Métodos moleculares en la

identificación eritrocitaria
Dr. Higinio Estrada Juárez
Investigador en Ciencias Médicas
Hematología Perinatal
“Prevenir en un porcentaje significativo la aloinmunización
potencialmente fatal en los receptores de transfusiones requiere una
evaluación de los sistemas de grupos sanguíneos ABO y RhD. Siendo,
los sistemas Kell, Kidd, y Duffy los clínicamente más significativos “

Dr. Christoph Gassner, investigador principal del estudio publicado en Transfusion y Jefe de
Investigación y Desarrollo del Servicio de Transfusión Sanguínea de la Cruz Roja en Zurich, Suiza.
Criterios que definen un grupos sanguíneos
• El antígeno debe ser definido por un aloanticuerpo humano
• El antígeno debe ser un carácter heredado
• El gen que codifica debe haber sido identificado y secuenciado
• Debe conocerse su localización cromosómica
• El gen debe ser diferente y no un homólogo estrechamente
relacionado a los otros genes que codifican antígenos de grupos
sanguíneos de los sistemas existentes.
 Sistemas de grupos sanguíneos
Sistema Alelos Ag Sistema Alelos Ag Sistema Alelos Ag
346 4 013 Scianna 9 7 025 Raph 4 1
001 ABO
002 MNS 51 48 014 Dombrock 20 9 026 John Milton Hagen 12 6
003 PPK 65 3 015 Colton 12 4 027 I 13 1

132,290 56 016 LW 10 3 028 Glob 13 2

004 Rh
005 Lutheran 20 21 017 Chido/Rodgers 3,4 9 029 Gil 8 1
006 Kell 83 35 018 H 120 1 030 RhAg 26 4
007 Lewis 53,20,2 6 019 Xk 35 1 031 FORS 2 1
008 Duffy 13 5 020 Gerbich 10 11 032 Junior 25 1
009 Kidd 36 3 021 Cromer 15 18 033 Langereis 42 1
010 Diego 91 22 022 Knops 35 9 034 Vel 4 1
011 Cartwrigth 4 2 023 Indian 4 4 35 CD59 1
012 Xg 2 2 024 Ok 5 3 036 V A C A N T E

NCBI dbRBC 27 Marzo 2015

Página web The ISBT Working Party for Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology
Los grupos sanguíneos humanos
Hasta la década de 1990, el
diagnóstico y tipificación de sangre
dependían enteramente de técnicas
serológicas.

Durante más de un siglo, la

aglutinación ha sido el estándar de oro
para la detección de antígenos
eritrocitarios (RBC) y se utiliza en todos
los servicios de medicina transfusional.
 Introducción
La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero/plasma de pacientes o reactivos
comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología:
• Determinación de grupo ABO, Rh.
• Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy)
• Detección de anticuerpos irregulares.
• Pruebas de compatibilidad.
Limitaciones:
• Fenotipo de pacientes politransfundidos.
• Fenotipo de pacientes con GR recubiertos de Ig.
• Identificación de variantes.
• Discrepancias.
• Falta de reactivos para detección de algunos antígenos.
• Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.
 Introducción
• Las técnicas que involucran al ADN han llevado a
entender las bases moleculares de los sistemas
sanguíneos.
• Los eventos moleculares llevan a la formación de
antígenos distintos, y por ende, fenotipos
distintos.
• La mayoría son consecuencia de SNPs.

Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación

Utilidades
Resolución de
Donadores Materno-fetal
discrepancias
• Para posibles • D variantes • Para prevención de
transfusiones de • Discrepancias ABO EHRN (por
concentrados incompatibilidad
eritrocitarios Rh).
(búsqueda de • DNA fetal se puede
unidades antígeno obtener a partir de
negativos). células amnióticas,
• Para crear paneles muestras de
de células para vellosidades
búsqueda de coriónicas y de
anticuerpos plasma materno.
irregulares.
 Rh
SC
FY GE GLOB MNS
CROM
KN

I CO
Sistema ABO GIL RAPH
CH/RG YT DO
primer marcador AB0 IN
RHAG KEL
genético utilizado

JMH DI JK

LE
OK XG
LW P1 XK
LU
H
Los antígenos de los grupos sanguíneos . .
son productos génicos!!!
Los antígenos son proteínas que están
codificados directamente por los genes

Los carbohidratos de los son antígenos

son controlados por los genes que
codifican glicosiltransferasas

Los polimorfismos de GS son definidos

genéticamente

Todos los genes ya han sido

secuenciados
 Mecanismos moleculares de diversidad de los
grupos sanguíneos
Mecanismo molecular Ejemplo
Polimorfismo de un solo nucleótido • La mayoría de los grupos sanguíneos.
• T>C en GATA del gen FY (Fya-b-).
• ag>aa en el fenotipo Jka-b-.
Deleción • RhD negativo por este mecanismo.
• Exón 2 del GYPC en el fenotipo Yus.
• RhD negativo 711Cdel.
Inserción • RhD negativo por psudogen RHDΨ 37pb.
• Duplicación del exon 3 del GYPC en Lsa+.
• 798-804Gins del ABO que produce Ael.
Exón alternativo • Exón 1 en individuos I negativo.
Eventos de conversión o recombinación • Muchos genes híbridos de los sistemas MNS y
génica Rh.
Ausencia o alteración de la interacción • RhAg en Rh nulo tipo regulador y tipo mod.
requerida entre proteínas. • In (Lu) en Lua-b- dominante.
Presencia de genes modificadores

Storry JR. BJH 2004;759-71, Daniels G Transplant Immunol 2005;14:143-53, Reid MD 2008; Immunohematol 24(4):166-9
Métodos moleculares para la genotipificación de grupos
sanguíneos

Rendimiento Tecnología
 PCR punto final.
 PCR-RFLP.
Bajo
 PCR-SSP.
 PCR multiplex.
 PCR en tiempo real
 Secuenciación Sanger y sus modificaciones.
Mediano  BeadChip
 Luminex XMAP
 MLPA (Multiplex Ligation-depent Probe Amplification)
 BloodChip
 Taqman open Arrays.
 Genome Lab SNP Stream,
Alto
 Minisecuenciación (SNaPshot assays).
 MALDI-TOF MS.
 Secuenciación masiva.
Monteiro F y cols. 2011, ISBT Sc Ser 6:1-6
PCR Alelo Específico
• Uso de primers de secuencia específica. Mixes de reacción
pre-alicuotados
• Permite la amplificación de secuencias específicas basados en PCR –
para identificar distintos alelos de un gen. (Sequence Specific
Primers: SSP).
Genotipificación
rápida.

Complemento a
tipificación
serológica.

J. of Mol Diag, 12:4 2010

 Ensayos basados en PCR clásica (bajo rendimiento)
Multiplex PCR
PCR-RFLP AS-PCR o PCR-SSP
Sin embargo . . .
Los ensayos basados en la PCR son propensos a diferentes tipos de
errores. Por ejemplo, la contaminación por la amplificación de
productos inespecíficos puede dar lugar a resultados falsos positivos.
Se menciona que la identificación de un genotipo particular no significa
necesariamente que el antígeno se expresa en la membrana de RBC.
Ensayos de mediano rendimiento
 Real time PCR
• Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto
simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto).
• Se distinguen entre sí por el método de
detección:
• Fluorocromo no específico.
• SYBR Green (se une a cualquier molécula
de ADN).
• Fluorocromo específico (sonda):
• Sondas TaqMan
• Sondas Molecular Beacons
• Sondas Scorpion
• Se cuantifica la fluorescencia emitida
Secuenciación tipo Sanger

¿Cuándo secuenciar?

Serología Genotipificación Secuenciación

MLPA
Ensayos de alto rendimiento
Ensayos de alto rendimiento
• Microarray
• BeadChip array
• BloodChip
• Genome Lab SNP stream
• Fluidic microarray systems (Luminex XMAP)
• TaqMan OpenArray
• MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-
flight mass spectrometry)
• Mini-sequencing
Microarreglos
• Un micorarray de ADN permite llevar a cabo un
experimento sobre miles de genes al mismo tiempo.
• Cada punto en un microarray contiene múltiples hebras
idénticas de ADN.
• La secuencia de ADN en cada punto es único.
• Cada punto representa un gen.
• Miles de puntos están dispuestos en filas y columnas
ordenadas en una superficie sólida (por lo general vidrio).
• La ubicación exacta y la secuencia de cada punto se
registra en una base de datos informática.
• Los microarrays pueden ser del tamaño de un
portaobjetos de microscopio, o incluso más pequeño.
Genotipificación de 29
polimorfismos (37 fenotipos)
Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS, Diego,
Dombrock, Colton, Cartwright, y
Lutheran

Detecta 24 polimorfismos,
asociados a 38 variantes de
antígenos y fenotipos en un único
ensayo.
Microarrays
• Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN
adheridas de forma ordenada a una superficie sólida.
• Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente.
• Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su
complementario.
• Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o
quimioluminiscencia.
• Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada
chip con bases de datos para generar los genotipos.
Microarrays
• En una misma prueba genera sobre 3000 resultados.
• Se basa en la detección de SNPs.
• El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se
captura y se marca con fluorescencia por elongación en sondas alelo
específicas inmovilizadas en micropartículas sintéticas. La
fluorescencia de cada perla se analiza en el Array Imaging System
(AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS)
calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un
genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.
ADN array -Chips
• Gran número de muestras (buena plataforma para los donantes de
sangre)
• PCR multiplex
• Análisis rápido y automático pós-PCR para numerosos polimorfismos
de sangre
• Sistema cerrado para evitar la contaminación
• Análisis computarizado de los resultados
• Realiza las interpretaciones a partir de una base de datos
Conclusiones
• La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas
que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación.
• Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos.
• Tipificación de pacientes con transfusiones recientes.
• Identificación de riesgo de EHRN.
• Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión.
• Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a
expresar en el GR.
• La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que
se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación
para disminuir costos, manteniendo la calidad.
• How do we identify RHD variants using a practical molecular
approach? Revista Transfusion, volumen Importancia: • Prevenir la
aloinmunización en receptores. Receptor D parcial Tipificado Rh+
(Sueros clasificadores) Transfusión con Rh+ 54, Abril de 2014.
Formación de anti-D Donante D débil Tipificado Rh- (Sueros
clasificadores) Transfundido a receptor Rh- Formación de anti-D
• Free DNA Fetal Kit® RhD
SNPs (mutaciones puntuales missenses)
• AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGA
GACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
(FY B) A (Asp42)
(FY A) G (Gly42)
• RH: C/c (Ser103Pro); E/e (Pro226Ala)
• MNS: S/s
• Kell: K/k, Kpa /Kpb , Jsa/Jsb
• Diego: Dia /Dib
• Duffy: Fya/Fyb
• Kidd: Jka/Jkb
• Lutheran: Lua/Lub
• Dombrock: Doa /Dob
Tipos arrays genotipificacion

BLOODchip® http://www.progenika.com/nort
h_america/index.php?option=co
m_content&task=view&id=317&I
temid=383

BioArray HEA BeadChip http://www.immucor.com/Globa

l/Products/Pages/Red-Cell-
Genotyping.aspx