INOCUIDAD DE

LOS ALIMENTOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO

Nombre del Alumno: __________________________

Licenciatura en Nutrición
Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de los Valles

M. en C. Martha Beatriz Guzmán Aburto

Autor
 Práctica 1
Organización, reglamentos y evaluación de las actividades del
laboratorio

LABORATORIO DE EVALUACIÓN DEL ESTADO NUTRICIO Y DIETÉTICA

(LEEND).

REGLAMENTO

Los estudiantes y docentes de la Licenciatura en Nutrición deberán mantener un

comportamiento apropiado al interior del laboratorio, acatando y respetando las normas
establecidas.

1.- El laboratorio es única y exclusivamente para el desarrollo de actividades académicas

e investigación, de conformidad con la programación académica.

2.- Toda práctica o actividad de investigación deberá registrarse en las bitácoras

correspondientes. Su desarrollo deberá apegarse a la programación y tiempos
establecidos por el profesor / investigador y el responsable del laboratorio.

3.- No se permitirá el ingreso después de 10 min. de inicio de la práctica.

4.- El estudiante deberá portar el material a utilizar durante la práctica: Guías de práctica,
manual de procedimientos, tablas de composición de alimentos, pluma, lápiz, calculadora,
entre otros.

5- Para ingresar al laboratorio los usuarios deberán seguir las siguientes normas de
seguridad e higiene:

• Portar bata blanca de manga larga, filipina o mandil así como gorro/malla según
sea el caso u objetivo de la práctica.
• El estudiante deberá utilizar uniforme: blusa blanca, pantalón mezclilla, además de
su identificación en buen estado.
• Se prohíbe fumar e ingerir alimentos dentro del laboratorio.
• Se prohíbe el uso de dispositivos electrónicos de uso personal como celulares,
tabletas o computadoras ajenos a la práctica.
• Usar aretes pequeños, NO anillos ni pulseras.
 • Llevar el cabello recogido, uñas cortas y sin esmalte.
• Utilizar un maquillaje discreto.
• Realizar el lavado de manos con agua y jabón antes y después de la práctica.
• Al terminar la práctica verificar que las llaves de agua y gas del módulo utilizado
estén cerradas.
• Verificar que los equipos utilizados estén completamente apagados.
• Dejar las mesas de trabajo limpias y desinfectadas.
• Dejar el material utilizado limpio y en el área correspondiente.
• En caso de trabajar con material infectocontagioso: tubos de sangre, jeringas,
hisopos, torundas, guantes etc., pida asesoría al profesor o encargado del
laboratorio para el correcto manejo de los deshechos.
• En caso de romper algún material o haber derramado alguna sustancia notificarlo
de inmediato a su profesor para recibir apoyo.
• Todo instrumento o material dañado deberá recuperarse o repararse si así lo
amerita.
• Se prohíbe sustraer cualquier material o equipo sin autorización, en caso
necesario será mediante formato oficial de préstamo y entrega de identificación.
6.- Serán motivos de observancia, las demás disposiciones reglamentarias que
establecen la normatividad universitaria.
 Práctica 2
Material y equipo del laboratorio.

Propósito específico de la práctica.

• Utilizar correctamente el material y equipo del laboratorio, lo cual será de

importancia para las siguientes prácticas. Además de conocer las medidas
indispensables de seguridad para evitar los accidentes de trabajo comunes
en el laboratorio.

Antes de la práctica.

• Contar con tu manual de práctica.

• Conocer y respetes las normas de bioseguridad.

Durante la práctica.

• Vigilar que el equipo y material que utilizas no le ocurra algún daño.

• Realizar las actividades señaladas.

Después de la práctica.

• Conocer correctamente nombre y función de cada equipo y material de

laboratorio.

Resultado esperado.

• Que el alumno desarrolle habilidades extra aula.

• Que el alumno se familiarice o conozca el material a utilizar en las próximas
prácticas de laboratorio, Normas de seguridad específicas de la práctica.
 a) Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica.

Tipo de peligro. Cómo evitarlo. Cómo proceder en caso de algún

accidente.
Derrame de sustancias Tener precaución durante En caso de derramar alguna sustancia o
o rupturas del material. el manejo del romper algún material de vidrío, acudir con el
contratiempo. asistente de la práctica, recoger el material o
sustancia y colocarlo en el recipiente que
corresponde.

Desarrollo de la práctica.

“Material del laboratorio”.

Se hará una revisión de cada uno de los materiales y equipo que se muestra a
continuación y se verificará cuál de estos existen en el laboratorio y que uso se le
da. Completa la información o integra las imágenes correspondientes.

Nombre. Función. Material.

Pipetas de cristal.

Tubo de ensayo Disolver, calentar o

de cristal. contener pequeñas
cantidades de sustancias.
 Matraz de
Erlenmeyer.

Contener un volumen
específico, marcado con
una línea, por lo que no
deben ser calentados
porque pierden la
calibración.

Varilla de vidrio. Mezclar o agitar

sustancias; t

Pipeta Pasteur. Administrar sustancias

por goteo.
 Medir diferentes
volúmenes de líquidos,
hay en diversos tamaños.

Vidrio de reloj. Triturar reactivos o

disolverlos.

Colocar muestras que

contiene partículas u
Portaobjetos. organismos muy
pequeños y que se
observarán en el
microscopio.

Frascos de vidrio
con tapón
esmerilado.
Micro pipeta. Medir volúmenes
milimétricos de
sustancias o reactivos.

Calentar sustancias o
esterilizar muestras o
reactivos.

Espátula. Manipular o mezclar

sólidos.

Tripié. Sostener el recipiente en

el que va a ser calentado
un líquido.
 Cápsula de Calentar a fuego directo,
porcelana. para evaporar líquidos.

Calentar sustancias,
proporciona una flama
más fuerte que el
mechero de bunsen.

Cubrir matraces o tubos

Tapones. en operaciones o
procesos en los que
producen gases.

Pinza de crisol. Sostener y trasladar

objetos y materiales
Calientes.
 Colocar medios de cultivo
e inocular en ellas
muestras para
aislamiento de
microorganismos.

Facilitar el vertido del

líquido. Son vasos con un
borde superior como el
de una jarra. Son
graduados, pero no se
utilizan normalmente para
medir, por su escasa
precisión.
Son de capacidades
variadas, desde ml a
litros.

Succionar sustancias a
partir de una pipeta y así
Perilla. disminuir el riesgo de
contaminación directa, al
absorber con la boca.

Dar soporte a tubos de

Gradilla metálica. ensayo, los hay de
diferentes tamaños.
 Hacer siembra de
Asa cultivos, los hay de
bacteriológica. diversos tipos, ejemplo:
asa aguda, asa con aro,
etc.

Es empleado para
esterilizar muestras o
Papel filtro. para filtrar sustancias que
fueron contaminadas con
sustancias físicas.

Cápsula y mortero Triturar reactivos o tejidos

de porcelana. utilizados para los medios
de cultivo en
microbiología.

Es utilizado en la
observación de
microorganismos,
aumenta la dimensión
según la calidad del
aparato, desde 40 hasta
1000 veces su tamaño o
más.
 Es utilizada como medio
Incubadora. de incubación para
bacterias y otros
microorganismos.

Se emplea para realizar

Balanza analítica. mediciones de masa muy
pequeña y exacta de
sólidos.

Autoclaves.
 .
Potenciómetro.

Es útil para realizar los

recuentos de unidades
formadoras de colonias
de bacterias, muy
utilizadas en
microbiología sanitaria de
alimentos.

Se emplea para liofilizar

Liofilizador. sustancias o biológicos
para ayudar a prolongar
su vida de anaquel.

Centrifuga. .
 Es empleada en la
medición de masa de
Balanza diversas sustancias,
granataria. reactivos u otras
necesidades propias de
las actividades del
laboratorio.

Conserva los cultivos. La

Refrigerador. temperatura ideal de uso
es de 4°c.

Se aprovecha para
mantener sustancias o
medios de cultivo a
Baño maría. temperaturas por arriba
de las que emplea la
incubadora.
 Es empleado para retirar
los iones del agua o
alguna sustancia acuosa
que pueda alterar la
permeabilidad de los
microorganismos.

Evidencias de desempeño:

Los siguientes puntos serán revisados antes o durante la práctica.

1. Contar con su manual.

2. Participación (se harán preguntas directas), se evaluará, SI o NO
contestaste acertadamente.

Para saber más:

1. Nunca coloque más de 4 placas una sobre otra dentro de la incubadora

pues aumentas el riesgo de rupturas.
2. Las placas se rotulan en a tapadera, nunca en la base. Usa plumón de
punto fino para vidrio.
3. Es recomendable colocar la placa con medio de cultivo con la tapadera
hacia abajo, pues así se disminuye la posibilidad de contaminación.
4. Destapa los pipeteros y cajeteros metálicos cerca de los mecheros pues
estos contienen placas y/o pipetas estériles y se pueden contaminar.
5. Nunca abras una tapa con material estéril o retires el equipo estéril a una
circunferencia mayor a los 20 cm. del mechero encendido.

Actividad complementaria

Investiga los siguientes equipos especializados y complementa la información

como se presentó en los cuadros anteriores (pon las imágenes correspondientes).
 Nombre. Función. Equipo (imagen)

Campana de flujo
laminar.

Vortex.

Stomacher.

Horno para
esterilización en seco.
 Práctica 3
Conocimiento y uso del microscopio

Objetivo

El interés particular de la práctica, consiste en enseñarte a utilizar correctamente

el microscopio compuesto de uso común en el laboratorio de microbiología,
herramienta básica e indispensable en el estudio de los microorganismos.

Se busca que conozcas y uses correctamente cada una de sus partes y que te
familiarices con él, pues lo estarás utilizando en las siguientes prácticas.

Criterios de desempeño.

Antes de la práctica.

Seguir los procedimientos señalados en la práctica.

Después de la práctica.

Uso correcto de cada una de las partes del microscopio compuesto.

Resultado esperado.

Al terminar la práctica el alumno será capaz de utilizar el microscopio

correctamente. Conocerá el nombre y la función de cada una de sus partes.
Realizará investigación sobre tipos de microscopios, sus usos y avances.
 Normas de seguridad específicas de la práctica.

a) Cuadro de detención de riesgos particulares de la práctica.

Tipo de riesgo Cómo evitarlo Cómo proceder en caso de un

accidente.
Ruptura del equipo. Tener precaución durante el Acudir con el asistente de la práctica y
manejo del mismo. reportar la falla.

b) Cuadro de disposición de desechos: (No aplica).

Desarrollo de la práctica

Estudiarás el nombre y uso de cada una de las partes del microscopio y de esta
manera se te hará más sencillo recordar su función.
Actividad

1.- Coloca el nombre a cada una de las partes señaladas en la siguiente figura.
2.- A continuación se mencionan algunas partes del microscopio con sus
funciones, completa las restantes investigando por tu cuenta en otras bibliografías.

Sistema Óptico.

• Ocular: Amplia la imagen del objetivo, lente situada cerca del ojo del
observador.
• Objetivo: Ampliar la imagen de la preparación, lente situada cerca de la
misma.
• Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

Sistema mecánico.

• Platina: Es el lugar donde se deposita la preparación.

• Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares, puede ser
monocular o binocular.
• Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos, permite, al girar,
cambiar los objetivos.
• Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.
• ____________________________________________________________
• ____________________________________________________________
• ____________________________________________________________

Sistema eléctrico.

• Condensador: Es una lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparación.
• Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• ____________________________________________________________
 Evidencias de desempeño.

Los siguientes puntos serán revisados antes o durante la práctica:

1. Contar con el manual.

2. Participación (Se harán preguntas directas) se evaluará si contestaste o no
acertadamente.
3. Investigar sobre los siguientes microscopios completando lo que se pide.

Microscopio. Campo o área en que se Imagen.

utiliza y su función.

Microscopio de
campo oscuro.

Microscopio de
inmunofluorescencia.

Microscopio
electrónico.

Microscopio
electrónico de
barrido.
Microscopio de
efecto túnel.

Microscopio de
fuerza atómica.

Para saber más:

El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por
Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por
primera vez por los miembros de la Academia del Lincei, una sociedad científica a
la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación
microscópica del aspecto de una abeja.

Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo microscopía

aparecen en 1960 y 1965 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la
circulación sanguínea, al observar al microscopio los capilares sanguíneos y
Hooke publica su obra Micrographia.

A mediados del siglo XVII, un comerciante holandés, Antoni Van Leeuwenhoek,

utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez
protozoos, bacterias espermatozoides y glóbulos rojos.

Durante el siglo XVIII, el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que

aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron
mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877
cuando Abbe, publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss
mejora la microscopía de inmersión, sustituyendo el agua por el aceite de cedro,
lo que permitió obtener aumentos de 2000 veces. A principios de los años 30 se
había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo
aumentos superiores a 500x o 1000x; sin embargo existía un deseo científico de
observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
 Práctica 4

Forma y agrupación bacterianas.

Propósito específico de la práctica.

Identificar las diversas formas coloniales y su caracterización como apoyo para un

diagnóstico clínico.

Antes de la práctica.

Conocimiento de los fundamentos básicos de morfología colonial.

Durante la práctica.

Uso de herramientas de apoyo en la calidad e inocuidad alimentaria.

Saber caracterizar las colonias aisladas de una muestra de alimentos.

Después de la práctica.

Empleo de nuevas técnicas para dar seguimiento a la muestra analizada.

Resultado esperado.

El alumno se desenvuelve con confianza en el laboratorio; usa correctamente

material y equipo del laboratorio; discute sus resultados con sus compañeros para
tener una mejor visión que lo lleve a tomar una solución acertada en su
diagnóstico.
 Normas de seguridad específicas de la práctica.

a) Cuadro de detención de riesgos particulares de la práctica.

Tipo de peligro. Cómo evitarlo. Cómo proceder en caso de un

accidente.
Rupturas de material. Usar la indumentaria necesaria y Tomar las medidas correctivas
Contaminación bacteriana. tener precaución en el manejo inmediatas y llamar al asistente o
del equipo y placas cultivadas. profesor encargado de la práctica.

b) Cuadro de disposición de desechos.

Tipos de desechos. Cómo descartarlos. Tipos de contenedor.

Placas con agar contaminados Al término de la práctica se Área especial para material
con colonias bacterianas. esterilizan para su limpieza, contaminado.
esta actividad la realiza
personal del laboratorio.

Desarrollo de la práctica.

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a estas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologías.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las

células individuales, esto es, iniciar y completar una división celular. De esta
forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el
crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas
bacterianas.

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de

formas colonias debido a que solo se tiene en cuenta el número de
microrganismos viables, esto es, capaz de crecer indefinidamente.
 Procedimiento.

a) Sacar las placas de la incubadora para su proceso.

b) De las colonias aisladas en las placas, seleccionar dos de agar nutritivo y
dos de agar MacConkey y realizar las caracterizaciones que se piden en el
cuadro de abajo.

Indicaciones

Para seleccionar las colonias se recomienda lo siguiente:

1. Elegir aquellas que estén completamente aisladas.

2. Sobre la base de la caja, encerrarlas en un círculo con un marcador y
enumerarlas.
3. Seleccionar de las colonias que predominan en la placa.
4. Tomar de la colonia con asa aguda, tocando suavemente el centro.
5. Cuidar siempre que el asa sea esterilizada después de realizar la siembra.
6. Trabajar siempre cerca del mechero para evitar contaminación.

De las colonias seleccionadas obtener los siguientes datos.

Núm.
Forma Diámetro Color Borde Elevación Consistencia Catalasa
Colonia

Para contestar algunas características del cuadro anterior apóyate en lo siguiente:

FORMAS:

ELEVACIÓN:

BORDES:

Ejemplo de las distintas características morfológicas coloniales

 1) El diámetro se obtiene midiendo la colonia por la parte de atrás de la placa
(en la base) utilizando una regla, se mide en mm.

2) El color es visible al observar detalladamente la placa

3) La consistencia se detecta al tocar la colonia con un asa aguda. Puede ser

Cremosa (blanda) o dura.

Evidencia de desempeño

1. Reportes de la práctica en la siguiente actividad.

2. Cuadro con los resultados.
 Práctica 5
Tinción de Gram y prueba de catalasa

Propósito específico de la práctica

Utilizar la técnica de tinción de GRAM para observar características morfológicas

de las bacterias aisladas de una muestra, así como observar la reacción de la
prueba de catalasa, que es una prueba bioquímica para diferenciar entre géneros
bacterianos al conocer su reacción (+/-) a la misma.

Antes de la práctica

Conocer la técnica de tinción de Gram.

Conocer los fundamentos de la prueba bioquímica de la catalasa.

Utilizar correctamente el microscopio compuesto.

Durante la práctica

Emplear correctamente los reactivos necesarios para la técnica de tinción y

prueba de catalasa.

Saber seleccionar las colonias para la realización de ambas las pruebas.

Aplicar eficientemente los conocimientos del uso de un microscopio compuesto.

Identificar con base en la observación en microscopio la morfología de la bacteria.

Después de la práctica

Saber los procedimientos a seguir con el material contaminado.

Resultad o esperado

El alumno conoce los fundamentos teóricos y realiza correctamente la técnica de

tinción de Gram y a prueba de catalasa para la identificación de microorganismos
aislados.
Normas de seguridad específicas de la práctica

a) Cuadro de detección de riesgos particulares de la practica

Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en

Rupturas de material Usar la indumentaria
Contaminación necesaria y tener
bacteriana precaución en el manejo
del equipo y placas
cultivadas.
caso de un accidente
Tomar las medidas
correctivas inmediatas y
llamar al asistente o
profesor encargado de la
práctica.

b) Cuadro de disposición de desechos.

Tipo de desecho Como descartarlos Tipo de contenedor

Placas con agar. Al término de la práctica Drenaje.
se esterilizan para su
limpieza.

c) Normas oficiales mexicanas específicas para la práctica.

Revisar el apartado III donde especifica las prácticas generales de seguridad,

reglamentos y procedimientos generales.

Desarrollo de la práctica

Prueba de catalasa (Pruebas de identificación)

Debido a que las observaciones de las características de la colonia, así como las
microscópicas no son definitivas para distinguir el género, y con mucho menos la
especia, es necesario utilizar características propias de cada microorganismo.

Detección de género. “Prueba de la catalasa”

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrogeno (H2O2) en

oxígeno y agua.
 Fundamento de la prueba catalasa

Químicamente la catalasa es una homeoproteina de estructura similar a la

Hemoglobina, excepto que los cuatro átomos de Hierro de la molécula están en
estado oxidado (Fe3+). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas poseen la actividad de catalasa. La mayoría de
las bacterias anaerobias descomponen el H2O2 con peroxidasas semejantes a la
catalasa, salvo que cada molécula contiene solo un ion férrico.

El H2O2 se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo
aerobio de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, es letal para las células
bacterianas.

La catalasa transforma el peróxido en agua y oxígeno, la prueba de la catalasa

se realiza con portaobjetos o tubos y es muy utilizada para diferenciar
estafilococos (positivos) de estreptococos (negativos).

Controles

El reactivo H2O2 debe ensayarse con organismos de control positivo y negativo en forma
diaria o antes de investigar la (s) bacteria (s) desconocida(s).

Control positivo: Staphylococcus

Control negativo: Streptococcus spp.

Procedimiento

a) Colocar sobre un portaobjetos una gota de agua oxigenada (periodo de

hidrogeno).
b) Con asa aguda estéril al rojo vivo, tomar una asada de la (s) colonias (s)
seleccionada (s) y colocarla (s) sobre la gota.
c) A la par colocar los controles positivos y negativos.
d) Observar la presencia (catalasa +) o ausencia (catalasa -) de efervescencia.
e) Apoyándote en los controles reportar tus resultados.

La presencia de efervescencia indica que la prueba es positiva a la catalasa.

 Fundamento de la tinción de Gram

Las paredes bacterianas en presencia de colorantes, tal es el caso de la tinción

de Gram.

Procedimiento

1. De las colonias que hiciste la caracterización colonial y que tienes

enumeradas en el agar nutritivo, tomarás una muestra de cada una, con un
asa aguda para realizar un frotis por separado (realizado previamente con
la prueba de catalasa).
2. Dejar secar (dejando cerca del mechero hasta que se libere de toda
humedad) y fijar a calor *

*Fijar al calor significa “pasar el portaobjetos con la muestra ya seco por

encima de la flama del mechero en tres ocasiones, de preferencia con la flama
bajita para que no se lesionen las células bacterianas y para no quemarte”
 3. Posteriormente, realiza la tinción como se indica en el siguiente esquema.
Procedimiento para la tinción de Gram

4. Observar al microscopio en objetivo de 100X con aceite de inmersión.

5. Dibujas las formas bacterianas observadas e identificar el Gram.

Evidencia de desempeño

1. Reporte de la práctica.
2. Actividad complementaria

Investigar otro tipo de tinciones como son: tinción simple, tinción de esporas,
tinción de Ziehl Neelsen y observación en fresco, de cada una traer función y
procedimiento de la técnica.
 Actividad 1

Investiga los siguientes tipos de tinciones que son específicos para otros
microorganismos. Contesta brevemente en este espacio su utilización.

Tinción de
Ziehl Neelsen

Tinción de capsulas

Tinción de esporas

Tinción de Wright

Tinción de Giemsa

Tinción simple
 Actividad 2

Reporte de la práctica realizada

Describe los resultados que obtuviste: morfología de las bacterias aisladas,

tinción y prueba de catalasa (+/-). Realiza un dibujo de lo observado.
 Práctica 6

Observación de mohos y levaduras.

Propósito específico de la práctica.

Diferenciar la morfología de mohos y levaduras para realizar un diagnóstico a

partir de una muestra de alimentos.

Antes de la práctica

Conocer las diversas morfologías de hongos y levaduras.

Durante la práctica

Usar correctamente el microscopio compuesto.

Emplear de manera correcta los reactivos usados en la técnica para observación
de hongos y/o levaduras.

Después de la práctica
Identificar las estructuras morfológicas de hongos y/o levaduras.

Resultado esperado.

El alumno utiliza la técnica para la observación de hongos y la aplica

correctamente en la práctica. Obtiene el conocimiento previo requerido para la
realización de un diagnostico microbiológico sanitario con base en la
determinación de mohos y levaduras que dicta la Norma Oficial Mexicana NOM-
111-SSA1-1994

Normas de seguridad específicas de la práctica.

a) Cuadro de detección de riesgos particulares de la práctica.
Cómo proceder en caso de
Tipo de peligro. Cómo evitarlo.
un accidente.
Usar la indumentaria Tomar las medidas correctivas
Contaminación
necesaria y tener precaución inmediatas y llamar al
micológica
en el manejo del material asistente o profesor encargado
 biológico. de la práctica.
b) Cuadro de disposición de desechos.
Tipos de Tipo de
Como descartarlos.
desechos. contenedor.
Muestra Al término de la práctica se colocan en un
Color rojo.
biológica. contenedor.

Desarrollo de la práctica.

Cultivo de hongos.
1. Transportar con mucho cuidado la muestra de alimento con crecimiento de
moho al laboratorio para su proceso.
2. Colocar a lo largo de un portaobjetos una gota de hidróxido de sodio (KOH)
al 15% y en el otro extremo una gota de azul de lactofenol.
3. Con un asa aguda toma una muestra de dos crecimientos distintos y
extiéndela suavemente sobre cada una de las gotas de reactivo (recuerda
esterilizar el asa antes y después de tomar cada muestra)
4. Colocar un cubreobjetos encima de cada gota y observar en el microscopio
con el objetivo de 40x. NO USAR ACEITE DE INMERSIÓN.
Éstos son ejemplos de lo puedes encontrar en tu muestra y observar en el
microscopio.

Morfología de mohos
 Reporte de la práctica realizada

Actividad 1

Realiza un dibujo de la morfología de mohos y/o levaduras observadas en el

alimento y el microscopio.
 Actividad 2

Realizar un informe sobre levadura o moho observado, señalando, taxonomía,

habitad, patogenia, ciclo biológico y fuentes de contaminación (utiliza dibujos,
imágenes o fotografías).
 Práctica 7

Análisis microbiológico de agua y alimentos.

Microorganismos indicadores

MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS.

OBJETIVOS

 Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el

número de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios
destinados al consumo humano.
 Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la
NOM-111- SSA1-1994.
 Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y
cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.

GENERALIDADES

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el

ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como
contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y
levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también
pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su
crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se
manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable.
Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido
en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser
un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas,
especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad
intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas,
carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También
pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos
(micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y
(c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de
bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la
decoloración de las superficies de alimentos.

El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos

multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele
reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces
pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para
el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en
observaciones macroscópicas y microscópicas.

Método.

Se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo

selectivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de
utilizar como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de
estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La
sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al
inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la
acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las
condiciones de aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 ± 1 ºC dan
como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de
microorganismos.

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-

110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su
Análisis Microbiológico.
Procedimiento

1.- Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz
Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de
pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%.

2.- Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora

estéril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el
caso de la licuadora a velocidad mínima, ó 30.0 seg en el Stomacher a una
velocidad normal. Esta es la dilución primaria.

3.- De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de

ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2,
agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se
debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.

NOTA

Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de

un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de
UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneización de la
muestra (a mayor tiempo de homogeneización mayor será la ruptura de las hifas y
por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner especial
cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneización citados en esta
metodología son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo
microbiano.

4.- Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las
diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéril.

5.- Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar
papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a
±45°C.
6.- Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL
de agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana,
o bien esterilizar la solución a 121°C±1°C durante 15 minutos. Esto significa que a
cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a ±45°C se le
deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo
precaución de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo.

7.- Después de la acidificación, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y

medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potenciómetro.

8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa
dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos
a ±45°C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el
momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.

9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a

izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y
seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no
humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las
cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría.

10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una
caja de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o
agar extracto de malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no
deberán presentar desarrollo de colonias.

11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25±1°C.

12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación.

Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150
colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es
difícil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de
incubación o incluso las de 3 días. En este caso, se informa el período de
incubación en los resultados de los análisis.
13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de
algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos
que se hayan desarrollado.

14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las

levaduras obtenidas.

15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de

incubación (a 26 ± 1ºC o a temperatura ambiente).

16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas
para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución.

17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o
mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a
25±1°C durante 5 días.

18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de

los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.

19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es

difícil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los
4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo
de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.
 DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN A
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 m

1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2
Pesar 10 g de muestra Homogenizar con 90
en condiciones mL de solución
estériles diluyente.

Adicionar de 15 a 20 mL de agar
papa dextrosa y/o agar extracto
de malta acidificados con 0.3 D
mL ácido tartárico 10 % enfriado
a 45°C en cada placa
 Expresión de resultados

Cálculo del Método

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para
el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los
criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias
en Placa, para la expresión de resultados.

Informe de la prueba:

Análisis cuantitativo
• Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben
seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad
estadística). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el número
de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las
unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del
estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de
UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución
correspondiente a esa caja.
• En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos
• y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución
correspondiente.
• En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el
resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/mL
• Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación
en el que se realizó la cuantificación.
• Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el
resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras.
• Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes
tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es
posible reportar el o los géneros probables.
 MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.

OBJETIVOS

 Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, la

cantidad de bacterias mesófilos aerobias viables presentes en productos
alimenticios destinados al consumo humano.
 Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la
NOM-092- SSA1-1994.
 Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y
cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.

GENERALIDADES

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un

alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no
pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de
cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten
seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes
alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios.
Son un indicador general de la población que pueden estar presente en una
muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto.

Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero

para algunos productos, también es importante determinar la presencia de
bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad
del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es
la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y
algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si se modifican las
condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el
método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios
o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo.
El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables,
pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante
apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC

presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que
desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de
incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la
técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico”.

NOTAS

 El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez, y debe mantenerse

en baño de agua regulado a 45 °C, durante el tiempo suficiente para que
alcance esta temperatura, y hasta su utilización.
 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas,
no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solución

amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.
 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca, con 9 mL de
solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.
 6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 ó 250 mL) de
agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estándar)
 fundido y mantenido en baño de agua a 45 ± 1.0 ºC (para técnica de vertido
en placa) a.
 6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de
levadura (agar cuenta estándar) estériles o el medio requerido en la técnica

PROCEDIMIENTO

Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de

“Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”.

Técnica de vertido o vaciado en placa.

1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación

y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar
las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a
45 °C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de
atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de
las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la
muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de
cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.

4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que

se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
Técnica de extensión superficial en placa.

1. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la
inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas
con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Para distribuir de manera homogénea, extender el inóculo
utilizando una varilla de vidrio estéril (en forma de escuadra o “L”) haciendo
movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr
la completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el inóculo se
absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10
minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora
al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no
debe exceder de 20 minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.

4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura que

Condiciones de incubación para cuenta en placa de diferentes
se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se
grupos
indica a continuación.

Grupo Bacteriano. Temperatura. Tiempo de Incubación.

Termofílicos 55 ± 2ºC 48 ± 2 h

Mesofílicos 35 ± 2ºC 48 ± 2 h

Psicrotróficos 20 ± 2ºC de 3 a 5 días

Psicrofílicos 5 ± 2ºC de 7 a 10 días

Después de la incubación, contar todas las colonias desarrolladas en las placas

seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que es una
colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar por
microscopía), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo extendido o
un número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método, aplicar las
reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopía para resolver los casos
en los que no se puedan distinguir las colonias de las partículas pequeñas de
alimento. Utilizar el registrador para contar las colonias.
 CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS MESÓFILAS A
Realizar diluciones decimales empleando tubos co

1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2
Pesar 10 g de muestra Homogenizar con 90 mL
en condiciones de solución diluyente.
estériles

Adicionar de 15 a 20 mL de agar
triptona extracto de levadura o agar
cuenta estándar fundido y enfriado
D
a 45°C en baño maría
RESULTADOS
La selección de las cajas que se toman en cuenta para los cálculos es muy
importante para la confiabilidad de los resultados; a continuación se especifican
las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la selección
de cajas obedece a criterios:

 Lógicos (elegir las que están en rango),

 Estadísticos (considerar los duplicados y el mayor número posible de datos)
 Funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores
disponibles).

Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes:

1.- Se consideran “representativas” las cajas que tienen un número de colonias

dentro del rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC.

2.- Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se
aplica el factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras
significativas (o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dígito del promedio es
4 o menor, se omite dejando el número de 2 cifras significativas. Por ejemplo, si en
una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer
dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. Cuando el tercer dígito es 5 o
superior, el segundo dígito se redondea al siguiente, por ejemplo si en una caja se
cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101 UFC, porque el tercer dígito es
superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilución
10-3, por lo que se reportará como 24 x 104 UFC.

3.- Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias

características dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los
números y se multiplica por el inverso de la dilución.

4.- Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni su
duplicado.
5.- Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se
consideran ambas y se promedian.

6.- Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se

promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el
factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente.

7.- Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio),
reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada),
por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se
sembró directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: “valor estimado”.

8.- Si no hay placas representativas pero hay alguna con un número menor de

UFC., se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”.

9.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en
aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de
colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y
multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden
contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm
de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar la leyenda
"valor estimado".

10.- Se cuentan como una sola colonia:

 Cadenas o pequeños grupos no separadas claramente entre sí, que

parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias y
que están separadas de otras colonias o cadenas.
 Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que
se diferencian claramente de otras.
 Colonias como película en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.

11.- Se considera “crecimiento extendido” el que se presenta cuando las colonias

abarcan más del 50 % de la superficie de la caja, con o sin inhibición de
crecimiento; en ese caso, y/o cuando la inhibición exceda el 25 % de la superficie
de la caja, se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se
toman en cuenta.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1.- Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y

potencias de 10:

2.- Bacterias mesofílicas aerobias en agar triptona extracto de levadura o cuenta

estándar, incubadas por ____ h. a _____ ºC: _______ UFC / g (ó / mL) de
muestra.

3.- Sustituir “mesofílicas” por termofílicas, psicrofílicas ó psicrotróficas, según

corresponda, anotando el tiempo y la temperatura correspondientes.

4.- Si se analizó un alimento para el cual existe norma y existe especificación

sobre el grupo estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la
norma.
 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

OBJETIVOS

 Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes

totales en un alimento, mediante método de vaciado en placa.
 Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

GENERALIDADES

La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas,
aunque algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como
Citrobacter y Serratia, respectivamente.

La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto

digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las
heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razón, su presencia constante en la
materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la
microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.
Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre
coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

 La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la

fabricación de los alimentos.
 La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su
presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los
coliformes son de origen no-fecal.
 Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.
 La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las
diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características
selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo
violeta (ABRV).

FUNDAMENTO

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se

desarrollan en ABRV (Agar bilis rojo violeta), el ácido producido por la
fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la
precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y
generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color
rojo claro o rosa.

La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación,

como se explicó en la técnica de preparación de diluciones.

NOTAS

 Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta
en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente:
 Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos
pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando
colonias semejantes a las de coliformes.
 El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar
antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se
debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el
momento de utilizarlo.
 Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han
solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más
adecuadas para los coliformes.
 El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de
incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la
formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.
  El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de
sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.
 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas
con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solución amortiguadora de

fosfatos de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada.
 2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca, con 9.0 mL de
solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada.
 5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo
violeta c/u, o un matraz Erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.
Recordar que el rango de sensibilidad del método es de 15 a 150 colonias por
placa.

2. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación

y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar
las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inóculo.

3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y
mantenido a 45 ± 1.0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la
preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de
cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio, mediante seis movimientos de

derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj,
seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de
atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla
solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fría. No permitir
que se mojen las tapas de las cajas.

5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 ó 5 mL

del mismo medio fundido y mantenido a 45 °C, no permitir que se mojen las tapas
de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los
coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.

6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la
esterilidad.

7. Una vez solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a

35°C, durante 24 ± 2 h.

8. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias.

Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas
son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de
precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la
morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0
mm.

9. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de

sensibilidad del método, aplicar las reglas indicadas en el inciso de RESULTADOS
de la práctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso del microscopio para
resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas
partículas de alimento.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1. Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la práctica

Cuenta de Bacterias en Placa.
2. Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y
potencias de 10.
3. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 +/-
2 h a 35 ºC: _____ UFC / g (o / mL) de muestra.
 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR CUE

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9

1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2
Pesar 10 g de muestra Homogeneizar la
en condiciones muestra con 90.0 mL
estériles. de solución diluyente.

Adicionar de 15 a 20 mL de
agar bilis rojo violeta
fundido y enfriado a 45°C en
cada placa De
 Actividad

Reporte de la práctica realizada

Reporte 1

Bacterias ___________________________ en agar

_______________________, incubadas por _____ h. a _____ºC

Muestra Resultado

________ UFC / g (ó / mL) de

muestra

Reporte 2

Organismos Coliformes totales en placas de agar

_______________________, incubadas por ____ h a _______ºC

Muestra Resultado

________ UFC / g (ó / mL) de

muestra
 Reporte 3

Mohos y levaduras en placas de agar ________________________,

incubadas por ______ h a ______ ºC

Muestra Resultado

________ UFC de mohos / g (ó / mL) de

muestra

________ UFC de levaduras / g (ó / mL) de

muestra

__________________________________________

Nombre y firma de quien realizó las pruebas