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revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381

Disponible  en  línea  en  www.sciencedirect.com

CienciaDirecta

página  de  inicio  de  la  revista:  www.elsevier.com/locate/he

Selección  e  identificación  de  microorganismos  
presentes  en  el  tratamiento  de  aguas  residuales  
y  lodos  activados  para  producir  biohidrógeno  a  
partir  de  glicerol
Liliane  Poleto  a,1, Patricia  Souza1, Flaviane  Eva  Magrini un,1 ,
Lademir  Luiz  Bealb  ,2, Ana  Paula  Rodríguez  Torres C,
Mai´ra  Paula  de  Sousa C, Jomar  Pereira  Laurino  a,1, Suelen  Paesia ,*
a
Universidade  de  Caxias  do  Sul,  Instituto  de  Biotecnología,  Laboratorio  de  Diagnóstico  Molecular,  Caxias  do  Sul,  RS,
95070­560,  
b
Brasil

C
Universidade  de  Caxias  do  Sul,  Laboratorio  de  Tecnologías  Ambientales,  Caxias  do  Sul,  RS,  95070­560,  Brasil  Centro  de  
Investigación  y  Desarrollo  de  Petrobras  (CENPES),  Gerencia  de  Biotecnología,  Av.  Horacio  Macedo,  950,  Cidade  Universitària,
~
21941­915,  Ilha  do  Fundao,  Río  de  Janeiro,  RJ,  Brasil

información  del  artículo abstracto

Historial  del  artículo: Uno  de  los  grandes  retos  para  los  próximos  años  es  desarrollar  formas  alternativas  de  producir  energía  sostenible.  El  
Recibido  el  3  de  marzo  de  2015 biodiesel  ha  demostrado  ser  una  opción  en  sustitución  de  combustibles  fósiles.
Recibido  en  forma  revisada Se  produce  por  transesterificación  de  una  grasa  y  un  monoalcohol,  liberando  así  glicerol,  que  corresponde  al  10%  del  volumen  
9  junio  2015 de  reacción.  Grandes  incrementos  en  la  producción  de  biodiesel  darán  como  resultado  volúmenes  proporcionales  de  glicerol  
Aceptado  el  10  de  junio  de  2015 crudo.  Los  estudios  han  demostrado  que  las  bacterias  anaeróbicas  estrictas  y  las  bacterias  fermentativas  son  capaces  de  
Disponible  en  línea  el  11  de  julio  de  2015 producir  biohidrógeno,  un  combustible  de  alta  energía,  que  no  genera  contaminantes  gaseosos  durante  su  combustión.  Dada  
la  importancia  de  incrementar  el  valor  agregado  del  glicerol  crudo,  el  propósito  de  este  estudio  fue  aislar  y  caracterizar  las  

Palabras  clave: bacterias  que  se  encuentran  en  los  reactores  de  aguas  residuales  y  activadas.
biodiésel

Glicerol tratamiento  de  lodos  capaz  de  producir  biohidrógeno  a  partir  de  glicerol.  Quince  especies  bacterianas  capaces  de  crecer  en  

Glicerol  crudo medio  con  glicerol  fueron  identificadas  mediante  secuenciación  del  gen  16S  rRNA,  de  las  cuales  nueve  especies  resultaron  

Biohidrógeno capaces  de  producir  biohidrógeno:  Enterobacter  ludwigii,  Shigella  sonnei,  Bacillus  licheniformis,  Bacillus  amyloliquefaciens,  

microorganismos Staphylococcus  warneri,  genes  Alcali  faecalis,  Bacillus  subtilis,  Bacillus  atrophaeus  y  Citrobacter  freundii.  Los  aislados  de  
Bacillus  amyloliquefaciens  mostraron  mayor  rendimiento  en  la  producción  de  biohidrógeno  con  valores  de  0,50  ±  0,20  mol  H2/
mol  de  glicerol.  Los  resultados  indican  que  existe  un  gran  potencial  para  seleccionar  bacterias  productoras  de  biohidrógeno  
en  las  aguas  residuales  evaluadas.

Copyright  ©  2015,  Publicaciones  de  energía  de  hidrógeno,  LLC.  Publicado  por  Elsevier  Ltd.  Todos  los  derechos  reservados.

*  Autor  correspondiente.  Tel.:  þ55  54  3218  2149.
Correos  electrónicos:  lpoleto@ucs.br  (L.  Poleto),  psouza@ucs.br  (P.  Souza),  femagrin@ucs.br  (FE  Magrini),  llbeal@ucs.br  (LL  Beal),  aptorres@petrobras.com.br  (AP  Rodrigues  
Torres),  mpsousa@petrobras.com.br  (M.  Paula  de  Sousa),  jlaurino@uol.com.br  (JP  Laurino),  sopaesi@ucs.br  (S.Paesi).

1 Tel.:  þ55  54  3218  2149.
2
Tel.:  þ55  54  3218  2100x2363.  http://
dx.doi.org/10.1016/j.ijhydene.2015.06.051  0360­3199/Copyright  
©  2015,  Hydrogen  Energy  Publications,  LLC.  Publicado  por  Elsevier  Ltd.  Todos  los  derechos  reservados.
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revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381 4375

Ergostech  Renewable  Energy  Solutions)  y  glicerol  comercial  de  la  
Introducción
marca  Simoquı´mica®.

Uno  de  los  grandes  desafíos  para  los  próximos  años  es  encontrar  
Análisis  físico  y  químico  de  los  sustratos
alternativas  para  la  producción  de  energía  limpia  y  sostenible,  con  el  
objetivo  de  reemplazar  los  combustibles  fósiles  de  fuentes  no  
El  análisis  físico  químico  de  los  sustratos  se  realizó  de  acuerdo  con  
renovables,  como  el  carbón,  el  petróleo  y  el  gas  natural.  En  este  punto,  
los  Métodos  Estándar  para  el  Examen  de  Agua  y  Aguas  Residuales  
el  hidrógeno  se  presenta  como  un  combustible  muy  amigable  y  
[33],  analizando  la  DQO  total  (demanda  química  de  oxígeno),  calcio,  
sustentable  por  algunas  razones,  como  una  amplia  gama  de  sustratos  
hierro,  magnesio,  potasio  y  sodio.
a  saber,  residuos  sólidos  o  líquidos  y  subproductos  industriales.  Un  
subproducto  industrial  típico  en  Brasil  es  el  glicerol  debido  al  programa  
de  producción  de  biodiesel  como  opción  alternativa  al  gasóleo  de  
Aislamiento  de  microorganismos
origen  fósil.  Según  Santos  (2012)  [24]  la  producción  brasileña  de  
biodiesel  en  2035  será  de  alrededor  de  40  millones  de  metros  cúbicos,  
Los  microorganismos  se  aislaron  de  seis  muestras  diferentes  de  lodos  
solo  con  proceso  de  transesterificación  y  la  producción  mundial  
y  efluentes  aeróbicos:  dos  muestras  de  lodos  de  una  refinería  de  
superará  los  100  millones  de  metros  cúbicos.
petróleo,  una  muestra  de  lodos  agroindustriales,  una  muestra  de  
Con  el  uso  cada  vez  mayor  de  biocombustibles  en  todo  el  mundo,  
compostaje  y  dos  muestras  de  lodos  de  una  granja  porcina.
productos  como  el  glicerol  se  han  acumulado  en  el  medio  ambiente  
Las  diferentes  muestras  se  centrifugaron  durante  2  min  a  10.000  
[8,36].  Por  cada  nueve  toneladas  de  biodiesel  producido,  se  forma  
rpm  y  se  transfirió  1  mL  del  sobrenadante  con  jeringas  estériles  a  
alrededor  de  una  tonelada  de  glicerol  crudo  [10,14].  Para  2020,  se  
frascos  de  vidrio  de  20  mL,  cerrados  con  tapas  de  goma  y  sellos  de  
estima  que  la  producción  mundial  de  glicerol  alcanzará  los  tres  millones  
de  toneladas,  mientras  que  su  demanda  no  superará  las  500  mil   aluminio,  que  contenían  10  mL  de  medio  de  cultivo  (previamente  
autoclavado  a  120  C  durante  20  min  a  1  atm)  (g/  L):  4  (NH4)2SO4;  
toneladas  [20].  Por  lo  tanto,  debemos  buscar  formas  alternativas  de  
0,52  K2HPO4;  0,25  KH2PO4;  0,2  MgSO4.7H2O;  1,5  de  extracto  de  
utilizar  el  glicerol  para  garantizar  un  aumento  en  la  producción  de  
levadura;  1  de  peptona  bacteriológica,  30  de  glicerina  comercial  o  
biodiesel  [18].
glicerina  de  biodiesel  crudo,  1  mL  de  solución  que  contiene  
Los  procesos  biotecnológicos  se  han  convertido  en  una  opción  
oligoelementos  (g/L):  1  MnCl2.  4H2O;  0,06H3BO3;  0,037  CuSO4.  
para  la  producción  de  energía  a  partir  de  residuos  industriales  como  el  
5H2O;  0,2  CoCl2.  6H2O;  0,025  NiCl2.6H2O;  0,035  Na2MoO4.2H2O;  
glicerol.  La  fermentación  microbiológica  anaeróbica  requiere  poca  
0,14  ZnSO4.7H2O  y  0,9  mL  HCl  (37%).  El  pH  del  medio  se  mantuvo  
energía  para  generar  subproductos  que  pueden  usarse  como  fuente  
en  6,8.  Para  asegurar  un  ambiente  anaeróbico,  se  burbujeó  gas  
de  energía,  por  ejemplo,  gas  hidrógeno.  Los  estudios  muestran  que  el  
nitrógeno  en  el  medio  de  cultivo  durante  5  min.  Los  frascos  se  
uso  de  glicerol  como  fuente  de  carbono  en  las  fermentaciones  podría  
mantuvieron  durante  la  noche  en  un  agitador  orbital  (140  rpm)  a  37  C  
ser  más  ventajoso  en  comparación  con  los  sustratos  utilizados  
tradicionalmente  [21]. y  luego  se  transfirieron  a  una  incubadora  por  24  h  a  37  C.  Después  
del  tiempo  de  crecimiento,  se  realizó  la  siembra  directa  utilizando  un  
La  producción  de  biohidrógeno  por  bioconversión  de  glicerol  crudo  
asa  de  platino  en  el  mismo  medio  mencionado  anteriormente,  con  la  
puede  ser  una  buena  alternativa  para  utilizar  el  glicerol  procedente  de  
adición  de  20  g/L  de  agar.  Las  placas  se  mantuvieron  en  un  frasco  
la  producción  de  biodiesel,  que  tiende  a  acumularse  en  el  medio  
anaeróbico,  con  un  generador  anaeróbico  (Anaerobac,  Probac  do  
ambiente.  El  hidrógeno  tiene  un  alto  contenido  energético  y  es  una  
Brasil)  durante  48  h  a  37  C.  Las  muestras  de  cultivo  microbiológico  se  
fuente  de  energía  limpia  y  una  alternativa  potencial  a  los  combustibles  
tiñeron  con  Gram  y  se  observaron  con  microscopio  óptico  (Zeizz®  y  
fósiles,  que  se  están  agotando  cada  vez  más  [5,25].
Axiostrar  Binocular  Microscope) .
En  lodos  y  efluentes,  es  fácil  encontrar  microorganismos  bien  
adaptados  a  condiciones  extremas  de  supervivencia,  por  ejemplo,  pH  
extremos,  altos  niveles  de  materia  orgánica,  altas  temperaturas,  etc.
Estos  microorganismos  tienen  una  capacidad  natural  para  convertir  la   Extracción  y  amplificación  del  material  genético
materia  orgánica  en  productos  de  interés  industrial.  Pocos  estudios  
han  revelado  el  contenido  de  estas  comunidades  en La  extracción  del  material  genético  de  la  bacteria  se  realizó  con  el  kit  
países  tropicales  como  Brasil.  En  este  contexto,  el  propósito  de  este   Illustra  bacteria  genomicPrep  Mini  Spin  (GE  Healthcare),  según  
estudio  fue  aislar  y  caracterizar  bacterias  de  reactores  de  tratamiento   protocolo  del  fabricante.
de  aguas  residuales  y  lodos  activados  capaces  de  producir  biohidrógeno   La  extracción  se  cuantificó  por  espectrofotometría  (260  nm  y  280  nm),  
a  partir  de  glicerol. se  confirmó  por  electroforesis  en  gel  de  agarosa  (1,5  %  p/v)  con  la  
adición  de  colorante  en  gel  de  ácido  nucleico  GelRed™  (Biotium,  
solución  concentrada  5x)  y  se  visualizó  bajo  luz  ultravioleta. .

Materiales  y  métodos La  amplificación  del  material  genético  se  realizó  por  Reacción  en  
Cadena  de  la  Polimerasa  (PCR)  con  el  kit  Phusion™  High  Fidelity  
Sustratos PCR  (Finnzymes),  según  protocolo  del  fabricante.  Utilizamos  cebadores  
estándar  para  el  dominio  Bacteria  de  la  subunidad  16S  rRNA:  0016S­
Los  sustratos  utilizados  en  el  estudio  fueron  glicerol  crudo  obtenido  de   F  50  e  CCTGGCTCAGGAC
la  producción  de  biodiesel  por  una  planta  de  aceite  (donada  por GAACGCTGG­30  y  0016S­R  50  y  CTG  CGCTCGCTTTACGCCAAT
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4376 revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381

30 , con  el  producto  de  amplificación  a  720  pb.  Una  vez  finalizada  la   O4.2H2O;  0,002  de  ácido  nicotínico;  0,000172Na2SeO3;  0,00002NiCl2;  
reacción,  se  realizó  electroforesis  en  gel  de  agarosa  (1,5%  p/v)  con  tinción   5  de  triptona;  5  de  extracto  de  levadura;  15  de  glicerol  residual  de  biodiesel  
de  gel  de  ácido  nucleico  GelRed™  (Biotium,  solución  5x  concentrada)  y   o  glicerol  comercial;  0,5MnCl2.H2O;  0.1H3BO3;  EDTA  0,5Na2;  
el  material  amplificado  se  visualizó  en  un  transiluminador  bajo  luz  UV. 0,001CuCl2.H2O;  0.01Alk  (SO4)2.
El  inóculo  se  lavó  en  solución  salina  (0,9%),  se  resuspendió  en  el  
mismo  medio  de  cultivo  y  se  ajustó  a  diez  de  densidad  óptica  (DO),  
Purificación  y  secuenciación  de  ADN mediante  la  lectura  de  la  absorbancia  a  640  nm  en  un  espectrofotómetro.  
La  fermentación  ocurrió  durante  48  h  a  37  C  bajo  agitación.  Se  probaron  
Los  segmentos  de  nucleótidos  amplificados  se  purificaron  utilizando  las   dos  microorganismos  con  resultados  prometedores  en  cromatografía  de  
enzimas  Exonuclease  I  (Amersham  Biosciences,  2500  U)  y  Shrimp   gases,  Bacillus  amyloliquefaciens  y  Enterobacter  ludwigii,  y  el  control  
Alkaline  Phosphatase  (Amersham  Biosciences,  5000  U),  según  el   positivo  Enterobacter  aerogenes  ATCC  13048.  Para  confirmar  la  eficiencia  
protocolo  del  fabricante.  La  secuenciación  del  ADN  se  realizó  mediante   del  proceso,  se  tomó  una  muestra  de  gas  del  colector  de  muestras  de  
secuenciador  automático  ABI  PRISM  3130  xl  (Applied  Biosystems,  EE.   salida  y  se  inyectó  en  el  cromatógrafo  de  gases.  Solo  se  detectó  la  
UU.). presencia  de  gas  hidrógeno.
La  identificación  de  los  microorganismos  aislados  se  realizó  
comparando  sus  secuencias  de  ADN  con  secuencias  depositadas  en  el  
GenBank.  Los  análisis  se  realizaron  con  la  herramienta  BLAST. Ajuste  del  volumen  de  gas  El  
cálculo  para  ajustar  el  volumen  de  gas  producido  se  muestra  en  la  
Ecuación  (2)  [17].
Evaluación  de  la  producción  de  biohidrógeno
V  ¼ ðPatm  r:H:gÞ:Vexp:T (2)
Patm:  texto
Las  cepas  bacterianas  identificadas  se  cultivaron  durante  17  h  en  medio  
de  cultivo  líquido  Luria  e  Bertani  (LB)  (g/L):  10  de  triptona,  10  de  NaCl,  5   dónde:

de  extracto  de  levadura.  Se  transfirió  un  volumen  de  0,1  mL  del  medio  
líquido  a  frascos  de  vidrio  de  20  mL  que  contenían  10  mL  de  medio  de   V  ¼  volumen  de  biogás  en  CNTP  seco
cultivo  líquido  con  glicerol.  Los  matraces  se  cerraron  con  tapones  de   Patm  ¼  presión  atmosférica  r  ¼  
goma  y  sellos  de  aluminio.  Después  de  eso,  se  bombeó  gas  nitrógeno   Densidad  de  la  soda  cáustica  5%
durante  5  minutos  en  el  espacio  de  cabeza  para  garantizar  un  entorno   H  ¼  de  diferencia  entre  los  niveles  en  el  Kitasato  invertido

anaeróbico.  Los  cultivos  se  mantuvieron  en  un  agitador  orbital  a  140  rpm   matraz  con  NaOH  al  5%  y  el  matraz  colector
durante  17  h  a  37  C  y  luego  se  transfirieron  a  una  incubadora  durante  24   G  ¼  aceleración  de  la  gravedad  (m/s2 )
h  a  la  misma  temperatura.  La  producción  de  biohidrógeno  se  evaluó  a   Vexp  ¼  volumen  de  NaOH  5%  transferido  (después  de  48  h)
partir  de  100  mL  de  muestras  del  headspace  analizadas  en  un   T  ¼  Temperatura  estándar  CNTP  (273  K)
cromatógrafo  de  gases  (DaniMaster  e  Automatic  Sample  AS),  con   Texp  ¼  temperatura  experimental  (Kelvin)
columna  capilar  Carboxen™  1006  PLOT  (Supelco),  con  gas  nitrógeno  
ultrapuro  como  gas  portador.
Las  temperaturas  de  la  columna,  inyector  y  detector  fueron  40  C,  100  C  y   Cálculo  de  la  concentración  de  gas  en  el  biorreactor  La  
230  C,  respectivamente. concentración  de  gas  formada  en  el  biorreactor  se  calculó  utilizando  la  
ecuación  de  los  gases  ideales  (Ecuación  (3)).
Cuantificación  de  la  producción  de  biohidrógeno
P:V  ¼  n:R:T (3)

La  producción  de  biohidrógeno  gaseoso  se  midió  mediante  un  gasómetro   dónde:
con  matraz  invertido  adaptado  (Fig.  1).
El  biohidrógeno  gaseoso  producido  en  el  reactor  pasó  por  el  matraz   P  ¼  presión  atmosférica
de  seguridad,  cuyo  objetivo  es  evitar  posibles  fugas  del  reactor.   V  ¼  volumen
Posteriormente,  el  gas  se  burbujeó  en  el  matraz  invertido  que  contenía   n  ¼  moles  de  gas
una  solución  de  NaOH  al  5%,  provocando  que  el  CO2  presente  en  el   R  ¼  constante  universal  de  los  gases
biogás  reaccionara  con  el  hidróxido  de  sodio,  según  la  Ecuación  (1). T  ¼  temperatura  en  escala  Kelvin

Evaluación  del  glicerol  consumido
2NaOH  þ  CO2 /  Na2CO3  þ  H2O (1)
Para  determinar  la  concentración  de  glicerol  se  utilizó  la  misma  
A  medida  que  el  biohidrógeno  se  acumula  en  la  parte  superior  del   metodología  utilizada  para  la  determinación  de  sorbitol  [4].  Las  muestras  
matraz  invertido,  el  hidróxido  de  sodio  se  transfiere  al  cilindro  graduado.   se  diluyeron  en  agua  destilada  teniendo  en  cuenta  el  tiempo  de  cultivo  
El  volumen  de  biohidrógeno  está  relacionado  con  la  diferencia  en  el   adicionando  0,1  mL  de  muestra  y  0,5  mL  de  formiato  de  potasio  0,7  mol/
volumen  de  soda  en  el  matraz  colector. L.  Luego,  se  agregó  al  tubo  1  mL  de  peryodato  de  potasio  de  3,5  mm  y,  
El  cultivo  se  realizó  durante  la  noche  en  1  L  en  un  matraz  Kitassato   luego  de  1  min,  también  se  agregaron  0,75  mL  del  reactivo  que  describí  
de  1  L  mantenido  en  agitador  orbital  a  140  rpm  a  37  C  y  en  un  medio  de   en  este  ítem.  El  experimento  fue  monitoreado  por  una  muestra  de  control  
cultivo  que  contenía  (g/L):  7K2HPO4 ;  5.5KH2PO4;  1  (NH4)2SO4;   con  agua  destilada.  Las  muestras  se  mantuvieron  a  100  C  durante  2  min,  
0.25MgSO4.7H2O;  0.021CaCl2.2H2O;  0.12Na2Mo se  enfriaron  en  un  baño  de  hielo,
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revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381 4377

Fig.  1  e  Gasómetro  invertido.  (1)  con  sensor  de  temperatura  del  termostato,  (2)  agitador  magnético  con  barra  de  agitación  magnética,  (3)  matraz  
de  cultivo  Kitassato  con  (4)  entrada  de  gas  nitrógeno,  (5)  vial  de  seguridad,  (6)  matraz  invertido  Kitassato  con  NaOH  al  5%;  (7)  colector  de  
muestras  de  salida  (8),  cilindro  colector  de  sosa.

y  luego  se  añadieron  a  las  preparaciones  2,5  mL  de  agua  destilada.   características  para  evaluar  su  potencial  aplicación  en  fermentación.  
La  absorbancia  de  las  soluciones  se  midió  en  un Los  resultados  obtenidos  se  compararon  con  el  glicerol  comercializado  
espectrofotómetro  (PG  Instruments,  EE.  UU.)  a  450  nm.  Las   (Cuadro  1).
concentraciones  de  glicerol  presentes  en  las  muestras  se  determinaron   Los  valores  de  calcio  fueron  112,55  mg/L  en  glicerol  crudo  y  0,645  
mediante  curvas  de  calibración  construidas  con  soluciones  de  glicerol   mg/L  en  glicerol  comercial.  Esto  demuestra  que  el  glicerol  crudo  
entre  100  y  1000  mg/L,  las  cuales  sufrieron  el  mismo  proceso. contiene  174,50  veces  más  calcio  que  el  producto  purificado.  Estos  
El  reactivo  I  se  preparó  disolviendo  7  g  de  acetato  de  amonio  en  20   resultados  también  se  observaron  para  los  demás  parámetros,  como  
mL  de  agua  destilada,  luego  agregando  0,160  g  de  tiosulfato  de  sodio   hierro  total  (5,42  veces  superior  al  glicerol  comercial),  magnesio  total  
disueltos  en  10  mL  de  agua  y  0,5  mL  de (6,40  veces),  potasio  total  (1,28  veces)  y  sodio  (24.854,2  veces).  El  
acetilacetona  a  la  solución,  y  el  volumen  de  la  solución  se  llenó  con   nitrógeno  amoniacal  fue  de  66,41  mg/L  en  glicerol  crudo,  mientras  
agua  destilada  hasta  50  mL. que  no  se  detectó  en  glicerol  comercial.  Sin  embargo,  la  demanda  
química  de  oxígeno  fue  mayor  en  el  glicerol  comercial  (1679,063  mg/L)  
en  comparación  con  el  glicerol  crudo  (1059,398  mg/L),  mostrando  una  
menor  cantidad  de  materia  orgánica  disponible  en  la  muestra  de  
Resultados  y  discusión
residuos,  ya  que  parte  de  los  sólidos  suspendidos  no  son  asimilados.  
(Cuadro  1).
Análisis  físico  y  químico  del  sustrato.
Estas  diferencias  en  composición  y  concentración  influyen  
El  glicerol  residual  de  la  industria  del  biodiesel  y  utilizado  en  este  
directamente  en  los  procesos  de  fermentación,  ya  que  los  elementos  
trabajo  fue  analizado  por  sus  propiedades  físicas  y  químicas.
destacados  se  refieren  a  macro  y  micronutrientes  necesarios  para  el  
metabolismo  y  crecimiento  celular  de  los  microbios.  Después  del  
carbono,  el  nitrógeno  es  el  segundo  macronutriente  más  importante  
Tabla  1  e  Análisis  físico  y  químico  de  glicerol  comercial  y  glicerol   para  el  crecimiento  microbiano  [1,19].  Es  un  elemento  esencial  para  la  
crudo,  según  los  Métodos  Estándar  para  el  Examen  de  Agua  y  
síntesis  de  proteínas,  aminoácidos  y  otros  compuestos  celulares  
Aguas  Residuales  [33].
[1,19].  Para  la  estabilidad  del  ribosoma  y  la  síntesis  de  muchas  enzimas,  
Análisis Resultados  (mg/L) el  magnesio  es  esencial  [1,19].  El  calcio  ayuda  en  la  estabilización  de  
Glicerol   Glicerol   las  paredes  celulares  y  en  la  termoestabilidad  de  las  endosporas  [1,19].  
comercial crudo El  sodio  es  requerido  por  los  microorganismos  en  diferentes  cantidades,  
calcio  total 0.645 112.55 ya  que  regula  la  ósmosis  celular.  En  altas  concentraciones,  este  
concentración elemento  puede  inhibir  el  crecimiento  celular  [1,19].
Demanda  química  de  oxígeno 1679.063 1059.398
Finalmente,  el  hierro  influye  en  el  crecimiento  celular  y  participa  en  la  
Hierro  total 0.16 0.868
síntesis  de  varias  proteínas,  en  el  transporte  de  electrones  y  en  la  
Magnesio  total 0.460 2.946
No  detectado
constitución  de  citocromos,  además  del  funcionamiento  de  las  
Nitrógeno  amoniacal 66,41  ±  1,29  
5.56 7,12 hidrogenasas  [1,19].
Hidróxido  de  potasio
Sodio No  detectado 24.854,2   Por  ser  una  mezcla,  el  glicerol  crudo  puede  servir  como  fuente  de  
limpidez  pH 95% 70% carbono,  pero  esto  no  significa  necesariamente  que  sea  un  mejor  
6.6 5.4 sustrato  para  el  crecimiento  microbiano,  ya  que  entre  las  impurezas
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4378 revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381

también  puede  haber  sustancias  que  inhiban  el  crecimiento,  como  jabones,   la  materia  orgánica  se  vuelve  más  pequeña,  y  la  alta  cantidad  de  efluentes  
metanol,  cristales  de  hidróxido  de  sodio  utilizados  como  catalizador  y   químicos  puede  causar  inhibir  una  serie  de
nitrógeno  amoniacal  [2,25].  Estas  impurezas  dependen  de  la  naturaleza   microorganismos
del  aceite  vegetal  o  grasa  animal  utilizada  en  el  proceso  de   La  mayoría  de  los  microorganismos  aislados  están  poco  reportados  en  
transesterificación,  así  como  del  tipo  de  catalizadores  utilizados  en  la   la  literatura  capaz  de  describir  suficientemente  sus  características  
producción  del  biodiesel  [30,32].  Estas  características  pueden  interferir  en   bioquímicas  y  morfológicas.  De  estos,  los  géneros  Bacillus,  Shigella  y  
el  nivel  de  impacto  ambiental  causado  por  el  residuo. Enterobacter  son  los  más  conocidos.

Por  otro  lado,  el  glicerol  comercial  se  sometió  a  reacciones  de   Debido  a  su  resistencia  a  condiciones  adversas,  el  género  Bacillus  fue  
purificación,  lo  que  probablemente  disminuyó  sus  componentes  nutricionales   el  que  presentó  mayor  prevalencia  (27%)  en  el  total  de  muestras  analizadas  
e  inhibidores,  pero  aumentó  sustancialmente  su  costo  comercial  [30,32].   [38].  Pertenecen  a  la  familia  Bacillaceae,  un  grupo  bastante  heterogéneo.  
Por  lo  tanto,  es  importante  seleccionar  microorganismos  capaces  de   Presentan  diversidad  fisiológica  y  pueden  vivir  en  ambientes  ácidos  o  
transformar  el  sustrato  crudo  en  productos,  agregando  así  valor  al  proceso.   alcalinos.  Con  una  temperatura  de  crecimiento  ideal  de  30  C,  sus  esporas  
Por  otra  parte,  la  mezcla  puede  utilizarse  como  ayuda  natural  al  crecimiento   pueden  sobrevivir  a  altas  temperaturas  [38]  y  en  condiciones  adversas  [15].  
y  mantenimiento  celular  en  un  proceso  de  interés  biotecnológico. Pueden  ser  aerobios,  anaerobios  facultativos  o  anaerobios  obligados  [3,27].  
En  cuanto  al  hábitat,  suelen  ser  saprofitos,  no  patógenos  y  viven  
principalmente  en  suelos.  Bajo  el  microscopio,  aparecen  como  bastoncillos,  
Aislamiento  e  identificación  molecular  de  microorganismos Gram­positivos  (pero  pueden  ser  Gram­variables,  dependiendo  de  su  etapa  
de  crecimiento),  generalmente  móviles  y  esporulados.
Los  microorganismos  que  se  encuentran  en  las  plantas  de  tratamiento  de  
efluentes  son  seleccionados  por  condiciones  ambientales  que  a  menudo  
requieren  condiciones  fisiológicas  específicas.  Estos  microorganismos   Varias  especies  de  Bacillus  usan  glucosa  u  otros  carbohidratos  como  
tienen  una  capacidad  natural  para  convertir  la  materia  orgánica  en   fuente  de  carbono,  en  la  fermentación,  para  la  producción  de  energía.
productos  de  interés  industrial.  En  base  a  esta  característica,  optamos  por   La  capacidad  de  producir  ácidos  a  partir  de  sustratos  orgánicos  y  los  
buscar  microorganismos  naturalmente  adaptados,  que  tengan  potencial   patrones  de  asimilación  de  estos  sustratos  son  de  gran  valor  en  la  
para  producir  biohidrógeno  en  ambientes  tropicales  y  subtropicales  antes   caracterización  e  identificación  de  las  diferentes  especies  de  Bacillus  [3].  
de  recurrir  a  programas  de  mejoramiento  genético. Algunas  especies  como  Bacillus  licheniformis  y  Bacillus  subtilis  están  
encapsuladas  y  al  crecer  en  medio  sólido  forman  colonias  tipo  liquen  (secas  
En  las  diferentes  muestras  de  lodo  se  identificó  una  amplia  variedad  de   y  adheridas  a  la  superficie  del  agar).  B.  subtilis  forma  colonias  irregulares  
microorganismos  basados  en  la  secuencia  del  ARNr  16S  (Tabla  2). parecidas  a  mucoides.  Por  otro  lado,  Bacillus  amyloli  quefaciens  es  la  
fuente  de  la  enzima  de  restricción  Bam  H1,  sintetiza  algunos  antibióticos  
De  todas  las  muestras  analizadas,  la  que  presentó  mayor  diversidad   y  produce  alfa­amilasa  e  hidrógeno.  Estas  características  muestran  la  
de  microorganismos  fue  la  muestra  procedente  de  la  cría  de  cerdos,   amplia  gama  de  aplicaciones  del  género  Bacillus  en  diversos  procesos  
seguida  de  la  procedente  del  compostaje.  Esta  característica  está   biotecnológicos  [15,38].  Este  género  presenta  ventajas  sobre  los  
relacionada  con  una  alta  carga  orgánica,  orina,  heces,  material  utilizado   microorganismos  comúnmente  utilizados,  ya  que  son  resistentes  a  
como  ropa  de  cama,  agua  de  limpieza,  restos  celulares  y  pelo  de  animales   condiciones  adversas  y,  por  lo  tanto,  no  necesitan  ser  controlados  
[22].  Todas  estas  características  hacen  de  los  lodos  una  importante  fuente   estrictamente  durante  la  fermentación.  Este  género  de  microorganismos  se  
de  nutrientes.  Además,  los  efluentes  contienen  microorganismos  (coliformes)   considera  seguro  para  su  uso  en  procesos  biotecnológicos  [15,16],  ya  que  
que  se  encuentran  en  el  tracto  digestivo  de  estos  animales  y  que  son   solo  unas  pocas  especies  son  patógenas.
liberados  junto  con  las  heces  de  los  animales.  Si  tenemos  en  cuenta  los  
lodos  y  efluentes  industriales,  la  cantidad  de

Tabla  2  e  Microorganismos  identificados  en  muestras  de  lodo  de  estaciones  de  tratamiento  de  aguas  residuales,  industrias  petroleras  y  
agroindustria  mediante  la  comparación  de  secuencias  de  genes  depositadas  en  Gen  Bank  (NCBI).
Microorganismos  aislados  Lodos  de Semejanza Número  de  acceso

Enterobacter  ludwigii Refinería  de  petróleo 99%   NR  042349.1

Bacilo  amyloliquefaciens Agroindustrial/compostaje/refinería  de  petróleo/cría  de  cerdos 98%   NR  075005.1

Shigella  sonnei Compostaje/refinería  de  petróleo 99%   NR  074894.1

Bacilo  licheniformis Compostaje 99%   NR  07923.1

Shigella  flexneri Compostaje 98%   NR  026331.1

Staphylococcus  warneri Cerdo 99%   NR  102499.1

Acinetobacter  gyllenbergii Cerdo 97%   NR  042026.1

Lysinibacillus  sphaericus Cerdo 98%   NR  042073.1

Staphylococcus  epidermidis Cerdo 99%   NR  074995.1

Alcaligenes  faecalis Cerdo 97% NR  04344.1

Bacilo  atrophaeus Cerdo 99% NR  027552.1

Paenibacillus  azoreducens Cerdo 99% NR  025391.1
Paenibacillus  cookii Cerdo 97% NR  025372.1
Bacillus  subtilis Cerdo 100% NR  027552.1

citrobacter  freundii Cerdo 99% NR  028894.1

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revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381 4379

Otra  característica  de  Bacillus  es  su  capacidad  para  competir  con  otros   Los  análisis  de  cuantificación  de  la  producción  de  hidrógeno  se  realizaron  
microorganismos  para  producir  moléculas  bioactivas  como  las  acil­homoserina   utilizando  E.  ludwigii  y  B.  amyloliquefaciens,  los  microorganismos  con  mayor  
lactonasas,  lo  que  contribuye  a  su  supervivencia  cuando  se  utilizan  cultivos   producción  de  hidrógeno  analizados  en  cromatografía  de  gases.  Como  control  
mixtos  en  la  biotransformación  de  biorresiduos  [16] . positivo  se  utilizó  la  cepa  comercial  E.  aerogenes  ATCC  13048.

El  género  Enterobacter  pertenece  a  la  familia  de  las  Enter  obacteriaceae,  
que  son  anaerobios  gramnegativos  facultativos  y  quimioorganotróficos  con   Cuantificación  de  la  producción  de  biohidrógeno
metabolismo  respiratorio  y  fermentativo,  capaces  de  catabolizar  un  amplio  
espectro  de  carbohidratos  con  formación  de  ácidos  y,  en  algunas  especies,  de  
No  hubo  diferencias  significativas  entre  la  producción  de  biohidrógeno  utilizando  
gases.  Tienen  una  distribución  cosmopolita,  habitando  el  suelo,  el  agua,  las   glicerol  crudo  o  glicerol  comercial  (Fig.  2).  El  aislado  de  B.  amyloliquefaciens  
plantas  y,  en  especial,  el  tracto  digestivo  de  los  animales.  La  especie  E.   produjo  la  mayor  cantidad  de  biohidrógeno  (860  mL  H2/L  de  medio  de  cultivo),  
ludwigii  pertenece  al  grupo  de  Enterobacter  cloacae,  aunque  en  análisis   seguido  de  E.  ludwigii  (480  mL  H2/L),  utilizando  el  glicerol  crudo.
filogenéticos  estas  bacterias  forman  un  grupo  genético  distinto  [12].  Este  
género  se  describe  en  la  literatura  como  productor  de  hidrógeno;  puede  vivir   Estos  dos  resultados  fueron  superiores  a  los  encontrados  para  el  microorganismo  
en  asociación  con  las  plantas  y  promover  la  degradación  de  los  hidrocarburos.   control  E.  aerogenes  ATCC  13048,  descrito  en  la  literatura  como  productor  de  
En  el  contexto  clínico,  rara  vez  se  describen  como  patógenos,  aunque  pueden   biohidrógeno  [16].  Kumar  et  al.  (2015)  [23];  utilizando  Bacillus  thurigiensis,  
ser  patógenos  ocasionales  del  tracto  urinario  [6,9].  También  pertenecen  a  la   obtuvo  resultados  similares  a  los  de  este  estudio.  Este  experimento  produjo  
misma  familia  de  Citobacter  freundii,  un  Gram­negativo,  móvil,  mesófilo,   520­880  mL  H2/  L  a  partir  de  glicerol  como  sustrato.  Este  resultado  muestra  
anaerobio  facultativo  [7,11]. que  el  glicerol  del  biodiesel  no  inhibe  el  crecimiento  microbiano  ni  la  producción  
de  biohidrógeno.  Sarma  et  al.  (2014)  [26]  reportaron  que  el  rendimiento  con  la  
glicerina  cruda  puede  ser  menor,  debido  a  la  inhibición  de  los  jabones  presentes  
en  su  composición,  mientras  que  Ito  et  al.  (2005)  [13]  afirman  que  la  adición  
Las  bacterias  del  género  Shigella  sp.  son  anaerobios  facultativos,  inmóviles,   de  una  pequeña  cantidad  de  glicerol  residual  al  medio  de  cultivo  puede  
gramnegativos,  que  no  forman  esporas  y  que  pertenecen  a  la  familia   aumentar  las  tasas  de  producción  de  biohidrógeno.
Enterobacteriaceae.  Las  Shigellas  pueden  sobrevivir  durante  largos  períodos  
en  condiciones  adversas,  como  pH  y  temperaturas  elevados  [34].  Este  género  
es  conocido  por  causar  la  shigelosis  o  diarrea  sanguinolenta  y,  por  tanto,  los   Los  resultados  de  producción  de  biohidrógeno  obtenidos  se  pueden  
aislados  deben  ser  evaluados  para  patogenicidad,  ya  que  en  el  mismo  género   relacionar  no  solo  con  la  cantidad  o  calidad  del  glicerol  presente  en  el  medio,  
podemos  tener  microorganismos  no  patógenos  de  interés  biotecnológico. sino  también  con  la  adición  de  5  g/L  de  triptona  y  con  la  misma  cantidad  de  
extracto  de  levadura.  Esta  suplementación  es  importante  para  el  metabolismo  
microbiano  porque  estimula  la  actividad  de  las  enzimas  nitrogenasa  e  
La  estación  de  tratamiento  de  la  refinería  de  petróleo  está  ubicada  en  una   hidrogenasa  durante  la  fermentación  [16].  Las  fuentes  de  nitrógeno  pueden  
región  de  clima  tropical  y  de  ella  se  aislaron  dos  especies  de  Enter  obacter:  E.   aumentar  la  producción  de  gas  hidrógeno  hasta  en  un  3,5  %  [2,13].
ludwigii  y  Shigella  sonnei.  Las  otras  estaciones  de  tratamiento  están  ubicadas  
en  biomas  de  clima  subtropical. No  se  reportó  variación  en  el  rendimiento  para  los  tres  microorganismos  
Se  observó  una  prevalencia  de  Bacillus  en  aislamientos  de  climas  subtropicales.   evaluados  cuando  se  utilizó  glicerol  comercial  (Cuadro  3).  Los  valores  se  
El  hecho  de  que  se  trate  de  un  grupo  de  microorganismos  formadores  de   mantuvieron  constantes  en  0,3  mol  H2/mol  de  glicerol,  lo  que  corresponde  al  
esporas  y,  por  tanto,  más  resistentes  a  las  variaciones  de  temperatura,  podría   10%  del  rendimiento  teórico.  Al  analizar  el  glicerol  crudo,  observamos  una  
explicar  esta  prevalencia. pequeña  variación  en  el  rendimiento,  con

Evaluación  de  la  producción  de  biohidrógeno
1000
a glicerol
El  análisis  cromatográfico  mostró  que  los  aislados  Enterobacter  ludwigii,  
800 glicerol  crudo
Shigella  sonnei,  Bacillus  licheniformis,  Ba  cillus  amyloliquefaciens,  
Staphylococcus  warneri,  Alcaligenes  faecalis,  Bacillus  subtilis,  Bacillus   600
a
atropheus  y  Citrobacter  freundii  fueron  capaces  de  producir  hidrógeno  utilizando   a
a a a

glicerol  o  biodiesel  glicerol  como  fuente  de  carbono,  mientras  que  los  aislados   400

Shigella  flexneri,  Acinetobacter  gyllenbergii,  Lysinibacillus  sphaericus,  
200
Staphylococcus  epidermidis,  Paenibacillus  azoreducens  y  Paeni  bacillus  cookii  
no  mostraron  esta  capacidad.
0

E.  ludwigii
Los  cromatogramas  muestran  que  S.  sonnei  fue  el  microorganismo  con   E.  aerogenes

mejores  resultados.  El  género  Shigella  no  se  usa  comúnmente  como  cultivo  
B.  amyloliquefaciens
puro  en  fermentaciones  debido  a  su  patogenicidad.
Algunos  estudios  reportan  la  presencia  de  este  microorganismo,  al  identificar  
componentes  de  un  cultivo  mixto  [37],  y  describen  su  cultivo  mixto  formado  por   Fig.  2  e  Producción  de  hidrógeno  (mL)  48  h  de  cultivo  a  pH  6,8  y  37  C.  
Escherichia,  Klebsiella,  Shigella  y  Cupriavidus.  Ante  la  preocupación  por  la   Mediciones  por  triplicado  y  desviación  estándar  estimada.  Valores  
patogenicidad  del  microorganismo  aislado,  optamos  por  no  continuar  con  las   marcados  con  la  misma  letra  do
pruebas  con  Shigella. no  difieren  significativamente  (p  <  0,05),  análisis  estadístico  ANOVA  
y  posteriormente  mediante  la  prueba  t  de  Student.
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4380 revista  internacional  de  energía  de  hidrógeno  41  (2016)  4374  e4381

una  mayor  variedad  de  cepas  productoras  de  hidrógeno.  El  
Tabla  3e  Rendimiento  de  producción  de  hidrógeno  usando  
microorganismo  identificado,  Bacillus  amyloliquefaciens,  mostró  los  
glicerol  puro  y  crudo  como  fuente  de  carbono.
mayores  rendimientos  de  producción  de  hidrógeno  utilizando  glicerol  
Microorganismo Producción  de  H2  (mol  H2/mol  glicerol)
crudo  como  única  fuente  de  carbono.  Por  lo  tanto,  el  glicerol  crudo  del  
Glicerol   glicerol  
biodiesel  se  puede  emplear  en  la  producción  de  hidrógeno.  Los  
comercial biodiésel microorganismos  presentes  en  los  efluentes  tienen  potencial  biotecnológico  
Enterobacter  aerogenes 0,35  ±  0,26a   0,13  ±  0,10a   para  producir  gas  hidrógeno  como  combustible  y/o  como  fuente  de  
Enterobacter  ludwigii 0,35  ±  0,05a   0,35  ±  0,10a   energía  limpia  y  renovable.
Bacilo   0,30  ±  0,00a 0,50  ±  0,20a
amyloliquefaciens

*48  horas  de  cultivo  a  pH  6,8  y  37  C.  Mediciones  por  triplicado  y  desviación  
estándar  estimada.  Los  valores  marcados  con  la  misma  letra  no  difieren  
significativamente  (p  <  0,05),  análisis  estadístico  ANOVA  y  posterior  prueba   Expresiones  de  gratitud
t  de  Student.
Este  trabajo  recibió  apoyo  financiero  de  Petrobras/CENPES  
(0050.007.3626.12.9).
siguientes  resultados:  E.  aerogenes  0,13  mol  H2/mol,  E.  ludwigii  0,35  mol  
H2/mol  y  B.  amyloliquefaciens  0,50  mol  H2/mol.
Por  tanto,  destacamos  a  B.  amyloliquefaciens  entre  los  aislados  que  
además  de  mostrar  los  mayores  rendimientos  en  la  producción  de  H2   referencias
alcanzan  el  17%  del  rendimiento  teórico.  Este  microorganismo  está  
descrito  en  la  literatura  por  sus  actividades  en  diversos  procesos  
biotecnológicos;  sin  embargo,  es  poco  conocido  como  productor  de   [1]  Alshiyab  H,  Kalil  MS,  Hamid  AA,  Yusoff  WMW.  Efecto  de  los  metales  
hidrógeno,  siendo  reportado  recientemente  por  la  Ref.  [31]  usando  glucosa   traza  en  la  producción  de  hidrógeno  usando  C.  acetobutylicum.  
como  sustrato. J  Biological  Sci  2008;8:1e9.
[2]  Alvarado­Cuevas  ZD,  Acevedo  LGO,  Salas  JTO,  León­
No  hay  informes  en  la  literatura  de  estudios  que  utilicen  E.  ludwigii  
Rodríguez  AD.  Las  fuentes  de  nitrógeno  afectan  la  producción  de  hidrógeno  
para  la  producción  de  hidrógeno.
por  parte  de  Escherichia  coli  utilizando  suero  de  queso  como  sustrato.  
En  cuanto  al  rendimiento  obtenido,  nuestros  resultados  fueron   Nueva  Biotecnología  2013;6:585e90.
superiores  a  algunos  reportes  en  la  literatura.  Con  inóculo  tratado   [3]  Barros  AR,  Adorno  MAT,  Sakamoto  IK,  Maitinguer  SI,  Varesche  MBA,  
térmicamente,  el  rendimiento  obtenido  fue  entre  0,28  y  0,31  mol  H2/mol   Silva  EL.  Evaluación  del  desempeño  y  caracterización  filogenética  de  
de  glicerol  [28].  Utilizando  un  cultivo  mixto  Temudo  et  al.  (2008)  [35],   reactores  anaerobios  de  lecho  fluidizado  utilizando  llanta  molida  y  pet  
obtuvo  0,05  mol  de  H2/mol  de  glicerol,  resultado  considerablemente   como  materiales  de  soporte  para  la  producción  de  biohidrógeno.  Bioresour  
Technol  2011;102:3840e7.
inferior  a  los  obtenidos  en  este  trabajo.  Es  difícil  comparar  los  presentes   ^

[4]  Carra  S.  Estudo  cinético  da  produce  ̧ao  de  ~  acido  lactobi  onico  e  sorbitol  por  
resultados  con  los  descritos  en  la  literatura  porque  difieren  los  sustratos  y  
enzimas  periplasmaticas  
~
de  Zymomonasmobilis  [Dissertac¸ao  de  Mestrado].  
los  microorganismos  utilizados  para  la  fermentación.  Los  diferentes   Caxias  do  Sul/RS:  
Programa  de  Pos­Graduac  ̧ao  em  Biotecnologia,  
~
sustratos  influyen  directamente  en  la  ruta  metabólica  utilizada  por  el   Universidade  de  Caxias  do  Sul;  2012  [Mestrado  en  Biotecnología].
microorganismo  y,  en  consecuencia,  en  la  cantidad  de  hidrógeno  
producido.  También  es  difícil  comparar  los  rendimientos  de  fermentación,   [5]  Chaganti  SR,  Lalman  JA,  Heath  DD.  Basado  en  el  gen  16S  rRNA
porque  no  hay  medidas  uniformes  para  presentar  los  resultados.  Es   análisis  de  la  diversidad  microbiana  y  producción  de  hidrógeno  en  
tres  cultivos  anaerobios  mixtos.  Int  J  Hydrogen  Energy  
necesario  estandarizar  las  unidades  utilizadas  para  expresar  la  producción  
2012;37:9002e17.
de  biohidrógeno.
[6]  Choi  J,  Ahn  Y.  Características  de  la  fermentación  de  biohidrógeno  a  partir  de  
Sinha  &  Pandey  (2014)  [29]  proponen  el  uso  de  sistemas  híbridos   varios  sustratos.  Int  J  Hydrogen  Energy  2014;39:3152e9.
(fotosíntesis  y  fermentación  oscura)  para  aumentar  el  rendimiento,  ya  
que  la  fermentación  produce  una  cantidad  considerable  de  ácidos  volátiles   [7]  Chookae  T,  O­Thong  S,  Prasertsan  P.  Producción  de  biohidrógeno  a  partir  de  
utilizados  en  la  fotosíntesis.  Los  autores  obtuvieron  un  rendimiento  máximo   glicerol  crudo  por  Klebsiella  sp  inmovilizada.  TR17  en  un  reactor  USB  y  
cuantificación  bacteriana  en  condiciones  no  estériles.  Int  J  Hydrogen  Energy  
de  0,22  ±  0,05  mol  H2/mol  de  sacarosa.  Incluso  usando  un  sustrato  con  
2014;39:9580e7.
más  energía  (glucosa)  y  un  sistema  híbrido,  los  resultados  mostraron  
[8]  Demirbas  A.  Impactos  políticos,  económicos  y  ambientales  de  los  
tasas  más  bajas  de  producción  de  hidrógeno  en  comparación  con  las   biocombustibles:  una  revisión.  Appl  Energy  2009;86:108e17.
obtenidas  en  nuestro  experimento. [9]  Grimont  F,  Grimont  PAD.  El  género  Enterobacter.
El  aislamiento  de  una  nueva  cepa  trae  nuevas  perspectivas  a  la   Procariontes  2006;6:197e214.
producción  de  biohidrógeno;  sin  embargo,  se  necesita  una  investigación   [10]  Guo  A,  Guo  L,  Cao  C,  Yin  J,  Lu  Y,  Zhang  X.  Hidrógeno
más  detallada  del  rendimiento  en  diferentes  condiciones  y  diferentes   producción  a  partir  de  glicerol  por  gasificación  con  agua  supercrítica  en  un  
reactor  tubular  de  flujo  continuo.  Int  J  Hydrogen  Energy  2012;37:5559e68.
procesos  de  fermentación.

[11]  Hamilton  C,  Hiligsmann  S,  Beckers  L,  Masset  J,  Wilmotte  A,  Thonart  P.  
Optimización  de  las  condiciones  de  cultivo  para  la  producción  biológica  de  
Conclusiones hidrógeno  por  Citrobacter  freundii  CWBI952  en  modo  de  funcionamiento  por  
lotes,  por  lotes  secuenciados  y  semicontinuo.  Int  J  Hydrogen  Energy  
2010;35:1089e98.
En  la  comunidad  microbiana  de  los  lodos  de  las  estaciones  de  tratamiento  
[12]  Hoffman  H,  Stindl  S,  Stumf  A,  Mehlen  A,  Monget  A,
de  efluentes,  identificamos  microorganismos  capaces  de  producir   Heesemann  J,  et  al.  Descripción  de  Enterobacter  ludwigiisp.
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