Facultad de Ciencias Básicas

Programa de Química

AISLAMIENTO DE ARN

DAYLI LILIANA RANGEL OROZCOa, BRYAN BELEÑO ACOSTAa &

JACKELINE SALGADO PALACIO

Docente. Carlos David Grande Tovar. Ph.D

a
Estudiantes del Programa de Química, Universidad del Atlántico.

Las técnicas de extracción del RNA son unas de las metodologías en conjunto con las técnicas
de extracción del DNA que han aportado un de los mayores avancen para el estudio de
enfermedades asociadas bien a virus, bacterias o mutaciones genéticas, es importante estudiar
las diferentes metodologías que se tienen hoy en día para la obtención de RNA se deben
llevar a cabo con suma precaución, de no ser así se puede desencadenar una contaminación
o la pérdida de la muestra. Estos parámetros fueron discutidos y se planteó una discusión en
base a las técnicas que se tienen hoy en día para extraer el RNA.
Palabras claves: RNA, Extracción, Metodologías, código genético, Trizol.

INTRODUCCIÓN En la sociedad, la extracción del DNA

permitió estudiar cómo estaba construido
El ácido ribonucleico o RNA por sus siglas
esta macromolécula y poder predecir y
en inglés, es la macromolécula que se
explicar enfermedades que se pueden o no
encuentra presente en toda forma de vida
presentar en los individuos [1]. La
(animales, bacterias, virus y otras). Se
extracción de RNA al igual que la
encuentra conformada por una hebra de
extracción de DNA se lleva a cabo a nivel
nucleótidos que están unidos mediante un
de las células que constituyen al
grupo fosfato a una pentosa, este tipo de
organismo a estudiar. Por ende, es
unión es conocida como enlace
importante que se tengan metodologías lo
fosfodiéster y permite la polimerización
suficientemente seguras para emplearla en
del ARN partiendo de los nucleótidos,
diversas investigaciones en biología
estos nucleótidos son característico gracias
molecular, por eso es que se ha buscado la
a que están constituidos por una base
manera en determinar cuál metodología
nitrogenada, que pueden ser adenina,
permite una extracción completa y más
citosina, urálico y guanina.
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optima de RNA[2], la metodología del MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivo de Trizol no solo ha permitido
Los materiales y reactivos que son
extraer RNA de muestras provenientes de
requerido para llevar a cabo la experiencia
plantas, sino también permite una óptima
son: Cloroformo, alcohol isopropílico,
extracción del RNA de una célula animal,
etanol al 75%, agua libre de RNasa o
bacteriana o viral[3]. Gracias a las
solución SDS al 0,5%.
diferentes metodologías para extracción de
RNA ha permitido que se logre estudiar el
RNA, ya sea el RNA codificante (cRNA)
o el RNA mensajero (mRNA). Esto
permite que técnicas tales como Northern
Blot den información acerca de la
composición del RNA y con ello una
identificación de los nucleótidos que
conforman al RNA. Las técnicas de
extracción de RNA sirven para hacer
seguimiento de mutaciones en los
organismos que están bajo estudio y con
ello poder entender las posibles causas de
las anomalías que se presenten, de igual
forma[3]–[5]. A día de hoy la extracción
de RNA cumple un rol importante en la
sociedad. Gracias al virus SARS-CoV-2
causante de la emergencia de salud pública
se han buscado metodologías tal que
permitan la detección de este virus
empleando como macromolécula base el
RNA de este virus presente en
pacientes[6], [7].
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PROCEDIMIENTO

1. Homogeneización.
Las células se lavaron con 1X PBS enfriado con hielo. Después, la monocapa se cubrió
con 1 ml de trizol y las células se lisan y homogeneizaron mediante pipeteo repetido.

2. Separación de fases. 2. El ARN permanece solo

Se incuban las muestras (5-15 min a 30°C), se añade en la fase acuosa. El
0,2 mL de cloroformo por 0,75 mL de trizol. Se volumen de la fase acuosa
agitan vigorosamente los tubos a mano (15 min) y se es aproximadamente el 70%
incuban (15-30°C durante 2 min). Luego las muestras del volumen de TRIzol
se centrifugan (15 min a 4°C). La fase acuosa se Reactivo LS utilizado para
transfiere a otros tubos. homogeneización

3. Precipitacion de
ARN.
Se precipita el ARN de
la fase acuosa al mezclar
3 μL de glucogeno 500
μL de alcohol
isopropilico.
La mezcla se centrifuga
(30 min de 2 - 8 °C).
5. Redisolución de
ARN.
4. Lavado de ARN.
El sedimento de ARN se Se seco el sedimento del
anterior paso, y el ARN
lava con etanol al 75%,
se disolvio en agua sin
añadiendo 900 μL por
ARNasa, pasando la
0,75 mL de trixol.
solución a través de la
Se centrifuga a 12000 punta de la pipeta unas
rpm durante 30 min a cuantas veces e
4°C.
incubando durante 10
minutos a 55 - 60ºC
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ANALISIS DE RESULTADOS
El ácido ribonucleico es sumamente
importante porque si bien el ADN contiene
la información genética, el que permite
que esta sea comprendida e interpretada
por las células es el ARN y juega un papel
fundamental en la realización de la síntesis
de proteínas [8].
El aislamiento del ARN intacto es esencial
para técnicas de biología molecular
empleadas en el análisis de la expresión
génica y para ellos existen diferentes
métodos los cuales permiten crear librerías
de ADNc, entre las más empleadas se
encuentran: Northern Blot, RT-PCR,
hibridación in situ, entre otras [9].
Se debe tener mucho cuidado puesto que
el ARN es una molécula muy lábil y es
fácilmente degradado por ARNasa y por
ello se debe evitar la contaminación
cruzada con estas enzimas, para realizar la
inactivación de las ribonucleasas se
emplea el agente dietilopirocarbonato
(DEPC) [10]
proteínas, pero al mismo tiempo se
encarga de mantener la integridad del
ARN en el proceso de homogenización
porque evita que actúen las enzimas
ARNasas [11].
Posteriormente se adiciona cloroformo a la
muestra que se utiliza para facilitar el
proceso de separar las fases con la ayuda
de centrifugación, una vez terminada la
centrifugación se puede observar que se
tiene una fase acuosa, una interfase y una
fase orgánica como se muestra en la figura
1, el ARN solo está presente en la fase
acuosa y es muy importante tener mucho
cuidado al retirar la fase de interés para no
generar contaminación o mezclarlas [12],[
13].

Para realizar la extracción del ARN se

emplea el TRIzol que contiene fenol y Figura 1. Separación de fases mediante el
tiocianato de guanidina, el cual es el empleo de cloroformo y centrifugación
responsable de la lisis de la membrana [9].
celular, puesto que es un agente cao
trópico responsable de la
desnaturalización de las macromoléculas y
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Una vez obtenida la fase acuosa y separada mayor claridad de esta metodología y
de las otras se adiciona glucógeno y comprender mejor la importancia de cada
alcohol isopropílico y con ayuda de la etapa.
centrifugación se produce la precipitación
del ARN en un pellet o sedimento similar
a una pastilla como se observa en la figura
2, el sobrenadante debe ser desechado con
cuidado de no botar también el pellet [11],
[12].

Figura 2. Formación del pellet en la fase

acuosa utilizando alcohol isopropílico [9].

El sedimento resultante se lavó con etanol Figura 3. Protocolo del método de

al 75% para eliminar las impurezas
haciendo los lavados por centrifugación,
posteriormente se seca el pellet donde se
tiene el ARN puro y libre de
contaminantes, por esa razón es muy
importante ser muy rigurosos al momento
de realizar cada uno de los pasos. Luego
este ARN puro se disolvió utilizando agua
libre de ARNasas, que es agua desionizada
libre de enzimas ribonucleasas y de
calidad comprobada [11], [13]
Este procedimiento se muestra ilustrado
paso a paso en la figura 3 para tener una
aislamiento y extracción del ARN
empleando el TRIzol [13].
La obtención de ARN puro y libre de
impurezas no siempre es un proceso
sencillo debido a la presencia de
contaminantes tanto exógenos como
endógenos y de la baja estabilidad que
presenta esta molécula, pero el aislamiento
del ARN es sumamente valioso para el
desarrollo de técnicas moleculares y es por
eso que este debe ser altamente puro o de
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calidad puesto que la presencia de 2006, doi: 10.1038/nprot.2006.143.

contaminantes puede incidir
negativamente al momento de realizar la
amplificación de los ácidos nucleicos [14].
CONCLUSIÓN
El ARN brinda información crucial a la
hora de entender la expresión génica y es
ampliamente utilizado, por esta razón es
sumamente importante realizar con
minucioso cuidado el proceso de
aislamiento y extracción de este de no
generar ningún tipo de contaminación
cruzada puesto que podría comprometer
seriamente los resultados obtenidos de
procedimientos que se realizan después de
la extracción, los cuales requieren una
intensa labor, gasto de tiempo adicional y
un incremento en los costos.
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