CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un potente método de separación que tiene aplicación en todas las ramas
de la ciencia. La técnica fue inventada y denominada así por el botánico ruso Mikhail Tswett
a principios del siglo XX. Él la usaba para separar varios pigmentos vegetales, haciendo pasar
soluciones de estos compuestos a través de una columna de vidrio rellena con carbonato de
calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían como bandas coloreadas en la
columna, lo que justifica el nombre que eligió para el método (del griego chroma que
significa “color”, y graphein que significa “escribir”).
Las aplicaciones de la cromatografía han aumentado en forma explosiva en los últimos
cincuenta años debido no sólo al perfeccionamiento de nuevos y diversos tipos de técnicas
cromatográficas, sino también a las necesidades crecientes de los científicos de mejores
métodos para la caracterización de mezclas complejas. La cromatografía permite separar
mezclas complejas que de otra forma serían imposibles de separar.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve con una fase móvil, que
puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico, la cual se hace pasar a través de una
fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie sólida. Las dos fases se
eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen en grados distintos entre
la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por
la fase estacionaria se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase móvil. En cambio,
los componentes unidos débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como
consecuencia de las distintas velocidades de migración, los componentes de la muestra se
separan en bandas o zonas distintas que se pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa.
CLASIFICACIÓN
La primera clasificación se basa en los medios físicos por medio de los cuales la fase
estacionaria y móvil se ponen en contacto.
• Cromatografía en columna: un tubo estrecho que contiene la fase estacionaria a
través de la cual la fase móvil se fuerza a pasar por presión.
• Cromatografía en plano: la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o en los
intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Otra clasificación es:
• Cromatografía de gases.
- Gas-solido
- Gas-liquido

• Cromatografía de líquidos.
-Liquido-liquido o reparto
 -Liquido-sólido o adsorción
-Exclusión por tamaño
-Afinidad
-Intercambio de iones
• Cromatografía de fluidos supercríticos
CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN EN COLUMNA
Dos sustancias A y B se separan en una columna empacada mediante elución. La columna
está constituida por un tubo angosto relleno con un sólido inerte finamente dividido que
mantiene a la fase estacionaria en su superficie. La fase móvil ocupa los espacios abiertos
entre las partículas del material de empaque. Para empezar, una solución de la muestra que
contiene una mezcla de A y de B en la fase móvil se introduce en la parte superior de la
columna como un tapón angosto en el tiempo tn. Entonces los dos componentes se
distribuyen entre las fases móvil y estacionaria. La elución implica la purificación de una
especie por lavado en una columna mediante la adición continua de fase móvil nueva.
VELOCIDADES DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS
La eficacia de una columna cromatográfica para separar dos solutos depende en parte de las
velocidades relativas con las que se lavan o se purifican las dos especies.
Constantes de distribución
𝐴𝑚ó𝑣𝑖𝑙 ⇄ 𝐴𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎
(𝑎𝐴 )𝑆
𝑘𝑐 =
(𝑎𝐴 )𝑀
Donde:
Kc= constante de distribución.
(aA)S = actividad del soluto A en la fase estacionaria.
(aA)M= actividad del soluto en la fase móvil.
Los coeficientes de actividad se acercan a la unidad cuando:
• Existen concentraciones bajas.
• Intervienen especies no iónicas
Entonces la ecuación anterior se reescribe de la siguiente manera:
𝐶𝑠 𝑛𝑠 /𝑉𝑠
𝑘𝑐 = =
𝐶𝑀 𝑛𝑀 /𝑉𝑀
Donde:
ns y nM =cantidades molares del analito en las dos fases.
Vs y VM = volúmenes de las dos fases.
TIEMPOS DE RETENCIÓN
Es el tiempo para que el analito llegue al detector después de la inyección de la muestra (tR)
y se expresa:
𝑡𝑅 = 𝑡𝑀 + 𝑡𝑆
El tiempo muerto tM: es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el
detector.
FACTOR DE SELECTIVIDAD
Describe el grado de separación de dos componentes en una columna:
𝐾𝐴 𝑘𝐴 (𝑡𝑅 )𝐵 − 𝑡𝑀
𝛼= = =
𝐾𝐵 𝑘𝐵 (𝑡𝑅 )𝐴 − 𝑡𝑀
EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Dos términos afines se utilizan ampliamente como medidas cuantitativas de la eficiencia de
una columna cromatográfica:
a) Altura del plato
𝜎2
𝐻=
𝐿
La longitud de la columna que contiene una fracción del analito comprendida entre L
y L-σ
b) La cantidad de platos teóricos
TEORÍA DEL PLATO (MARTIN Y SYNGE)
Considera que una columna cromatográfica está compuesta por una serie de estrechas capas
horizontales continuas y separadas.
Se supone que en cada plato tiene lugar el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil.
La eficiencia de una columna cromatográfica como dispositivo de separación mejora a
medida que aumenta el número de equilibrios
𝐿 𝑡𝑅 2
𝑁 = = 16 ( )
𝐻 𝑊
Donde:
N= número de platos teóricos.
L=longitud de la columna.
H=altura del plato.
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
CROMATOGRAFÍA DE GAS-LÍQUIDO (CGL)
Tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia; su denominación se suele abreviar
a cromatografía de gases (CG).
En la cromatografía gas-líquido el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase
líquida inmovilizada sobre la superficie de un relleno sólido inerte o en las paredes de un
tubo capilar.
CROMATOGRAFÍA GAS-SÓLIDO
Se basa en una fase estacionaria sólida en que la retención de los analitos ocurre porque hay
adsorción.
Su aplicación es limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o
polares y a la obtención de picos de elución con colas muy notables.
En cromatografía de gases los componentes de una muestra vaporizada se separan como
consecuencia de que se reparten entre una fase gaseosa y una fase estacionaria contenida en
una columna.
Al efectuar una separación cromatográfica de gases, la muestra se vaporiza y se inyecta en la
cabeza de una columna cromatográfica. La elución se lleva a cabo mediante el flujo de una
fase móvil de gas inerte.
A diferencia de la mayoría de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa
con las moléculas del analito; su única función es transportar este último a través de la
columna.
INSTRUMENTACIÓN
Un cromatógrafo de gases consiste en:
• Fase móvil: generalmente son gases inertes como helio, argón o nitrógeno.
• Puerto de inyección: lugar donde se inyecta la muestra mediante microjeringas
calibradas estas se utilizan para inyectar muestras líquidas, a través de un diafragma
de goma de silicón, en una cámara caliente especial para la muestra que se ubica en
la cabeza de la columna.
• Horno de la columna: almacena la columna y regula la temperatura de operación de
la misma.
• Columna, pueden ser:
- Columnas empacadas.
- Columnas tubulares abiertas.
• Fase estacionaria: es la encargada de separar los componentes de la muestra.
• Detector, pueden ser del tipo:
 - Detectores de ionización de llama.
- Detector de conductividad térmica.
- Detector de captura de electrones.
- Detectores termoiónicos.
- Detectores de conductividad electrolítica.
- Detector de fotoionización.
- Detectores de emisión atómica.
- Detector fotométrico de flama.
- Detectores de espectrometría de masas.
• Sistema de registro de datos.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
La cromatografía de líquidos de alta resolución es una técnica que permite separar, aislar e
identificar los analitos de una mezcla de compuestos químicos, utilizando una fase móvil
líquida que fluye a través de la columna forzada por una alta presión suministrada por una
bomba.
Es altamente utilizada por su capacidad de separar especies no volátiles, y por su
aplicabilidad a sustancias en la industria. Como los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, plaguicidas, antibióticos y variedad de sustancias inorgánicas.
En esta cromatografía existe una fase móvil, que ocupa una bomba para que recorra el
sistema. Y una fase estacionaria en la columna, donde la temperatura puede controlarse.
CLASIFICACIÓN
• CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O PARTICIÓN: la separación se lleva a cabo
por diferencias en las solubilidades.
• CROMATOGRAFÍA DE ABSORCIÓN: La separación se logra por las diferencias
en solubilidad (en fase móvil) y de retención por adsorción (en fase estacionaria) de
la mezcla de solutos.
• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO: la fase estacionaria y la fase
móvil son de naturaleza iónica. Las fases compiten con los solutos los cuales son
atraídos por fuerzas electrostáticas.
• CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO: se aplica a especies de
alto peso molecular, separa los solutos en función de su tamaño molecular.
INSTRUMENTACIÓN
Los equipos de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) trabajan a grandes
presiones por lo que son complejos y caros. Cuentan con:
• Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil.
• Sistema de bombeo.
 • Sistema de inyección de muestra.
• Columna cromatográfica.
• Detector
Este tipo de cromatografía emplea dos tipos de elución:
• Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de disolventes
de composición constante.
• Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya
concentración se hace variar a lo largo del proceso, con el fin de modificar la
polaridad de la fase móvil y disminuir el tiempo de separación.