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CROMATOGRAFA

CROMATOGRAFA
I.

Fue inventada por el botnico ruso Mikhail Tswett a


principios de siglo pasado.

II.

Emple lo que conocemos ahora como cromatografa en


columna para separar clorofilas y xantofilas de plantas.

III. Utiliz una columna de CaCO3 y los componentes


separados se vean como bandas coloridas en la columna.
IV. De ah que el nombre de cromatografa se refiera a chroma
(color en griego) y graphein (escribir en griego).

Definicin
MTODO FISICOQUMICO DE SEPARACIN, EN
EL CUAL LOS COMPONENTES QUE SE VAN A
SEPARAR SE DISTRIBUYEN ENTRE DOS FASES;
UNA DE ESTAS FASES CONSTITUYE UNA CAPA
ESTACIONARIA DE GRAN REA SUPERFICIAL,
LA OTRA ES UN FLUIDO QUE ELUYE A TRAVS O
A LO LARGO DE LA FASE ESTACIONARIA.

CROMATOGRAFA
FASE MOVIL
FASE ESTACIONARIA
ELUCIN: Proceso de transporte de
una especie a travs de la fase
estacionaria por la adicin continua
de nueva fase mvil

PROCESO DE ELUCIN

Fase mvil
(eluyente)
Mezcla de protenas
a separar
Fase
Estacionaria
Soporte
poroso
Eludo o
eluato

Protenas

CLASIFICACIN
I.

Soporte para la fase estacionaria: C. en columna y C. plana.

II. Tipo de fase mvil: C. de lquidos y C. de gases.


III. Principio fisicoqumico de separacin: C. de adsorcin, C. de
distribucin (reparto), C. de intercambio inico, C. de
exclusin molecular (filtracin en gel), C. de afinidad.

CLASIFICACIN
F. mvil F. estacionaria

lquido lquido

Distribucin (reparto)

lquido slido

Adsorcin
Intercambio inico
Exclusin molecular
Afinidad

C. DE LQUIDOS

gas lquido

Distribucin (reparto)
Afinidad

gas slido

Adsorcin

C. DE GASES

PRINCIPIO DE LA SEPARACIN CROMATOGRFICA


LA BASE DE TODAS LAS FORMAS DE CROMATOGRAFA ES EL COEFICIENTE DE
DISTRIBUCIN (Kd) QUE DESCRIBE LA MANERA EN LA QUE UN COMPUESTO SE
DISTRIBUYE ENTRE LAS DOS FASES INMISCIBLES (FE Y FM):

Si un compuesto A se tiene un coeficiente de distribucin de 1 y se adicionan 32 g a


la columna en 1 mL de fase mvil:
Estado

Fase mvil
(eluyente)
Mezcla de protenas
a separar
Fase
Estacionaria
Soporte
poroso
eludo

Las protenas se separan porque


tienen diferente velocidad de
elucin que depende de la Kd

Protenas

Fase mvil
bomba
peristltica

Fase mvil

reservorio de
la fase mvil

pistn ajustable

Columna de vidrio
Empaque de
la columna

Disco de Nylon

pistn ajustable
lana de vidrio

Eluido que va al colector


de fracciones y/o al
detector

Equipo bsico
para
cromatografa en
columna

CROMATOGRAMA

Seal de detector

Adicin de la
muestra

Lnea
base

T i e m p o o volumen

(a) Cromatograma de 2 componentes con completa resolucin


(b) Cromatograma de 2 componentes con resolucin incompleta
(c) Cromatograma de un componente que muestra una cola

Teora de la cromatografa
El xito de la separacin cromatogrfica de los componentes de una
mezcla, depende de la apropiada seleccin del tipo de cromatografa y de
la OPTIMIZACIN de las condiciones experimentales asociadas a la
separacin.
La efectividad de una columna cromatogrfica para separar dos analitos,
depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Las velocidades estn determinadas por la magnitud de las
constantes de los equilibrios de distribucin de las especies entre las fases
estacionaria y mvil.

CROMATOGRAMA
Que informacin se obtiene del
cromatograma?

Adicin de la
muestra

Seal de detector

Lnea base
Pico
Anchura del pico
Tiempo de retencin (tR), (volumen
de elucin (Ve) )
Tiempo muerto (tM), (volumen
vaco (Vo) )

Lnea base

T i e m p o o volumen

FACTOR DE CAPACIDAD
Uno de los parmetros importantes en cromatografa es el FACTOR DE
CAPACIDAD O FACTOR DE RETENCIN, k , que es el tiempo adicional que
el analito toma para eluir de la columna, en relacin a un analito no
retenido o excluido, que no interacciona con la fase estacionaria y por
definicin, tiene un valor k de cero. Se utiliza para describir las
velocidades de migracin de los solutos en las columnas (a mayor valor de
k menor ser la velocidad de migracin del soluto).

El factor de capacidad se relaciona con el coeficiente de distribucin del analito:

Donde: M es cantidad (masa) del analito


V es el volumen del analito

FACTOR DE CAPACIDAD
El factor de capacidad para un analito, se incrementar cuando:
coeficiente de distribucin entre las dos fases se incremente
Volumen del analito en la fase estacionaria se incremente

Generalmente, el factor de capacidad, tiene valores entre 1 10


El factor de capacidad se usa para comparar el comportamiento
de un analito en diferentes sistemas cromatogrficos, ya que es
independiente de las dimensiones fsicas de la columna y de la
velocidad de flujo.

FACTOR DE SELECTIVIDAD
Otro parmetro importante es el factor de selectividad o factor de
separacin, que calcula las velocidades de migracin relativas para dos
analitos.
El factor de selectividad de una columna para 2 analitos se define como:

Donde:
KdA es el coeficiente de distribucin para el analito ms fuertemente retenido.
KdB es el coeficiente de distribucin para el analito menos retenido o que eluye
con ms rapidez.

siempre es mayor que la unidad


Esta influenciado por la naturaleza qumica de las fases estacionaria y
mvil. Ejem. se obtienen altas selectividades en cromatografa de
afinidad.

EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Se utilizan dos trminos para describir cuantitativamente la
eficiencia de una columna cromatogrfica:

2. El nmero de platos, N

Plato terico: zona de la


columna donde hay espacio
suficiente para que un analito se
equilibre completamente entre
las dos fases.

Los dos estn relacionados por la ecuacin:

N = L/ H

1. La altura del plato o plato terico, H

L es la longitud del relleno de la columna

LA EFICACIA DE LA COLUMNA AUMENTA CUANDO


AUMENTA EL NMERO DE PLATOS Y DISMINUYE LA
ALTURA DEL PLATO.

EFICACIA DE LA COLUMNA
Plato terico: zona de la columna donde hay espacio suficiente para
que un analito se equilibre completamente entre las dos fases.
Altura del plato terico: Longitud de la columna que contiene un
plato terico.
En general, se asume que las bandas cromatogrficas tienen una
forma gaussiana y la altura del plato se relaciona con el ancho del
pico del analito y la distancia que recorre el analito en la columna, L:
donde: 2 es la varianza
L

El ancho de la base W es igual a 4 .


Por lo tanto el valor de H puede
calcularse
del
cromatograma
midiendo el ancho del pico. El
nmero de platos tericos en la
columna esta dado por:

Introduccin de la
muestra

Donde: L es la longitud de la
columna

Si se considera que el ancho del pico en


su base, W, que se obtiene de dibujar
las tangentes de las dos partes del pico,
es igual a 4 , entonces:

Introduccin de la
muestra

Si L y W se miden en unidades de
tiempo, en lugar de unidades de
longitud, entonces:

Otro mtodo para evaluar N, se basa


en determinar W1/2, la anchura del
pico a la mitad de la altura mxima. El
nmero de platos tericos esta dado
por:
2

Seal de detector

Adicin de la
muestra

Lnea base

T i e m p o o volumen

RELACIN ENTRE EL NMERO DE PLATOS TERICOS Y LA FORMA DEL PICO DEL ANALITO

Concentracin relativa del soluto

LA MAYOR EFICACIA SE DA CUANDO


LOS PICOS SON MS ESTRECHOS.
N no tiene unidades y su valor puede
ser tan alto como 50,000 o ms/m
para columnas muy eficientes.
H puede ser tan pequeo como unos
pocos m.

Distribucin relativa en la columna

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO


DE BANDA
1) Velocidad de la fase mvil (u)
2) Coeficiente de difusin en la fase mvil (DM)
3) Coeficiente de difusin en la fase estacionaria (DE)
4) Factor de capacidad o factor de retencin (k)
5) Dimetro de la partcula del relleno cromatogrfico (dp)
6) Espesor del recubrimiento lquido en la fase estacionaria (df)

VARIABLES CINTICAS QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE


BANDA

ECUACIN DE van Deemter


H = A + B/u + C u
H = A + B/u + (CE + CM) u
donde: H
u
A
B
C

Altura del plato (cm)


velocidad lineal de la fase mvil (cm/s)
Coeficiente relacionado con caminos mltiples de flujo
Coeficiente relacionado con la difusin longitudinal
Coeficiente relacionado con la transferencia de masa entre las fases
CE relacionado con la fase estacionaria
CM relacionado con la fase mvil

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA

Velocidad de la fase mvil (u)


Efecto de la velocidad de flujo de la fase mvil sobre la altura del
plato
A menor H, mayor eficacia de la columna
Las velocidades de flujo son menores en C.
lquidos que en C. gases.

Las alturas del plato son por lo menos un


orden de magnitud menor en C. lquidos
que en C. gases.
Esta ventaja se contrarresta porque en C.
lquidos es poco prctico emplear columnas
> 50 cm, mientras que en C. gases, las
columnas pueden tener longitudes hasta de
50 m, en consecuencia, el nmero total de
platos y por lo tanto la eficacia de la
columna es mayor en C. gases

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA

TRMINO DEL CAMINO MLTIPLE (A)


Se observa ensanchamiento de banda debido a
las diferentes longitudes de los caminos.
Es directamente proporcional al dimetro de
las partculas que componen el relleno de la
columna

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA

TRMINO DE LA DIFUSIN LONGITUDINAL (B)


Se refiere a la difusin de los analitos desde la zona ms
concentrada en el centro de la banda hacia las regiones
ms diluidas por delante y detrs del centro de la banda
Con velocidades moderadas o altas no hay tiempo suficiente
para que se produzca el promediado por difusin.
.
Es directamente proporcional al coeficiente de difusin en la
fase mvil e inversamente proporcional a la velocidad de la
fase mvil.

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA

COEFICIENTES DE TRANSFERENCIA DE MASA


(CE y CM )
El efecto de la transferencia de masa sobre la altura del
plato es directamente proporcional a la velocidad de la
fase mvil.
Transferencia de masa en la fase mvil:
Es directamente proporcional al cuadrado del dimetro
(dp2) de la partcula del relleno y es inversamente
proporcional al coeficiente de difusin en la fase mvil
(DM) .

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA


Contribucin de los distintos coeficientes de transferencia de masa a la
altura del plato.

Resulta de la transferencia
de masa hacia y desde la FE

Se origina de la limitacin en
la velocidad de transferencia
de masa en la FM

Se asocia con la difusin


longitudinal

VARIABLES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA


Efecto del tamao de la partcula en la altura del plato

Los datos en mm, son


dimetros de partcula

Efecto del dimetro de la partcula: Generalmente se utilizan columnas estrechas

RESOLUCIN CROMATOGRFICA
Es una medida cuantitativa de la capacidad de la columna
para separar dos analitos.

La resolucin esta influenciada por la eficacia de la columna, el factor


de selectividad y el factor de capacidad, de acuerdo a la ecuacin:

Donde: k2 es el factor de capacidad para el pico ms fuertemente retenido


kpromedio es el promedio de los factores de capacidad para los 2 analitos

RESOLUCIN CROMATOGRFICA

Separaciones correspondientes a 3 resoluciones


distintas

RESOLUCIN CROMATOGRFICA

La resolucin se puede incrementar al incrementar el factor de


capacidad, aunque es a expensas del tiempo de elucin.

EFECTO DEL FACTOR DE CAPACIDAD (k) EN LA


RESOLUCIN CROMATOGRFICA

VARIACIN DE LA CONSTANTE DE
CAPACIDAD POR VARIACIN EN LA
COMPOSICIN DE LA FASE MVIL
DURANTE LA ELUCIN:
A) Elucin con gradiente
B) Programacin del disolvente

C) Incremento de temperatura (C.


gases)

ILUSTRACIN DEL PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCIN EN


CROMATOGRAFA

Tiempo

SOLUCIN DEL PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCIN EN


CROMATOGRAFA

Se puede mejorar la
resolucin:
aumentando el factor de
selectividad
a) Cambiar la composicin
de
la
fase
mvil,
incluyendo cambios de pH
b) Cambiar la temperatura
de la columna
c) Cambiar la naturaleza de
la fase estacionaria
d) Utilizar efectos qumicos
especiales