UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN

UNIDAD DE INVESTIGACIN MULTIDISCIPLINARIA
LABORATORIO DE DETECCIN DE ENFERMEDADES Y MUTACIONES
MITOCONDRIALES






PROTOCOLO DE EXTRACCION DE RNA DE TEJIDOS










INTRODUCCION
La extraccin de mARN slo puede realizarse de aquellos tejidos que expresan el
gen de inters. El procedimiento de extraccin de ARN total, requiere los mismos
pasos que la purificacin de ADN, con la diferencia de que se utiliza en la lisis
celular, algn agente que inactive las RNAsas propias de la clula lisada (EDTA,
tiocianato de guanidina, urea, 2-mercaptoetanol). El resultado de estos procesos
es la obtencin de ARN total, del que ms del 90% corresponde a ARN
ribosmico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) que no codifican protenas, y
solo el 5% es ARN mensajero (ARNm), que se ha transcrito de los genes que
codifican proteinasa. Para la purificacin del ARN mensajero, se suele aprovechar
la presencia de la cola poli-A (regin rica en adenina del extremo 3 del ARNm
maduro) realizndose cromatografa en columnas con resinas ligadas a residuos
poli-T a las que se unirn las molculas de ARNm. Como en el caso anterior,
existen productos comercializados para facilitar la extraccin de ARN.
La toma de muestras y su buen acondicionamiento para remitirlas al laboratorio,
son pasos esenciales para la obtencin de material adecuado para la
determinacin de las secuencias genticas. En este sentido, debemos recordar
que nuestro material de partida para la prueba, el RNA, es altamente sensible a
la degradacin por enzimas (RNAsas). Debido a la presencia universal de estas
enzimas, tanto en materiales biolgicos como en el ambiente en general,
presentamos algunas consideraciones que tienen como objetivo principal
orientar hacia procedimientos de laboratorio que minimizan la accin de las
RNasas presentes en los tejidos o fluidos animales y evitar la introduccin de
RNasas externas. Las RNasas, son enzimas capaces de degradar completamente
el RNA, son extremamente resistentes al tratamiento con diversos agentes fsicos y
qumicos, y estn universalmente presentes en la piel, cabello, pelo y aerosoles
(respiracin) del operador. La extraccin del RNA viral puede hacerse a partir de
diferentes tipos de muestra: epitelio, lquido vesicular, raspado esofgico-farngeo
secreciones nasales, cultivos de clulas, entre otros. Idealmente, se recomienda
inactivar el material biolgico en el mismo momento de la toma de muestra,
mediante la adicin del reactivo TRIZOL. Este reactivo es un producto qumico
preparado a base de fenol y tiocianato de guanidina. Este agente es altamente
txico y corrosivo, por lo cual se recomienda seguir cuidadosamente las
instrucciones del fabricante, para su manipulacin (esencialmente, usar guantes,
evitar la inhalacin de vapores del qumico y el contacto con la piel).
El trizol es un reactivo listo para utilizarse en el aislamiento de RNA de clulas y
tejidos, es una solucin mono-fsica de fenol e isocianato de guanidina que
durante la homogenizacin o lisis de la muestra mantiene la integridad del RNA, al
mismo tiempo que altera la estabilidad de las clulas y disuelve los componentes
celulares. Ha demostrado estabilidad hasta por 12 meses a temperatura
ambiente sin embargo se recomienda almacenarlo a temperatura de 2-8c para
un ptimo rendimiento.
Obtener Muestra de
Tejido en tubo eppendorf
De 50 a 100 mg
Agregar trizol
De 0.500 a 1 ml
Homogeneizar muestra en
homogeneizador electrico
En hielo para mantener las
condiciones de Temperatura
bajas y evitar degradar el RNA.
Incubar
5 min a T ambiente
Agregar Cloroformo
200 uL, agitar vigorosamente
durante 15 segundos
Incubar
durante 5 min a T ambiente
Centrifugar
A 12000 RPM, durante 15 min,
separar fase acuosa.
Agregar isopropanol
500 uL, mezclar por inversion
Incubar
10 min a T ambiente.
Centrifugar
12000 RPM por 10 min a 4C,
decantar sobrenadante
Agregar Etanol al 75%
1 ml.
Lavar pastilla con un solo
golpe en vortex.
Centrifugar
7500 RPM, durante 5 min a 4C.
Decantar sobrenadante y
dejar secar al aire 5 min.
Resuspender pastilla de
RNA total en 20-50uL de
H2O grado biologa
molecular.
La adicin de cloroformo seguida de centrifugacin separa la muestra en dos
fases, una de ellas acuosa y la otra orgnica, el RNA permanece exclusivamente
en la fase acuosa y puede ser recuperado por precipitacin con alcohol
isoproplico, una vez removida la fase acuosa el ADN y las protenas en la muestra
pueden ser recuperadas por precipitaciones secuenciales de la misma.

METODOLOGIA