ALFA-AMILASA

Enzimás
Molécula orgánica de origen biológico capaz de catalizar una reacción química
determinada.
Catalizador→ capaces de acelerar la velocidad de la reacción. En prescencia de enzima
específica aumenta la velocidad. Son capaces de acelerar reacciones q ya ocurren
espontaneamente.
S→ P
Medición de la actividad → V de reacción según:
Concentración de P en el tiempo
Concentración de S en el tiempo

Conceptos fundamentales:
Conformación 3D
Flexibilidad cinética
Fenómeno poblacional → muchas moléculas a la vez.

Alfa amilasa
La alfa

amilasa rompe enlaces alfa 1-4 de la amilosa, es

lineal. El almidón tiene distintas calidades, la otra es
la amilopectina que tiene ramificaciones por tener
enlaces alfa 1-6, por lo que la amilasa no lo puede
romper completamente. La amilopectina en agua forma una estructura helicoidal.
En presencia de lugol (iodo y ioduro), los átomos de ioduro se intercalan con almidón
(en su forma amilosa), se puede observar un color azul intenso. Esto ocurre con el
almidón pero no con lo productos de la alfa amilasa.
La amilopectina, tiene cierta capacidad de interaccionar con el iodo pero da un rojo
apagado.
Mediremos la desaparición del color azul para saber la act de la amilasa.
Diseño experimental
1. Preparación enzima: medir pH de la saliva
2. Preparar sustratos (almidón 1% pH=7) → 10
ml, baño termostático 37ºC → aqui ocurre la
reacción enzimática
3. Test calorimétrico→ set de tubos
→ 1:1000, con agua homogeneizar bien
CONTROL: Se colocan 20 ul del sustrato en el 0, allí
lo que esperamos es que si la preparación del
sustrato es correcta se verá la coloración azul
característica, por lo que servirá como control.
Además, nos dará una idea de la coloración inicial sin
que actue la enzima.
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 Procedimiento
1. Se toma 1ml de la dilución de saliva, en el momento que
entra en contacto la enzima con el sustrato, empieza el
tiempo (t=0)
2. Se agita el tubo para alcanzar homogeneidad lo más rapido
posible, se devuelve el tubo al baño termostatizado.
3. 1 min→ 20ul al tubo 1. Lo mismo para los tubos restantes cada 1 minuto.
El lugol ya esta en el tubo y se colocan alicuotas de la reacción a distintos tiempos
en distintos tubos para ver que tanto sustrato se consumió.
Resultados
Esperamos un gradiente según se va consumiendo el sustrato.
La reacción se ve interrumpida por los pipeteos, la interacción de iodo con el lugol
impide q el sustrato sea reconocido por la enzima → frena la reacción al alterar la
conformación del sustrato.

Parametros
Efecto cromatico= tubo 6 → momento en el q ya no se detecta el almidón→ ya
no azul y los siguientes son iguales. El limite de detección y sensibilidad a
determinada concentración.

Tiempo de referencia 6' → Limite de detección: sensibilidad de la técnica

Diseño experimental
Cuestiones
importantes:
Reponer sustrato

En todos poner el control

Las variables se
introducen de a una para
ver que ocurre con cada
una.

PRE-TRATAMIENTOS (a la enzima antes de tocar

sustrato)
Mismas condiciones que el experimento modelo con variables específicas

1. CALOR: Se deja reposar antes de iniciar la reacción. Desnaturaliza

2. PROTEASA: Incubar con proteasa→ enz hidrolítica → rompe enlaces peptidicos.

Desnaturaliza de forma irreversible pq rompe estructura primaria

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 3. RNAasa :Enzima hidrolitica→ rompe enlaces fosfodiester → Sustrato al RNA, entonces la
amilasa no se ve afectada. Afecta a las ribozimas.
4. NaCl :50ml de cloruro de sodio → cofactor de amilasa

TRATAMIENTOS (variables en las condiciones de

reacción)
pH → 2 y 12

Temp → 0ºC, 25ºC y 70ºC

RESULTADOS
Se reproducen en una curva de coloración azul de los tubos en
función del tiempo. Por lo que mientras más tiempo, menos
sustrato habrá y por lo tanto menos color azul.
Un aumento en la actividad se refleja en una curva más empinada y por ende un
efecto acromático más temprano (y viceversa).
Las curvas serán más o menos empinadas según haya más o menos actividad
enzimática respectivamente.
Pretratamientos
1. CALOR:

No se registra actividad catalítica pq la amilasa pierde su conformación activa

irreversiblemente (naturaleza proteíca). Si fuera una enzima de RNA no la
desnaturaliza irreversiblemente, pueden volver a conformación nativa.
Color azul costante.
Agregamos energía cinética al sistema, la proteína oscila entre conformaciones a
diferentes energías potenciales, sobrepasa los picos q la contiene. La activa no suele
ser la que esta más favorecida termodinamente. Cuando desciende la Tº vuelve a
cierta conformación pero no se corresponde con la conformación activa.
2. PROTEASA
No se registra actividad catalítica pq la proteasa hidroliza los enlaces peptídicos de la
amilasa destruyendo su estructura primaria
3. RNAasa:
No se altera la act catalítica pq la RNAasa hidroliza los enlaces fosfodiéster del RNA sin
afectar por lo tanto la estructura de las enzimas de naturaleza proteica como la amilasa.
4. NaCl: aumenta la act catalítica de la amilasa:
El cloruro puede interaccionar con varios lugares de la enzima, uno de ellos es el sitio
activo, además de unirse y estabilizar es una parte integral para que
ocurra la reacción. Si retiraramos todo el Cl tendríamos una enzima sin actividad.
El Cl es un cofactor de la amilasa imprescindible para la conformación del sitio activo
de la enzima.
En saliva hay Cl

Tratamientos
pH 2 y pH 12:

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 -A pHs extremos no se registra ac pq se alteran las cargas de los aa afectando la
conformación irreversiblemente
-No habrá actividad pq las enzimas actuan con un determinado pH optimo, no es
exactamente el pH fisiológico.
-En los extremos, al alterarse el entorno se afecta en forma irreversible
desnaturalizando la enzima. Puede ser que partes de la enzima que tienden a unirse
por cargas opuestas comiencen a repelerse por estos cambio de pH. Las
interacciones débiles se ven alteradas.
TEMPERATURA

A 0º
- A Tº inferiores a la óptima, la energía cinética resulta limitante de la act
catalítica en forma reversible, ya que, la conformación activa no resulta afectada.
- se ve una muy leve disminución del almidón. Se resguarda la
conformación de la enzima. Al reducir energía cinética, el nº de choques entre
sustrato y enzima será menor y además el movimiento y flexibilidad necesaria
baja, la enzima será más rígida, movimientos más lentos. Esto
redundará en una menor actividad. No hay perdida de conformación por lo que es
reversible
A 25º → un poco menos de actividad que la Tº de referencia

A 70º → mucha energía cinética, estas oscilaciones hace q gradual y

rápidamente la conformación de la proteína cambiará en el lapso de un
minuto a la forma inactiva. Dentro del primer minuto hay cada vez más
enzimas q cambia la desnaturalización pero a la vez hay algunas que
siguen catalizando la reacción.

Resumen de resultados:

La proporción de moléculas que integran el cloruro en su sitio activo es mayor

cuanto mayor es la concentración de cloruro.

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