia de proteasas activas puede reducir el rendimiento del
producto. Existen huéspedes modificados deficientes en algunas
proteasas.

Técnicas para transformar levaduras:

1. Generación de protoplastos: remoción de las paredes en forma
química o enzimática.
2. Tratamiento con acetato de litio.
3. Electroporación.
Producción de Hepatitis B recombinante.

Antígeno de superficie viral HbsAg ( 3.2

kb) rendimiento 1 a 2%. A gran escala 50
– 100 mg/l.
 Productos recombinantes producidos por levaduras

Vacunas:
1. Hepatitis A y B.

2. Malaria (proteína de esporozoide).

Antígenos para diagnóstico:

1. Hepatitis C (proteína viral).
2. Antígenos de HIV-1.

Agentes terapéuticos:
1. Insulina.
2. Factores de crecimiento de fibroblastos
3. Alfa antitripsina y Factor XXIa de coagulación sanguínea
SISTEMAS DE EXPRESION EN CELULAS DE INSECTOS

USO DE BACULOVIRUS
 Infecta 30 especies de insectos.
 Uso como vector de expresión.
 Baculovirus recombinante AcMNPV (Autographa california
multiple nuclear polyhedrosis virus).
 Larvas de Trichoplusia infectadas con AcMNPV portando cDNAs
de adenosina deaminasa humana ( 9 mg/l de producto purificado.
Rendimiento 2 a 5 %.)
SISTEMAS DE EXPRESION EN CELULAS DE INSECTOS

VENTAJAS:
1. Sobreexpresión de producto.
2. Plegamiento correcto de proteínas.
3. Modificaciones postraduccionales similares a células humanas.

PROBLEMAS:
1. Limitaciones para llevar a gran escala.
2. Equipamiento especializado.
 SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN CELULAS DE MAMÍFEROS

Líneas celulares (HELA)cuando no se pueden producir en otros sistemas.

Medios de transfección de células animales.

1. Incubación del DNA con células coprecipitadas con fosf. de calcio o con
DEAE-dextran.
2. Electroporación.

Otras formas:
1. Uso de virus como vectores de expresión: BKV, SV40, poliomavirus.
2. Vectores puente: sistemas de expresión con genes virales y plasmidios de E.
coli. Sistema DHFR-MTX.
Mantenimiento de virus por muchas generaciones.
SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN CELULAS DE MAMÍFEROS

VENTAJAS:
Se logran proteínas recombinantes funcionales.

DESVENTAJAS:
1. Se requiere equipamiento sofisticado.
2. El personal debe ser altamente calificado.
3. Los costos de producción son elevados.
 VACUNAS POR TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

Desventajas de las Vacunas tradicionales:

1. No todos los organismos pueden crecer a grandes volúmenes.
2. Son considerados no seguros.
3. Las cepas atenuadas pueden revertir a estado infeccioso.
4. Inactivación incompleta.
5. Tiempo de caducidad.

La tecnología de DNA recombinante ofrece:

1. Inmunidad activa.
2. Vacunas hechas a partir de los genes de virulencia.
3. No hay reversión a formas infecciosas.
 VACUNAS POR TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

Características del uso de la tecnología de DNA recombinante :

1. Se genera el antígeno a partir de un gen específico.

2. Se clonan en vectores de expresión.
3. Se producen en huéspedes de expresión.
4. Se pueden producir: subunidades proteícas o péptidos (dominios).
DIAGNOSTICO MOLECULAR
 DIAGNOSTICO

• ENFERMEDADES GENETICAS

• ENFERMEDADES INFECCIOSAS
 DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENETICAS

Detección del gen responsable:

• ausencia del gen
• defecto causado por deleción
• defecto causado por una mutación puntual
• defecto causado por translocación
• defecto causado por incremento de trinucleótidos
repetitivos
 DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

I. Detección directa del agente etiológico

- detección visual por microscopio
- cultivo del agente patogénico
Problemas / Desventajas :
 Algunos parásitos son morfológicamente indistinguibles entre sí
 escondidos entre los tejidos
 baja sensibilidad.
 patógenos difíciles de cultivar.
 contaminación de los cultivos con hongos.
 toma mayor tiempo para que crezcan los patógenos en cultivo.
II. Detección indirecta por presencia de anticuerpos

Problemas / Desventaja

 No discrimina infección presente o pasada

 Reacciones cruzadas (por determinantes antigénicos
compartidos por diferentes microorganismos)
 DIAGNOSTICO MOLECULAR

 Detección de algún componente o molécula del patógeno: DNA,

RNA o Proteína.
 Se considera como diagnóstico directo.
 Actualmente son los sistemas de diagnóstico con mayor
especificidad, mayor sensibilidad, y mayor rapidez.
 DIAGNOSTICO MOLECULAR

 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

 DNA hybridization
 PCR, RT-PCR, RAPD
 Hibridación fluorescente in situ
 Secuenciamiento de ácidos nucleicos
 ELISA: especificidad de un anticuerpo monoclonal
para un antígeno en particular.
 DIAGNOSTICO MOLECULAR

RAZONES DE USO:

1. Especificidad para moléculas blanco.

2. Sensibilidad a bajos niveles del blanco.
3. Simplicidad y rapidez.
4. Resultados inequívocos.
DIAGNOSTICO MOLECULAR : Tres niveles

1. Prenatal

2. Pre-sintomático

3. En tiempo real (monitoreo)

 DIAGNOSTICO MOLECULAR : Tres niveles

I. Prenatal :
• enfermedades hereditarias
• Predisposición genética – sospecha clínica

II. Pre-sintomático: (Dx. temprano)

• Enfermedad infecciosa (fase temprana)
• Predisposición a Enfermedades como el cancer,
autoinmunes, degenerativa, transtornos afectivos
(historia clinica familiar)
Microchips de ADN para el análisis genómico, capaces de
predecir el riesgo de padecer una enfermedad concreta.
2/2 2/4 2/3 3/4 3/3 4/4

1/1 1/2 1/2 2/2

Negativo Positivo

Muestra de ello es el KIT Genético del

Alzheimer. Una patente española
DIAGNOSTICO MOLECULAR : Tres niveles

III. En tiempo real (monitoreo):

• Características del patógeno (identificación,

virulencia, resistencia a drogas)
• Estado inmunológico (carga antigénica, o
cantidad de anticuerpos)
• Estado de la enfermedad (detección de
marcadores)
• Monitoreo al tratamiento: marcadores,
respuesta al tratamiento, resistencia, etc.
Diagnóstico molecular de Anemia Falciforme:

Hb A Pro - Glu - Glu

CCT-GAG-GAG

Hb S Pro - Val - Glu

CCT GTG GAG

La enzima de restricción MstII reconoce la secuencia

CCTGAGG
DIAGNOSTICO MOLECULAR EN EL FUTURO
 FIN

Piensa en grande y tus hechos crecerán,

piensa en pequeño y quedaras atrás,
piensa que puedes y podrás;
todo esta en el estado mental.
Rudyard Kipling